陳雪婷，張建軍，徐文杰，馮健英，李智勇

［廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院）/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東 廣州 510095］

升陽化濁降糖方系依據(jù)張仲景《傷寒雜病論》中理中湯、吳茱萸湯加減而成，為我院經(jīng)驗方，應(yīng)用多年，方中附子[1?3]、干姜[4]、吳茱萸[5?6]溫補脾、腎、肝三陰，復(fù)全身陽氣的運化、樞轉(zhuǎn)及自生之本，淫羊藿[7]、山萸肉[8]、白芍[9]補陰斂陽，黃芪[10]健脾胃化濁濕而厚陽，甘草補中，諸藥合用，共奏溫復(fù)三陰、散寒化濁之功。

本研究建立了HPLC 同時測定方中莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、甘草苷、甘草酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、吳茱萸堿、吳茱萸次堿9 種成分質(zhì)量濃度的方法，并以9 種成分的質(zhì)量濃度和固形物質(zhì)量的綜合評分為評價指標，對加水量、提取時間及提取次數(shù)進行考察，對升陽化濁降糖方的提取工藝進行優(yōu)選，以期為該制劑的后續(xù)研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Arc 型高效液相色譜儀，配2998 型PDA檢測器、自動進樣器、四元泵、在線脫氣機（美國沃特世公司）；Genie G 5超純水系統(tǒng)（上海樂楓生物科技有限公司）；FA224 TC 電子分析天平（上海力辰儀器科技有限公司）；KQ3200 DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

馬錢苷（批號：11640-201808）、芍藥苷（批號：110736-201741）、甘草苷（批號：111610-201607）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號：111920-201907）、淫羊藿苷（批號：110739-201516）、吳茱萸堿（批號：110802-200606）購自中國食品藥品生物檢定所；吳茱萸次堿（批號：MUST-13050509）、莫諾苷（批號：RDDMO271908031）、甘草酸（批號：G-004-171219）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；附子、干姜等飲片均購自廣州采芝林藥業(yè)有限公司；甲醇、乙腈、四氫呋喃為色譜純（德國默克公司）；磷酸、甲酸等其余試劑為分析純（廣州化學(xué)試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 各成分質(zhì)量濃度測定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters Xbridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，7%A～17%A；20～30 min，17%A～27%A；30～40 min，27%A～37%A；40～60 min，37%A～67%A）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：215 nm（吳茱萸堿、吳茱萸次堿），235 nm（莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、甘草苷、甘草酸），265 nm（毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷）。

2.1.2 溶液的制備

2.1.2.1 對照品儲備溶液的制備 取莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、甘草苷、甘草酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、吳茱萸堿、吳茱萸次堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為121.89、89.424、172.385、9.636、36.782、26.856、20.800、7.077、3.478μg/mL的對照品儲備溶液。

2.1.2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密量取“2.1.1”項下各對照品儲備溶液1 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，備用。

2.1.2.3 供試品溶液的制備 精密吸取各正交溶液5 mL 置具塞錐形瓶中，加入甲醇溶液20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，加甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2.4 陰性對照溶液的制備 分別配制缺山萸肉、白芍、黃芪、甘草、淫羊藿、吳茱萸的陰性提取液，再按“2.1.2.3”項下方法制備各陰性對照溶液，備用。

2.1.3 專屬性試驗 取混合對照品溶液、各陰性對照溶液及供試品溶液，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖見圖1。結(jié)果顯示，在莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、甘草苷、甘草酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、吳茱萸堿、吳茱萸次堿對照品相應(yīng)保留時間位置，各陰性對照溶液均無吸收峰。

圖1 專屬性試驗HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of specific tests

2.1.4 線性關(guān)系考察 取“2.1.2.2”項下混合對照品溶液2、4、6、8、10 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇溶液至刻度，配置成系列質(zhì)量濃度對照品溶液，進樣10μL，記錄峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標、質(zhì)量濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Table 1 Linear relationship inspection results

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.4”項下混合對照品溶液（質(zhì)量濃度3），連續(xù)進樣6 次，結(jié)果莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、甘草苷、甘草酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、吳茱萸堿、吳茱萸次堿峰面積RSD 分別為0.23%、0.17%、0.22%、0.30%、0.25%、0.36%、0.39%、0.41%、0.30%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取正交提取液（正交試驗5），按“2.1.2.3”項下方法制備供試品溶液，并于制備后的0、1、2、4、8、12 h 分別進樣，結(jié)果莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、甘草苷、甘草酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、吳茱萸堿、吳茱萸次堿峰面積RSD 分別為1.23%、1.10%、1.05%、0.89%、1.36%、1.39%、1.42%、1.52%、1.59%，表明供試品于室溫下放置12 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 取同一正交提取液（正交試驗5）6份，分別按“2.1.2.3”項下方法制備供試品溶液并測定峰面積，結(jié)果莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、甘草苷、甘草酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、吳茱萸堿、吳茱萸次堿峰面積RSD 分別為1.47%、1.50%、1.15%、1.37%、1.89%、1.26%、1.29%、1.40%、1.53%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密吸取已知含量的提取液（正交試驗5）6份，分別精密加入單個對照品儲備溶液適量，制備供試品溶液后測定峰面積，計算加樣回收率。結(jié)果莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、甘草苷、甘草酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的平均回收率分別為98.47%、96.52%、97.55%、96.78%、98.40%、97.33%、97.21%、97.52%、98.14%，RSD 分別為1.74%、1.89%、1.56%、2.00%、1.92%、1.83%、1.77%、1.86%、1.95%，表明方法準確性良好。

2.2 正交試驗

采用L9（34）正交設(shè)計方法，對提取次數(shù)（A）、提取時間（B）及加水量（C）進行優(yōu)選，見表2。按處方比例稱取附子、干姜、吳茱萸等八味飲片105 g，共9份，按正交試驗安排的方法提取，合并煎液，濾過，濾液濃縮并定容至100 mL。

表2 因素水平表Table 2 Factors and levels table

2.2.1 固形物質(zhì)量的測定 精密量取各正交提取液25 mL，置已干燥恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，照2020年版《中國藥典》四部通則“0831 干燥失重測定法”測定，計算固形物質(zhì)量。

2.2.2 正交試驗結(jié)果 設(shè)定莫諾苷（MNG）、馬錢苷（MQG）、芍藥苷（SYG）、甘草苷（GCG）、甘草酸（GCS）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（MRYHTPTTG）、淫羊藿苷（YYHG）、吳茱萸堿（WZYJ）、吳茱萸次堿（WZYCJ）質(zhì)量分數(shù)及固形物質(zhì)量的加權(quán)系數(shù)均為0.1。正交試驗結(jié)果見表3所示?？梢?，因素A（提取次數(shù)）對試驗結(jié)果影響最大，其次是加水量，最后是提取時間。表4正交分析結(jié)果顯示，3個因素的影響均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），考慮到生產(chǎn)的經(jīng)濟和時間成本，最終確定工藝為提取3 次，每次1 h，第1 次加入10倍量水，第2、3次加入8倍量水煎煮。

表3 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design and results

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of Variance Results

2.3 工藝驗證試驗

按處方比例稱取飲片，共3批，按優(yōu)化的工藝提取并制備供試品溶液，測定指標成分含量，結(jié)果見表5?？梢?，優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。

表5 驗證試驗結(jié)果Table 5 Validation Test Results

3 討論

升陽化濁降糖方由8 味飲片組成，本試驗確定了山萸肉、白芍、甘草、黃芪、淫羊藿及吳茱萸6味飲片中的9 種成分為評價指標，參考《中國藥典》2020年版一部各味飲片含量測定方法發(fā)現(xiàn)，不同成分的檢測波長差異較大，為提高結(jié)果的準確率，本試驗分別在210 nm 下對吳茱萸堿、吳茱萸次堿；235 nm下對莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、甘草苷、甘草酸；265 nm 下對毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷進行檢測。

本方在我院臨床應(yīng)用多年，療效顯著，為更好地滿足現(xiàn)代人的用藥需求，擬將其開發(fā)為醫(yī)療機構(gòu)中藥制劑。查閱文獻可知，莫諾苷、馬錢苷為山萸肉的主要活性成分，莫諾苷可顯著降低高糖所致的糖尿病腎病小鼠模型中甘油三酯及腎臟血脂血糖水平[11]。安淑靜等[12]在胰腺β細胞的PI3K/Akt 信號通路中發(fā)現(xiàn)馬錢苷通過抑制FOXO1 核異位發(fā)揮降糖功效；芍藥苷能夠改善葡萄糖耐受能力及減輕肝組織病理性改變，對T2DM 大鼠糖脂代謝紊亂起到調(diào)節(jié)的作用，是白芍的主要有效成分[13]；程麗娜等[14]發(fā)現(xiàn)甘草酸、甘草苷可以改善胰島素抵抗，調(diào)節(jié)脂肪酸合成從而發(fā)揮降糖作用；毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃芪中最具活性的成分之一，可以明顯提高脂肪細胞的葡萄糖消耗量，降低TG 含量[15]；淫羊藿苷通過激活mTOR/Akt/CREB 通路促進高糖誘導(dǎo)的足細胞自噬抑制細胞凋亡[16]；吳茱萸堿、吳茱萸次堿均為吳茱萸的活性成分，吳茱萸堿具有抗炎、抗腫瘤、抗肥胖和抗性血管等多種藥理活性[17]，而吳茱萸次堿可以有效阻止高糖誘發(fā)的足細胞受損，以及細胞炎癥、焦亡反應(yīng)[18]。本文主要對其提取工藝參數(shù)進行篩選，考慮復(fù)方中藥制劑起效成分多樣，因此選擇多個評價指標[19]，可以使得篩選結(jié)果更為科學(xué)合理。

本文建立了HPLC法同時測定莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、甘草苷、甘草酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、吳茱萸堿、吳茱萸次堿質(zhì)量濃度的方法，并以9種成分的質(zhì)量濃度及固形物質(zhì)量為提取工藝的評價依據(jù)，得到優(yōu)化的提取參數(shù)，即提取3 次，每次1 h，第1 次加入10 倍量水，第2、3 次加入8 倍量水。經(jīng)過驗證證明，優(yōu)選的工藝重復(fù)性良好，為該制劑后續(xù)的開發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)。