錢婷婷 王 緒 嚴雪冰 王成海

1 揚州大學醫(yī)學院病理學教研室,江蘇省揚州市 225009; 2 江蘇省太倉市中醫(yī)醫(yī)院病理科

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤,嚴重威脅女性的健康。引起宮頸癌預后不良的因素較多,主要因素是腫瘤的廣泛轉(zhuǎn)移和復發(fā)[1]。而宮頸鱗狀細胞癌(Cervical squamous cell carcinoma,CSCC)是宮頸癌中最常見的病理類型。因此,有必要探究CSCC惡化進展的潛在機制,尋找治療CSCC的新靶點。

環(huán)狀RNA(circualar-RNA,circRNA)是一種閉環(huán)型非編碼RNA分子,對microRNA(miRNA、miR)具有調(diào)節(jié)作用[2]。因其閉環(huán)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定表達的特點而有明顯的優(yōu)勢,可作為開發(fā)CSCC的新臨床診斷標志物。miRNA是一類由內(nèi)源性單鏈非編碼RNA,長度約為22個核苷酸[3]。CircRNA主要通過競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA)機制發(fā)揮作用,即作為miRNA的“分子海綿”,與miRNA競爭性結(jié)合,從而減少游離miRNA對下游靶基因轉(zhuǎn)錄的干擾,達到調(diào)節(jié)基因表達的目的[4]。研究表明許多癌癥中circRNA的異常表達,與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[5-7]。Huang等[8]通過人類circRNA表達譜測序分析了CSCC和配對癌旁宮頸組織的circRNA表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)并驗證了hsa_cir_0000745、hsa_ccirc_0084927、hsa_2circ_0002762、hsa_circ_0075341、hsa_circ_0007905 在CSCC中表達水平升高,但文中并沒有對hsa_circ_0007905的作用進行相關(guān)研究。因此本文通過進一步研究hsa_circ_0007905在CSCC組織中的表達情況、臨床意義及對生長的影響,為CSCC的臨床診斷和治療提供潛在的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 資料和樣本 選取2020年1月—2022年12月在揚州大學附屬醫(yī)院和太倉市中醫(yī)醫(yī)院接受宮頸癌手術(shù)切除的71例患者為研究對象,年齡38～65歲,中位年齡54歲。納入標準:(1)臨床資料、病理資料無缺失者;(2)經(jīng)病理確診為宮頸鱗狀細胞癌患者;(3)術(shù)前未接受放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療者;(4)對本研究知情同意者。排除標準:(1)合并其他部位惡性腫瘤者;(2)合并有腦轉(zhuǎn)移者;(3)心、肝、腎功能不全者;(4)自身免疫性疾病、感染性疾病患者。收集71例配對的CSCC組織和鄰近正常組織及相關(guān)病理資料。本實驗經(jīng)揚州大學醫(yī)學院倫理委員會批準,且患者簽署知情同意書。

1.2 質(zhì)粒和細胞 hsa_circ_0007905 mimic(模擬物)和si-circ_0007905(抑制物)質(zhì)粒合成于湖南豐暉生物科技有限公司。宮頸癌的兩個細胞株HeLa細胞、C33A細胞和人正常子宮頸上皮細胞HcerEpic均購買于中國科學院上海細胞生物庫。上述所有細胞均在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(HyClone 公司)里孵育,培養(yǎng)基中添加1%的青霉素—鏈霉素(Invitrogen公司)。通過Lipofectamine 2000細胞轉(zhuǎn)染試劑盒將hsa_circ_0007905 mimic和si-circ_0007905質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至宮頸癌細胞株,并將細胞置于37℃、5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 實時熒光定量PCR實驗 首先通過 Trizol法提取CSCC組織總RNA,檢測RNA濃度;然后進行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成,反應體系:總RNA 1μg+mRQ Buffer(2×) 5μl+mRQ Enzyme 1.25μl+無酶水補至10μl,PCR儀擴增獲得cDNA產(chǎn)物。qRT-PCR實驗通過Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行操作,反應體系:SYBR預混料Ex Taq Ⅱ 10μl+ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4μl+上游引物(10mmol/L) 0.4μl+下游引物(10mmol/L) 0.4μl+ CDNA模板1.6μl+DEPC水7.2μl,合計20μl。在Applied Biosystems 7500 R-T PCR system進行qRT-PCR實驗:(1)預變性:94℃ 5min。(2)PCR反應:重復:94℃ 30s至55℃ 30s至70℃ 30s,共40個循環(huán),94℃ 1min 至 55℃ 30s至95℃ 30s。引物序列如下所示:hsa_circ_0007905上游:5’-GGTGCTGAAGAACATGTCCC-3’,hsa_circ_0007905下游:GCTAATGCCTGCACAGATGA;GAPDH上游:5’-ACCTGGACCTGGACCTGGACT-3’, GAPDH下游:5’-ACCTGGACCTGGACCTGGGAT-3’。

1.4 CCK-8細胞增殖活性實驗 將宮頸癌細胞懸浮于96孔板的孔洞里,每個孔洞加入5×103個細胞,實驗設(shè)置3個復孔。將宮頸癌細胞置入5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱里中培養(yǎng),直至細胞鋪滿整個孔底。每個孔中加入CCK-8溶液10μl并與細胞混勻,然后放置細胞培養(yǎng)箱中孵育4h。使用酶標儀于450nm處檢測光密度(OD)值,分析過表達或敲低hsa_circ_0007905表達對宮頸細胞增殖活性的影響。

1.5 裸鼠皮下移植瘤模型 實驗組(30只)和對照組(30只)的BALB/C-nu/nu裸鼠來源于揚州大學動物實驗中心。裸鼠為8周齡,重量23～27g,飼養(yǎng)在SPF級動物培養(yǎng)箱里。在第4天后于裸鼠右側(cè)腋腹壁的皮下接種宮頸癌細胞5×106個細胞左右。接種后每天監(jiān)測裸鼠生活狀態(tài)及其皮下瘤組織的生長情況。50d后迅速拉頸處死裸鼠,完整剝離瘤體,對腫瘤體積大小和重量進行測量,并給予拍照。移植瘤做相關(guān)實驗。動物實驗已獲得揚州大學動物實驗倫理委員會批準。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌中hsa_circ_0007905的表達 在71對CSCC和癌旁正常組織以及宮頸癌細胞(HeLa、C33A)和人正常子宮頸上皮細胞HcerEpic 通過qRT-PCR檢測了hsa_circ_0007905的表達情況,結(jié)果如圖1所示,hsa_circ_0007905在71例CSCC組織的表達水平(3.437±0.173)較癌旁正常組織(1.502±0.065)明顯更高(t=10.48,P=0.000 1<0.05);hsa_circ_0007905在宮頸癌細胞HeLa(4.533±0.546)、C33A(6.333±0.291)的表達水平較人正常子宮頸上皮細胞HcerEpic(1.600±0.173)明顯更高(t=5.124、13.99,P<0.05)。

圖1 qRT-PCR檢測宮頸癌中hsa_circ_0007905的表達水平

2.2 CSCC中hsa_circ_0007905的表達及其臨床病理意義 首先將病例按hsa_circ_0007905表達水平高低分為兩組:高表達組(表達水平高于對照組)和低表達組(表達水平≤對照組)。實驗結(jié)果如表1所示,高表達組例數(shù)為56例,低表達組例數(shù)為15例。通過統(tǒng)計得出hsa_circ_0007905的表達與CSCC的腫瘤大小和分化程度密切相關(guān) (P均<0.05),即表達水平越高,腫瘤越大而且分化程度越低,惡性程度越高;而與患者年齡、HPV感染、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期之間無相關(guān)性(P均>0.05)。這一結(jié)果提示高表達的hsa_circ_0007905參與了CSCC細胞的生長和分化過程。

表1 CSCC組織中hsa_circ_0007905的表達及其意義

2.3 hsa_circ_0007905增強宮頸癌細胞的增殖活性 上述實驗提示hsa_circ_0007905與CSCC的腫瘤大小密切相關(guān),因此我們進一步通過CCK-8實驗研究hsa_circ_0007905對宮頸癌細胞C33A增殖活性的影響。實驗結(jié)果如表2、圖2所示,過表達hsa_circ_0007905促進了宮頸癌C33A細胞的增殖活性,而降低hsa_circ_0007905表達則抑制了C33A細胞的增殖活性,兩組間差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

表2 hsa_circ_0007905對C33A增殖活性的影響

圖2 CCK8實驗檢測 hsa_circ_0007905對C33A增殖活性的影響

2.4 hsa_circ_0007905對裸鼠皮下移植瘤生長的影響 為了進一步研究hsa_circ_0007905在宮頸癌生長增殖中的作用,筆者建立了裸鼠皮下移植瘤模型。因hsa_circ_0007905在CSCC組織中呈現(xiàn)高表達水平,故本次實驗檢測降低hsa_circ_0007905表達對荷瘤的影響。通過裸鼠皮下注射降低hsa_circ_0007905表達的C33A細胞,實驗結(jié)果如圖3所示,敲低組的腫瘤體積和重量明顯小于對照組,兩組差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。該結(jié)果進一步表明hsa_circ_0007905可明顯促進宮頸癌的增殖和生長。

圖3 降低hsa_circ_0007905表達對皮下移植瘤生長的影響

3 討論

子宮頸癌是來源于宮頸鱗柱交界處的鱗狀細胞及柱狀細胞的惡性腫瘤。宮頸癌好發(fā)于中老年女性患者,近年來宮頸癌發(fā)病有年輕化的趨勢。在中國,宮頸癌的死亡率占女性惡性腫瘤的第二位,也占全部癌癥死亡率的第四位[9-10]。近年來,隨著早癌篩查中宮頸細胞學檢測的開展,宮頸的早期病變能被早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療,但CSCC患者預后仍然不佳,主要原因是CSCC具體發(fā)生發(fā)展的分子機制還未被徹底闡明,因此尋找CSCC的診治靶點以及研究其發(fā)生發(fā)展機理變得尤為重要。

circRNA是一種單鏈共價封閉的非編碼RNA,由前體信使核糖核酸通過非經(jīng)典剪接產(chǎn)生,并在生物物種中廣泛表達[11]。circRNAs可能作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑、miRNA海綿或蛋白誘餌在癌癥進展中發(fā)揮作用[12-13]。近年來諸多的證據(jù)表明circRNAs參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程,既有促進宮頸癌的circRNAs,又有抑制宮頸癌的circRNAs;例如,circCCDC134在細胞核中募集p65,并作為miR-503-5p海綿調(diào)節(jié)細胞質(zhì)中MYB的表達,最終刺激HIF1A轉(zhuǎn)錄,促進宮頸癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移[14]。circRNA_101996在宮頸癌中過度表達,上調(diào)的circRNA_101996顯著促進宮頸癌的細胞增殖、細胞周期進展和細胞遷移,機制上circRNA_101996通過與miR-1236-3p結(jié)合并降低其表達,從而通過miR-1236-3p/TRIM37軸加速了宮頸癌癥的發(fā)展,為宮頸癌的診斷和治療提供了新的見解[15]。circRNA_0000285在宮頸癌組織中的表達水平顯著高于鄰近正常組織。此外,敲除circRNA_0000285后宮頸癌細胞的生長和遷移能力受到顯著抑制。FUS的表達水平與circRNA_0000285在宮頸癌組織中的表達呈正相關(guān)circRNA_0000285通過促進FUS的表達而發(fā)揮促癌作用[16]。circLMO1水平在宮頸癌癥組織中下調(diào),并與FIGO分期相關(guān)。在功能上circLMO3的缺失則促進了子宮頸癌癥細胞的增殖和侵襲。從機制上,circLMO1通過吸收miR-4192來抑制靶基因ACSL4,從而作為競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA)發(fā)揮作用,有望成為宮頸癌癥臨床治療的生物標志物[17]。circRNA_101308在宮頸癌組織中顯著下調(diào)并作為腫瘤抑制因子[18],過表達circRNA_101308能抑制宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移。在宮頸癌細胞中發(fā)現(xiàn)MiR-26a-5p、MiR-196a-5p,MiR-196b-5p、MiR-335-3p和MiR-1307-3p被circRNA_101308吸收,此研究為宮頸癌的臨床治療提供了新的方向。circ_VPRBP在宮頸癌癥組織和細胞中表達下調(diào),且過度表達circ_VRRBP抑制Caski和C33A細胞的增殖并促進其凋亡。circ_VPRBP通過調(diào)控miR-93-5p/FRMD6軸抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲,促進細胞凋亡[19]。

Huang等[8]通過人類circRNA表達譜測序分析了CSCC和配對癌旁宮頸組織的circRNA表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)hsa_cir_0000745、hsa_ccirc_0084927、hsa_2circ_0002762、hsa_circ_0075341、hsa_circ_0007905 在CSCC中表達水平升高,但本研究并未對hsa_circ_0007905的作用進行相關(guān)研究。本研究通過在82例CSCC中進行了qRT-PCR實驗證實了hsa_circ_0007905表達水平升高,初步說明了hsa_circ_0007905作為circRNA的一員,在CSCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。

hsa_circ_0007905定位于1號染色體180953812-180962561基因區(qū)間,共391個核苷酸,又名circSTX6。目前除了Huang等[8]的研究,文獻中也發(fā)現(xiàn)一篇關(guān)于hsa_circ_0007905的研究,在胰腺導管上皮癌中circSTX6表達水平上調(diào),通過吸收miR-449b-5p來調(diào)節(jié)非肌肉肌球蛋白重鏈9(MYH9)的表達促進了腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[20]。本文研究同樣發(fā)現(xiàn)在CSCC中表達水平上調(diào),進一步說明了hsa_circ_0007905在癌癥中發(fā)揮促癌基因的作用。在分析hsa_circ_0007905表達與CSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系發(fā)現(xiàn),hsa_circ_0007905的表達與CSCC的腫瘤大小和分化程度密切相關(guān),而與患者年齡、HPV感染、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期之間無相關(guān)性(P均>0.05)。表明高表達的hsa_circ_0007905參與了宮頸癌細胞的生長和分化過程,hsa_circ_0007905表達水平越高,腫瘤就越大而且分化程度越低,惡性程度越高,最終能影響CSCC的進展和預后。TNM分期中的T代表原發(fā)腫瘤的大小和浸潤深度,但本研究結(jié)果顯示hsa_circ_0007905表達與CSCC的TNM分期無關(guān),可能是因為本研究劃分的腫瘤直徑大小與TNM分期原發(fā)腫瘤大小不一致且本研究標本數(shù)量偏少有關(guān)。

進一步功能性研究發(fā)現(xiàn)過表達hsa_circ_0007905后,細胞的增殖活性升高;降低hsa_circ_0007905表達后,細胞的增殖活性下降,再次提示hsa_circ_0007905促進CSCC細胞的增殖活性,參與了CSCC細胞的生長過程。在裸鼠體內(nèi)移植瘤實驗中,敲低hsa_circ_0007905表達后腫瘤生長緩慢,體積較小,瘤體重量也較輕。該實驗結(jié)果同樣驗證了hsa_circ_0007905能促進CSCC細胞的增殖和生長。

綜上所述,hsa_circ_0007905在CSCC組織中表達水平上調(diào),與腫瘤的分化程度和大小密切相關(guān);hsa_circ_0007905是一個新的促進宮頸癌細胞的生長增殖的癌基因,本研究為未來靶向治療CSCC提供有力的實驗依據(jù)。