孫楠，張超，王標(biāo)，張沁雨，張淑惠，趙敬杰

1 山東大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，濟(jì)南 250033；2 青島市市立醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部；3 北京大學(xué)人民醫(yī)院青島醫(yī)院檢驗(yàn)科；4 山東中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院

酒精性肝病是導(dǎo)致慢性肝病的重要原因，腸道屏障損傷和腸道菌群失調(diào)是其重要的發(fā)病機(jī)制［1］。腸上皮細(xì)胞通過緊密連接蛋白緊密結(jié)合在一起，其上覆蓋黏液，定植著腸道菌群，與固有層免疫細(xì)胞共同形成腸道屏障。飲酒后，腸道菌群與宿主正常的共生關(guān)系被破壞，菌群多樣性降低，菌群種屬和數(shù)量發(fā)生不同程度改變，腸上皮緊密連接的完整性被破壞，腸道通透性增加［2］。影響腸道屏障和腸道微生物群落組成的因素有很多，如飲食習(xí)慣、宿主遺傳因素［3］。而酗酒者的腸道屏障損傷和腸道菌群改變各有不同，表明宿主遺傳因素在酒精性腸道損傷中起到至關(guān)重要的作用。長鏈非編碼RNA及其亞型基因間長鏈非編碼RNA（lincRNA）是長度大于200個堿基的非編碼RNA，能夠在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。lincRNA-p21是目前研究較多的一種lincRNA，可參與多種重要的生物學(xué)過程。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝病患者血清lincRNA-p21 水平升高［4］。但lincRNA-p21 對酒精所致腸道屏障損傷和腸道菌群失調(diào)的影響尚不清楚。2018年1月—2022年12月，本研究探討了lincRNA-p21在酒精性腸道損傷中的作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性C57BL/6Cnc 小鼠15 只，SPF 級，6周齡，體質(zhì)量（18 ± 2）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。雄性CRISPR/Cas9 技術(shù)Trp53cor1 基因敲除C57BL/6 小鼠（lincRNA-p21-/-）5 只，SPF 級，11 周齡，體質(zhì)量（24 ± 2）g，由賽業(yè)生物科技有限公司構(gòu)建。所有小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5 只，自由攝食和飲水，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（21 ± 2）℃、相對濕度（50 ± 10）%、光照12 h/12 h 明暗交替。研究設(shè)計(jì)與實(shí)施過程符合動物福利和倫理原則，并經(jīng)山東大學(xué)第二醫(yī)院動物研究倫理委員會批準(zhǔn)。

lincRNA-p21-over-AAV8-U6-GFP 病毒及其對照（control-AAV8-U6-GFP）病毒，購自美國Vigene Biosciences 公司。引物序列由廣州銳博生物技術(shù)有限公司和濟(jì)南博尚生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。CFX-96 實(shí)時定量PCR 儀，購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；超薄切片機(jī)，購自德國Leica公司；Pannoramic 250 數(shù)字切片掃描儀，購自匈牙利3DHISTECH 公司。Prime ScriptTMRT Reagent Kit 和SYBR Premix Ex TaqTMReagent Kit，購自寶生物工程（大連）有限公司?？笹FP 抗體、抗claudin-1 抗體和抗ZO-1抗體，購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 動物模型構(gòu)建 將15 只C57BL/6Cnc 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機(jī)取10 只，隨機(jī)分為lincRNA-p21過表達(dá)組和對照組各5 只，分別于尾靜脈注射lincRNA-p21-over-AAV8-U6-GFP病毒、control-AAV8-U6-GFP 病毒。以Trp53cor1 基因敲除C57BL/6 小鼠（lincRNA-p21-/-）為突變組，以剩余5 只C57BL/6Cnc小鼠作為野生組，不做任何處理。尾靜脈注射4 周后，lincRNA-p21 過表達(dá)組與對照組、突變組與野生組分別予含5%酒精的液體飼料連續(xù)喂養(yǎng)4周，最后3 天同時予40%酒精5 g/kg 灌胃，建立酒精性損傷模型。末次灌胃12 h，麻醉后眼底靜脈叢取血，檢測血清ALT、AST。若ALT＞37 U/L 和AST＞40 U/L，則酒精性損傷模型構(gòu)建成功。

1.3 小腸組織lincRNA-p21 表達(dá)檢測 處死小鼠，留取小腸組織，-80 ℃冰箱保存。取部分小腸組織，液氮下研磨成粉末，采用TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA 濃度和純度合格。按Prime ScriptTMRT Reagent Kit說明將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。以cDNA 為模板，按照SYBR Premix Ex TaqTM說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：lincRNA-p21上游引物5'-CCCCATAGCCACAACTCTCTG-3'、下游引物5'-AAGTTCTTGCCCTGGGTCTTTG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度149 bp；β-actin 上游引物5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3'、下游引物5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度154 bp。PCR 反應(yīng)體系共20 μL：2 × SYBR Green Mix 10 μL，cDNA 模板1 μL，上下游引物各0.8 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s 共35個循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，獲取循環(huán)閾值（CT）數(shù)。以β-actin 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算lincRNA-p21相對表達(dá)量。

1.4 小腸組織病理形態(tài)觀察 剪取部分小腸組織，10%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，常規(guī)浸蠟、包埋，4 μm 厚連續(xù)切片。石蠟切片脫蠟至水，蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，氨水返藍(lán)，伊紅染色，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封固，顯微鏡下拍照觀察。

1.5 小腸組織緊密連接蛋白表達(dá)檢測 將小腸組織切片于抗原修復(fù)緩沖液中加熱修復(fù)抗原，BSA 封閉，分別滴加claudin-1、ZO-1 一抗，4 ℃孵育過夜。次日，滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗，室溫避光孵育。DAPI復(fù)染細(xì)胞核，室溫避光孵育?？篃晒獯銣绶馄瑒┓馄瑹晒怙@微鏡下觀察并采集圖像。采用Image J軟件分析小腸組織緊密連接蛋白表達(dá)。

1.6 腸道菌群測序 處死小鼠，取盲腸內(nèi)容物，-80 ℃凍存。由北京閱微基因技術(shù)股份有限公司提取盲腸內(nèi)容物的微生物DNA，并進(jìn)行16S 擴(kuò)增子測序，分析菌群多態(tài)性和組成等。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，結(jié)果比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小腸組織lincRNA-p21 表達(dá)比較lincRNA-p21過表達(dá)組與對照組小腸組織lincRNA-p21相對表達(dá)量分別為47.13 ± 18.36、2.44 ± 1.11，lincRNA-p21 過表達(dá)組小腸組織lincRNA-p21 相對表達(dá)量高于對照組（t=5.31，P＜0.05）。突變組與野生組小腸組織lincRNA-p21 相對表達(dá)量分別為0.05 ±0.04、1.11 ± 0.60，突變組小腸組織lincRNA-p21 相對表達(dá)量低于野生組（t=3.95，P＜0.01）。

2.2 各組小腸組織病理形態(tài)觀察 小腸組織HE染色顯示，各組均出現(xiàn)腸道損傷，腸黏膜可見粒細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤。與對照組比較，lincRNA-p21過表達(dá)組腸道損傷較重，腸絨毛空泡化增多，腸黏膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)較紊亂，腸壁水腫和腸壁隱窩損傷較重；與野生組比較，突變組腸絨毛空泡化減少，腸黏膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)較條理，腸壁水腫和腸壁隱窩損傷較輕。

2.3 各組小腸組織緊密連接蛋白表達(dá)比較lincRNA-p21 過表達(dá)組與對照組claudin-1 相對表達(dá)量分別222.40 ± 1.06、237.70 ± 0.71，ZO-1相對表達(dá)量分別為238.40 ± 1.07、243.50 ± 0.51，lincRNA-p21過表達(dá)組claudin-1、ZO-1 相對表達(dá)量均低于對照組（t分別為20.84、7.57，P均＜0.01）。突變組與野生組claudin-1相對表達(dá)量分別為221.60 ± 3.58、209.70 ±1.01，ZO-1相對表達(dá)量分別為239.30 ± 2.89、225.30 ±2.20，突變組claudin-1、ZO-1 相對表達(dá)量均高于野生組（t分別為5.53、6.69，P均＜0.01）。

2.4 小腸組織lincRNA-p21 表達(dá)對腸道菌群的影響 腸道菌群測序結(jié)果顯示，lincRNA-p21過表達(dá)組與對照組、突變組與野生組腸道優(yōu)勢菌群均為厚壁菌門或擬桿菌門。與對照組比較，lincRNA-p21過表達(dá)組與對照組腸道菌群中放線菌門豐度分別為0.049 ± 0.017、0.016 ± 0.004，lincRNA-p21 過表達(dá)組腸道菌群中放線菌門豐度高于對照組（t=4.21，P＜0.01）。突變組與野生組腸道菌群中藍(lán)藻菌門豐度分別為0.000 19 ± 0.000 17、0.004 10 ± 0.003 30，突變組腸道菌群中藍(lán)藻菌門豐度低于野生組（t=2.62，P＜0.05）。KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，lincRNA-p21 過表達(dá)和基因敲減對酒精暴露小鼠腸道菌群功能的影響涉及氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收以及細(xì)胞生長和死亡等方面。

3 討論

飲酒是15～49歲人群過早死亡和殘疾的第五大風(fēng)險因素。飲酒后，腸道菌群與宿主正常的共生關(guān)系被破壞，腸道菌群多樣性降低，菌群種屬和數(shù)量會發(fā)生不同程度改變，腸上皮緊密連接的完整性被破壞，腸道屏障通透性增加［2］。腸道屏障損傷和腸道菌群失調(diào)是酒精性腸道損傷的重要發(fā)病機(jī)制。而腸道損傷則可通過肝腸軸、腦腸軸造成全身多個器官損傷和功能障礙，如酒精性肝病、酒精性腦病和胰腺炎等。

酗酒者腸道屏障損傷和腸道菌群改變各有不同，表明宿主遺傳因素可能在酒精性腸道損傷中起到至關(guān)重要的作用。lincRNA-p21 定位于人染色體6p21.2，位于細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因p21/CDKN1A上游約15 kb 處，長度約3 kb，是新發(fā)現(xiàn)的一種與細(xì)胞增殖、凋亡和DNA 損傷反應(yīng)有關(guān)的調(diào)節(jié)因子。lincRNA-p21 可通過與MDM2 結(jié)合而抑制MDM2 介導(dǎo)的p53泛素化和降解，進(jìn)而促進(jìn)p53依賴性細(xì)胞凋亡。lincRNA-p21具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能，可在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用［5］。1-甲基-4-苯基吡啶離子可上調(diào)神經(jīng)母細(xì)胞瘤lincRNA-p21表達(dá)，通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路以及促進(jìn)氧化應(yīng)激而加速神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞衰老［6］。因此，靶向lincRNA-p21 可能對神經(jīng)母細(xì)胞瘤治療具有重要價值。在非腫瘤性疾病中，lincRNA-p21可上調(diào)自噬水平而抑制阿爾茨海默病的神經(jīng)炎癥反應(yīng)［7］；ROS 可誘導(dǎo)lincRNA-p21表達(dá)而加速平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)腹主動脈瘤形成［8］。在正畸治療中，機(jī)械壓力可誘導(dǎo)lincRNA-p21 表達(dá)上調(diào)，而敲低lincRNA-p21 則可下調(diào)自噬水平，抑制牙骨質(zhì)母細(xì)胞的礦化能力［9］。lincRNA-p21在缺血再灌注的心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，敲減lincRNA-p21 則可減少心肌缺血再灌注損傷小鼠的梗死面積，改善心功能。究其機(jī)制，lincRNA-p21可通過吸附miR-466i-5p，上調(diào)NR4A2 表達(dá)，促進(jìn)缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞凋亡［10］。以上研究表明，lincRNA-p21在人類疾病的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，lincRNA-p21在酒精性肝病中表達(dá)上調(diào)［4］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lincRNA-p21能夠加重酒精性腸道損傷。進(jìn)一步證實(shí)，lincRNA-p21在酒精性腸道損傷中亦發(fā)揮重要作用。

claudin-1、ZO-1 是腸道細(xì)胞間重要的緊密連接蛋白，也是維護(hù)腸道屏障功能的重要蛋白質(zhì)［11］。腸道屏障能夠阻止腸道內(nèi)有害物質(zhì)穿過腸黏膜進(jìn)入人體其他組織、器官或血液循環(huán)。為了研究lincRNA-p21過表達(dá)和基因敲除對腸道屏障功能的影響，本研究觀察了腸組織緊密連接蛋白claudin-1、ZO-1 表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lincRNA-p21 過表達(dá)能夠降低緊密連接蛋白claudin-1、ZO-1 表達(dá)，增加腸道屏障損傷；而lincRNA-p21 敲減則可增加緊密連接蛋白claudin-1、ZO-1表達(dá)，減輕腸道屏障損傷。結(jié)果表明，lincRNA-p21在酒精性腸道損傷中的作用可能是通過影響緊密連接蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

酒精喂養(yǎng)會導(dǎo)致動物腸道微生物組成發(fā)生明顯變化，如酒精喂養(yǎng)小鼠腸道菌群厚壁菌門相對豐度降低，擬桿菌門和Verrucomirobia相對豐度增加。一些酗酒者可表現(xiàn)出明顯的腸道菌群失調(diào)，如擬桿菌減少，厚壁菌和變形桿菌增多。酗酒可導(dǎo)致肝硬化患者腸道菌群失調(diào)，可能有助于肝硬化進(jìn)展［12］。腸道菌群組成由多種因素決定，包括飲食習(xí)慣、宿主遺傳因素?，F(xiàn)階段對酒精性肝病宿主遺傳背景與腸道菌群關(guān)系的認(rèn)識還非常有限。有研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群通過抑制長鏈非編碼RNA Snhg9表達(dá)來重編程腸道的脂質(zhì)代謝［13］。有研究報道，放線菌門在炎癥性腸病患者腸道菌群中的豐度增加［14］，藍(lán)藻菌門在自身免疫性疾病患者中的豐度增加［15］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lincRNA-p21過表達(dá)可增加腸道菌群中放線菌門的豐度，而該基因敲減則可降低藍(lán)藻菌門的豐度。結(jié)果表明，lincRNA-p21表達(dá)變化在一定程度上可影響酒精飲食小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)，而敲減lincRNA-p21或可起到保護(hù)作用。

綜上所述，lincRNA-p21過表達(dá)能夠加重酒精性腸道損傷，而敲減lincRNA-p21 則可減輕酒精性腸道損傷，其機(jī)制可能與增加或減少腸道屏障損傷以及改變腸道菌群結(jié)構(gòu)有關(guān)。因此，靶向lincRNA-p21或可成為酒精性腸道損傷的治療策略之一。