郭昭興 萬修華

白內(nèi)障是目前全球首要致盲眼病[1],其特點是晶狀體混濁引起的進行性視力下降。一般認為,晶狀體蛋白質(zhì)聚集是白內(nèi)障發(fā)病中的一個重要過程。晶狀體蛋白分為水溶性和非水溶性兩種,水溶性蛋白含量降低和非水溶性蛋白含量升高均可導(dǎo)致白內(nèi)障。

生理狀態(tài)下的晶狀體是具有屈光功能的透明組織,由大量晶狀體蛋白規(guī)律排布構(gòu)成。晶狀體蛋白分為 α-、β-和γ-晶狀體蛋白 3 個亞家族。其中α-晶狀體蛋白屬于小熱休克蛋白,具有分子伴侶功能,可輔助其他晶狀體蛋白正確折疊從而抑制蛋白質(zhì)聚集[2]。β-和γ-晶狀體蛋白是晶狀體主要的結(jié)構(gòu)蛋白,主要維持晶狀體的結(jié)構(gòu)和功能[3-4]。

蛋白質(zhì)聚集的原因并非一個新興的研究方向,其中涉及的具體機制目前仍未完全清楚[5]。近些年隨著液相色譜-質(zhì)譜法、核磁共振波譜法、分子動力學(xué)模擬等技術(shù)的廣泛應(yīng)用,有關(guān)蛋白質(zhì)聚集的研究不斷深入。此外,研究人員針對抗蛋白質(zhì)聚集途徑篩選出了有效的化合物,這為白內(nèi)障藥物研發(fā)提供了新的思路?；蛲蛔?、異構(gòu)化與共價修飾、化合物和離子作用、蛋白質(zhì)相互作用均是蛋白質(zhì)聚集發(fā)生的原因。本文圍繞上述四點對蛋白質(zhì)聚集在白內(nèi)障發(fā)病中的作用研究進展進行綜述,以期為后續(xù)研究提供資料和參考。

1 基因突變

白內(nèi)障致病突變在先天性白內(nèi)障的發(fā)病過程中扮演著重要角色[6],其致病機制具有較高的研究價值。Qi等[7]研究發(fā)現(xiàn),S228P突變可分離βB1-晶狀體蛋白C端結(jié)構(gòu)域中的兩個高度保守的相互作用環(huán),從而將疏水核心與天然βB1-晶狀體蛋白中的溶劑隔離開來。重新折疊的S228P突變蛋白具有更少的堆積結(jié)構(gòu)和未淬滅的色氨酸熒光團,同時有著更多的疏水基團暴露。在生理溫度下S228P突變蛋白容易聚集,降低了βB1-晶狀體蛋白對βA3-晶狀體蛋白的保護作用。Zhao等[8]發(fā)現(xiàn)兩個先天性白內(nèi)障致病突變W59C和W151C均可以破壞保守的色氨酸殘基從而極大降低βB2-晶狀體蛋白的溶解度及對熱和鹽酸胍的穩(wěn)定性。Zhu等[9]通過光譜實驗也得出類似的結(jié)果,G75V突變體有更多的色氨酸熒光團和疏水性暴露基團。突變體γS-晶狀體蛋白的變異體更容易受到熱處理、鹽酸胍和酸性條件的影響。除上述幾個實驗外,Xu等[10]發(fā)現(xiàn)的S31W和R145W突變、Fu等[11]發(fā)現(xiàn)的L45P和Y46D突變、Ren等[12]發(fā)現(xiàn)的S93R突變經(jīng)過光譜實驗和動態(tài)分子模擬論證,幾乎都能改變β/γ-晶狀體蛋白中的四個保守的色氨酸殘基暴露基團,進而影響β/γ-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu),造成晶狀體蛋白質(zhì)聚集,該途徑可能與先天性白內(nèi)障的發(fā)病息息相關(guān)。

2 異構(gòu)化與共價修飾

2.1 天冬氨酸異構(gòu)化

α-晶狀體蛋白由αA-和αB-兩個亞基組成,在晶狀體蛋白合成過程中發(fā)揮分子伴侶功能,可輔助晶狀體蛋白正確折疊。此前有研究發(fā)現(xiàn),老年人αB-晶狀體蛋白中的天冬氨酸(Asp)存在異常量的異構(gòu)化(Asp96)。為探究Asp96異構(gòu)化的影響,Takata等[13]將αB-晶狀體蛋白的殘基93-103合成肽鏈,其中L-α-Asp被L-β-Asp、D-α-Asp或D-β-Asp取代,生物學(xué)測定結(jié)果顯示,Asp96的異構(gòu)化可以改變肽鏈的局部結(jié)構(gòu)及其對酶消化的穩(wěn)定性。Fujii等[14]則利用液相色譜-質(zhì)譜法測定αA-晶狀體蛋白中Asp58、Asp91/92和Asp151異構(gòu)體的比例,結(jié)果表明,非水溶性物異構(gòu)體比例最多,高分子量蛋白質(zhì)聚集體次之,α-晶狀體蛋白最少。因此,Asp在α-晶狀體蛋白中的異構(gòu)化可能是蛋白質(zhì)聚集的觸發(fā)因素,會導(dǎo)致白內(nèi)障的形成。

2.2 谷氨酰胺脫酰胺

除Asp異構(gòu)化以外,αA-晶狀體蛋白中谷氨酰胺(Glu)的脫酰胺反應(yīng)在年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體中也很常見。這種修飾在白內(nèi)障患者晶狀體不溶性部分中非常普遍,可能與白內(nèi)障形成相關(guān)。Ray等[15]測定了Glu147脫酰胺對αA-晶狀體在體外伴侶能力的影響。Glu147脫酰胺的αA-晶狀體蛋白的伴侶能力略有降低,其中心α-晶狀體結(jié)構(gòu)域的整體結(jié)構(gòu)略有破壞,顯示出形成低聚物的趨勢。由于αA-晶狀體蛋白占比最多,即使是很小的功能喪失也可能導(dǎo)致晶狀體混濁。

2.3 天冬酰胺脫酰胺

Forsythe等[16]研究發(fā)現(xiàn),從老化晶狀體分離的不溶性蛋白質(zhì)內(nèi)的γS-晶狀體蛋白存在天冬酰胺(Asn)高度脫酰胺(Asn14和Asn76)現(xiàn)象。這些位點位于N端結(jié)構(gòu)域的表面,研究人員采用Asp殘基替換Asn,可產(chǎn)生重組人γS-脫酰胺突變體。對比發(fā)現(xiàn),突變體的光散射增加,熱誘導(dǎo)變性過程中出現(xiàn)蛋白質(zhì)聚集。Vetter等[17]則通過在N14、N76和N143三處位點模擬脫酰胺過程,并通過動態(tài)光散射,化學(xué)和熱變性,氫-氘交換和對二硫鍵交聯(lián)的敏感性評估Asn脫酰胺對γS-晶狀體蛋白生理特性的影響,結(jié)果顯示,少量脫酰胺突變體迅速聚集成大型光散射物質(zhì),它們是造成晶狀體光散射的主要成分;在鹽酸胍或高溫下,脫酰胺可加速蛋白質(zhì)的展開和聚集,并增加蛋白質(zhì)對氧化的敏感性。此外,三重突變體更加不穩(wěn)定,說明脫酰胺的影響具有累積性。

2.4 甲基乙二醛修飾

αA-晶狀體蛋白中的G98R突變與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生同樣存在聯(lián)系。研究表明,突變蛋白結(jié)構(gòu)改變,穩(wěn)定性降低,寡聚體大小增加,伴侶樣活性喪失以及對蛋白水解的易感性升高可能是白內(nèi)障形成的促成因素[12]。Santhoshkumar等[18]研究發(fā)現(xiàn),用低濃度(50 μmol·L-1)的甲基乙二醛(MGO)修飾蛋白質(zhì),可以提高αAG98突變體的穩(wěn)定性和伴侶活性。將αAG98R蛋白(1 g·L-1)在無菌條件下于37 ℃孵育30 d會導(dǎo)致突變蛋白沉淀,而用50 μmol·L-1MGO修飾的突變蛋白則能保持穩(wěn)定的可溶性和透明性。上述結(jié)果提示低濃度MGO修飾在穩(wěn)定突變伴侶蛋白方面具有潛在作用。

2.5 泛素化修飾

年齡相關(guān)性白內(nèi)障主要與紫外線-B(UVB)誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)氧化損傷關(guān)系密切。錯配修復(fù)蛋白3(MSH3)作為錯配修復(fù)家族的關(guān)鍵成員,主要維持基因組穩(wěn)定性。然而,目前人們對MSH3的功能及維持MSH3蛋白質(zhì)平衡的機制仍然未知。Chen等[19]最新研究發(fā)現(xiàn),暴露在UVB下,年齡相關(guān)性白內(nèi)障標本和SRA01/04細胞中MSH3的蛋白表達水平降低。MSH3的異位表達顯著阻礙了UVB誘導(dǎo)的細胞凋亡,而MSH3水平下降則會促進細胞凋亡。蛋白質(zhì)半衰期測定顯示,UVB照射可通過泛素化和降解作用加速降低MSH3水平。此外,研究人員發(fā)現(xiàn),E3泛素連接酶合成滑膜蛋白(SYVN1)可與MSH3相互作用,促進后者泛素化和降解。綜上,年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)病機制可能涉及SYVN1介導(dǎo)的MSH3泛素-蛋白酶體途徑和自噬-溶酶體途徑,針對SYVN1的干預(yù)措施很有可能成為年齡相關(guān)性白內(nèi)障的潛在治療方向。另有研究[20]表明,E3泛素連接酶RING指蛋白157(RNF157)會與腫瘤抗原p53相互作用從而調(diào)控晶狀體上皮細胞的凋亡。RNF157可引起p53的泛素化和降解,降低RNF157表達則會上調(diào)p53的表達進而促進晶狀體上皮細胞凋亡。由此看來,對RNF157表達的調(diào)節(jié)可以作為白內(nèi)障潛在的治療策略。

3 化合物和離子作用

目前,針對白內(nèi)障的治療仍以手術(shù)為主,探尋有效的白內(nèi)障藥物始終是科研人員關(guān)注的課題。2015年Zhao等[21]報道,在體外和細胞轉(zhuǎn)染實驗中利用羊毛甾醇處理均可降低預(yù)制蛋白質(zhì)聚集體的含量。進一步實驗表明,通過羊毛甾醇治療可以提高離體兔眼白內(nèi)障晶狀體和狗在體白內(nèi)障晶狀體的透明度。這一研究在白內(nèi)障藥物研發(fā)方面具有重要意義,相關(guān)研究結(jié)果為白內(nèi)障藥物研制開辟出了新的思路。Makley等[22]圍繞甾醇類物質(zhì)進一步開展研究,通過熱穩(wěn)定性測定,該團隊鑒定了一類可結(jié)合α-晶狀體蛋白并在體外逆轉(zhuǎn)其聚集的分子。人們通過差式掃描熒光法發(fā)現(xiàn)25羥基膽固醇可以改善R49C和R120G突變所致遺傳性白內(nèi)障小鼠模型中晶狀體的透明度。更為重要的是,它還部分恢復(fù)了老年小鼠在體晶狀體和人離體晶狀體中的蛋白質(zhì)溶解度,這提示25羥基膽固醇可作為藥物應(yīng)用于年齡相關(guān)性白內(nèi)障的預(yù)防和治療。Chen等[23]在上述兩項研究的基礎(chǔ)上對羊毛甾醇和25羥基膽固醇的有效性進行了離體組織定量研究。實驗材料選取了通過手術(shù)分離出的人白內(nèi)障患者晶狀體中的蛋白質(zhì)聚集體。用兩種化合物分別處理樣品,二者均對蛋白質(zhì)聚集體的溶解有效,且有效性與白內(nèi)障嚴重程度相關(guān)。另有研究[24]表明,人眼晶狀體代謝物肌醇作為天然的化學(xué)伴侶可抑制晶狀體蛋白的聚集。代謝組學(xué)證據(jù)表明,與年齡匹配的對照組相比,人類白內(nèi)障患者晶狀體的肌醇被嚴重耗盡。通過維持人眼晶狀體內(nèi)正常肌醇水平可預(yù)防或延緩晶狀體混濁。

金屬離子的暴露則是白內(nèi)障形成過程中的另一個危險因素。Quintanar等[25]發(fā)現(xiàn)Cu2+和Zn2+離子都可誘導(dǎo)人γD-晶狀體蛋白快速非淀粉樣聚集,形成高分子量的輕散射聚集體。Cu2+離子可降低人γD-晶狀體蛋白的熱穩(wěn)定性,促進二硫鍵橋接二聚體的形成。Ramkumar等[26]也通過實驗得到了類似的結(jié)果。值得注意的是,這種金屬離子誘導(dǎo)的聚集都強烈依賴于溫度,并且可被αB-晶狀體蛋白抑制。Domínguez-Calva等[27]將金屬-晶狀體蛋白相互作用的研究擴展到重金屬離子,如二價鉛、鎘和汞。使用濁度測定、電子顯微鏡、電子吸收和圓二色光譜評估這些重金屬離子在三種同源人γ-晶狀體蛋白的非淀粉樣蛋白質(zhì)聚集中的作用。結(jié)果表明,Hg2+離子可以誘導(dǎo)人γC-和γS-晶狀體蛋白的非淀粉樣蛋白質(zhì)聚集,但不能誘導(dǎo)γD-晶狀體蛋白質(zhì)聚集。汞誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集的機制包括直接的金屬-蛋白質(zhì)相互作用、熱穩(wěn)定性喪失、蛋白質(zhì)N端結(jié)構(gòu)域的部分展開以及二硫鍵橋接二聚體的形成。Ramirez-Bello等[28]評估了Cu2+和Zn2+離子對βA1-蛋白(酸性蛋白代表)和βB2-蛋白(堿性蛋白代表)聚集的影響,結(jié)果表明,Cu2+離子誘導(dǎo)βA1-晶狀體蛋白的構(gòu)象變化很小,導(dǎo)致高分子量的輕散射聚集體形成,而Zn2+離子對βB2-晶狀體蛋白更具侵略性且可誘導(dǎo)更大的構(gòu)象變化。

4 蛋白質(zhì)相互作用

晶狀體內(nèi)含有高濃度的晶狀體蛋白,因此其也是最擁擠的生物環(huán)境之一。此前許多研究已經(jīng)探討了αB-晶狀體蛋白在體外稀釋條件下的結(jié)構(gòu)和功能,但擁擠對這些方面的影響尚不清楚。Grosas等[29]以多糖Ficoll400和牛γ-晶狀體蛋白為擁擠劑,采用生物物理方法,研究了αB-晶狀體蛋白在擁擠環(huán)境下的結(jié)構(gòu)和伴侶能力,結(jié)果表明,αB-晶狀體蛋白會出現(xiàn)展開,形成低聚狀態(tài),其熱穩(wěn)定性和伴侶能力降低。然而,αA-晶狀體蛋白的存在可以穩(wěn)定αB-晶狀體蛋白的聚集。這初步揭示了晶狀體蛋白質(zhì)相互作用對于蛋白質(zhì)聚集造成的影響。Schmid等[30]則通過對來自不同小鼠品系α-、β-或γ-晶狀體蛋白的點突變進行分析發(fā)現(xiàn),這些晶狀體蛋白在體外是不穩(wěn)定的。它們的含量在晶狀體中大大降低,且它們的非水溶性部分不會積聚。相反,所有其他晶狀體蛋白,包括α-晶狀體蛋白都發(fā)生了沉淀。在突變晶狀體中觀察到的晶狀體蛋白質(zhì)組成和空間組織的變化表明,晶狀體蛋白質(zhì)組的不平衡和晶狀體蛋白相互作用的改變是白內(nèi)障形成的基礎(chǔ),并非突變晶狀體蛋白本身具有的聚集傾向,分子伴侶池的耗盡最終會導(dǎo)致晶狀體混濁。該團隊創(chuàng)新性地從蛋白質(zhì)組的角度出發(fā)對蛋白質(zhì)聚集進行了解釋,晶狀體蛋白間的相互作用成為研究蛋白質(zhì)聚集過程中的一個獨立因素。

5 結(jié)束語

應(yīng)用基因測序技術(shù)和其他分子生物學(xué)技術(shù),人們將先天性白內(nèi)障所涉及的基因突變位點及突變對晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)造成的影響逐漸揭示清楚。目前,多種共價修飾在年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生過程中的意義已被闡明,通過抗蛋白質(zhì)聚集途徑逆轉(zhuǎn)白內(nèi)障的化合物也已成功篩選。值得注意的是,僅從基因突變的角度出發(fā)去解釋先天性白內(nèi)障的發(fā)病機制是遠遠不夠的?；虻谋磉_涉及多個步驟,任一步均有可能造成蛋白質(zhì)的錯誤折疊和聚集。眼科科研人員同時也應(yīng)關(guān)注后續(xù)基因轉(zhuǎn)錄及晶狀體蛋白翻譯過程,系統(tǒng)評估先天性白內(nèi)障可能的致病環(huán)節(jié)。白內(nèi)障成藥的潛在化合物雖已找到,但目前并沒有形成具體的藥物制劑,更沒有開展臨床試驗。針對年齡相關(guān)性白內(nèi)障可能的干預(yù)位點目前也沒有更進一步的研究驗證其可行性。希望未來能有更多白內(nèi)障藥物進入臨床應(yīng)用,早日將實驗室獲得的研究成果應(yīng)用于臨床實踐。誠然,通過抗蛋白質(zhì)聚集這一途徑預(yù)防或治療白內(nèi)障還需要克服很多困難。不過隨著研究的深入,蛋白質(zhì)聚集涉及的分子機制會更加完善,未來白內(nèi)障的預(yù)防和治療將會得到更全面的擴展。