么亞妹，陳奕彤 ，田永濤，劉天悅，王文蜀,

（1.質(zhì)譜成像與代謝組學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中央民族大學(xué)），北京 100081；2.中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081）

當(dāng)今社會(huì)面對(duì)慢性疾患和人口老齡化雙重挑戰(zhàn)，含有天然抗氧化劑的功能性食品及相關(guān)產(chǎn)品是人類(lèi)防治慢性疾患和健康管理關(guān)口前移的重要物質(zhì)[1]。百香果（PassifloraedulisSims）是西番蓮科（Passifloraceae）西番蓮屬（PassifloraLinn.）多年生攀援藤本植物，因其獨(dú)特風(fēng)味和較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值備受消費(fèi)者喜愛(ài)，現(xiàn)于廣西、云南、福建和四川[2]等地作為鄉(xiāng)村振興產(chǎn)業(yè)被推廣種植[3]。研究表明百香果皮中富含天然多酚，種類(lèi)繁多，這些多酚被證實(shí)能夠有效抑制人體內(nèi)的氧化應(yīng)激現(xiàn)象[4]，是開(kāi)發(fā)性?xún)r(jià)比高的抗氧化功能性食品的優(yōu)質(zhì)綠色資源。

多酚是一類(lèi)母核為C6～C3 結(jié)構(gòu)的天然化合物，根據(jù)取代基位置、類(lèi)型和數(shù)量的不同又分為酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、黃酮醇類(lèi)、二氫黃酮類(lèi)、黃烷醇類(lèi)和花青素類(lèi)等[5]。不同類(lèi)型多酚的生物活性及其利用效率具有一定差別。因此，根據(jù)不同類(lèi)型多酚在各極性溶劑中的聚合程度差異[6]，對(duì)其進(jìn)行分級(jí)利用，有利于多酚的高效精準(zhǔn)開(kāi)發(fā)。Fan 等[7]研究發(fā)現(xiàn)富硒茶不同萃取部位（乙酸乙酯、正丁醇、水相）酚類(lèi)化合物種類(lèi)及其抗氧化和細(xì)胞保護(hù)活性具有差異，表明富硒茶不同溶劑部位有不同的利用價(jià)值。

基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-MS）的代謝組學(xué)可提供樣品代謝物的大量信息，若結(jié)合模式識(shí)別方法對(duì)所得信息進(jìn)行降維處理，可實(shí)現(xiàn)在將數(shù)據(jù)可視化的同時(shí)歸納總結(jié)各類(lèi)數(shù)據(jù)，呈現(xiàn)多元數(shù)據(jù)的內(nèi)在聯(lián)系的效果。Domínguez 等[8]通過(guò)建立PCA模型可視化了堿、酸和酶輔助3 種提取方法下百香果皮酚類(lèi)化合物差異，為后續(xù)研究者獲取百香果皮目標(biāo)酚類(lèi)化合物而選擇高效的提取方法提供了參考。

目前我國(guó)鮮見(jiàn)百香果皮不同溶劑部位中多酚種類(lèi)差別的研究，在此本研究以百香果皮粗提物和不同極性溶劑分級(jí)萃取物為研究對(duì)象，采用UPLC-MS 分析其化合物組成，并通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)表征百香果皮各分級(jí)萃取物代謝物差異，篩選差異代謝物并定量，選用多種抗氧化實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)各分級(jí)萃取物的體外抗氧化能力，尋找發(fā)揮抗氧化活性的關(guān)鍵多酚，以期為百香果皮相關(guān)抗氧化產(chǎn)品的精準(zhǔn)開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫皮百香果（Passiflora edulisSims）2021 年7 月6 日采自四川省涼山彝族自治州德昌縣；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇 分析純，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；DPPH、ABTS、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid,Trolox）上海麥克林公司；過(guò)硫酸鉀、硫酸亞鐵、氯化鐵、醋酸鈉、鹽酸 北京化工廠；2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-Tri（2-pyridyl）-s-triazine,TPTZ）上海源葉科技有限公司；原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、異槲皮苷、異葒草苷 純度≥98%，成都艾博克生物科技有限公司；乙腈、甲酸 色譜純，美國(guó)Sigma 公司。

KS-5200DA 液晶超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；BHS-2 精密數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海壘固儀器有限公司；R-215 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士步琦公司；EnSpire 酶標(biāo)儀 美國(guó)PerkinElmer 公司；Acquity UPLC I-Class 超高效液相色譜儀、PLUS Xevo G2XS QTOF MS 質(zhì)譜儀 美國(guó)Waters 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 百香果皮各分級(jí)萃取物總酚、總黃酮含量測(cè)定

1.2.1.1 樣品制備 百香果皮陰干粉碎，按照液料比20:1（mL/g），用70%乙醇，超聲提取30 min，抽濾回收上清液，剩余殘?jiān)貜?fù)以上步驟2 次，合并上清液，旋蒸、吹干得百香果皮粗提物（CE）。超純水溶解粗提物浸膏，經(jīng)石油醚、乙酸乙酯和正丁醇等比依次萃取，得各極性部位萃取液和剩余水部分，旋蒸、吹干得百香果皮石油醚部位（PE）、乙酸乙酯部位（EE）、正丁醇部位（BE）和水部位（WE）浸膏。浸膏得率計(jì)算公式為：

1.2.1.2 總酚含量測(cè)定 參考許夢(mèng)圓[9]方法，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=0.0264x+0.1741（R2=0.9990），以每克干物質(zhì)中沒(méi)食子酸當(dāng)量（mg/g）計(jì)算總酚含量。

1.2.1.3 總黃酮含量測(cè)定 參考許夢(mèng)圓[9]方法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=0.0414x+0.1094（R2=0.9990），以每克干物質(zhì)中蘆丁當(dāng)量（mg/g）計(jì)算總黃酮含量。

1.2.2 百香果皮分級(jí)萃取物中酚類(lèi)化合物UPLCMS/MS 分析

1.2.2.1 樣品前處理 稱(chēng)取百香果皮CE、PE、EE、BE和WE 浸膏各10 mg，用甲醇溶解至1 mL，3000 r/min高速離心10 min，過(guò)0.22 μm 濾膜。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、異槲皮苷和異葒草苷，用甲醇定容。等濃度梯度稀釋酚類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積（mAU）為縱坐標(biāo)，繪制各標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品特征酚類(lèi)化合物含量用每克百香果皮干重中所含標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)量表示。

六是提升了人民調(diào)解組織的矛盾吸附化解能力?！耙徽臼健彼痉ù_認(rèn)機(jī)制，為人民調(diào)解工作提供了堅(jiān)強(qiáng)后盾，極大地提升了人民調(diào)解組織的社會(huì)公信力。該機(jī)制建立后，很多當(dāng)事人慕名前來(lái)申請(qǐng)調(diào)解，并自覺(jué)為該機(jī)制進(jìn)行義務(wù)宣傳。房山區(qū)信訪部門(mén)轉(zhuǎn)辦的信訪糾紛，絕大多數(shù)在法官的指導(dǎo)下得到及時(shí)化解和司法確認(rèn)。這些措施，有效提升了房山區(qū)矛盾糾紛多元調(diào)解中心的社會(huì)影響力。僅一年多的時(shí)間，該中心就成功調(diào)處糾紛3000余起，矛盾吸附能力和化解能力顯著提升。

1.2.2.3 色譜條件 使用配備光電二極管陣列（PDA）探測(cè)器的Acquity UPLC 系統(tǒng)進(jìn)行定性分析。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18Column（130 ?,1.7 μm,2.1×100 mm）；流動(dòng)相：A 相為0.1%甲酸水，B 相為乙腈；系統(tǒng)流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；樣品進(jìn)樣量為2 μL；紫外檢測(cè)器設(shè)置為：210、280、350、520 nm；洗脫程序：0～0.5 min，1% B；0.5～25 min，1%～40% B；25～27 min，40%～100% B；27～29 min，100% B；29～31 min，1% B。

1.2.2.4 質(zhì)譜條件 MS 參數(shù)設(shè)置如下：在負(fù)模式下工作的電噴霧電離（ESI）源，離子源溫度300 ℃，掃描范圍m/z：100～1200 Da，毛細(xì)管電壓為3.0 kV，錐孔電壓30 V，數(shù)據(jù)采集和處理采用Massynlyx 4.2。

1.2.3 百香果皮體外抗氧化能力分析

1.2.3.1 DPPH 自由基清除能力測(cè)試 參照Polatoglu等[10]的方法。用甲醇配制0.1 mmol/L 的DPPH 工作液及不同濃度梯度的樣品和BHT 溶液。分別吸取100 μL 不同濃度的樣品和100 μL 的DPPH 工作液加入96 孔板中，混勻，室溫25 ℃避光反應(yīng)30 min，在517 nm 處測(cè)定吸光度值。以BHT 為陽(yáng)性對(duì)照代替樣品按照以上步驟測(cè)定吸光度。DPPH 自由基清除能力計(jì)算公式為：

式中：A0為空白對(duì)照（甲醇+DPPH 工作液）的吸光度；A1為樣品的吸光度；A2為樣品空白（甲醇+樣品溶液）的吸光度。

1.2.3.2 ABTS+自由基清除能力測(cè)試 參考Ye 等[11]方法，用甲醇配制7 mmol/L 的ABTS 溶液和用超純水配制2.6 mmol/L 的過(guò)硫酸鉀溶液等體積混合，室溫下避光反應(yīng) 12～16 h 備用。使用前用甲醇稀釋ABTS 儲(chǔ)備液使其在波長(zhǎng)734 nm 處的吸光度為0.700±0.020。用甲醇配制0.1～0.7 mmol/L 濃度梯度的Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取20 μL 各濃度Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液和180 μL ABTS 工作液，充分混勻后在734 nm處測(cè)定吸光度，以Trolox 溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品代替Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行以上操作，所得吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品ABTS 陽(yáng)離子自由基清除能力以達(dá)到同樣消除率所需Trolox 質(zhì)量（mmol TE/g）表示。

1.2.3.3 FRAP 法抗氧化測(cè)試 參考Chen 等[12]方法，分別配制0.3 mol/L 的醋酸鈉溶液、20 mmol/L 的FeCl3·6H2O 溶液、10 mmol/L 的TPTZ 由40 mmol/L鹽酸配制而成，上述溶液按照10:1:1 體積比例混合，得到FRAP 工作液避光備用。用甲醇配制0.05～0.80 mmol/L 濃度梯度的FeSO4溶液，吸取20 μL 各濃度FeSO4溶液和180 μL FRAP 工作液，充分混勻后在593 nm 處測(cè)定吸光度，以FeSO4溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品代替FeSO4溶液進(jìn)行以上操作，所得吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品鐵離子還原能力以Fe2+當(dāng)量表示（mmol Fe2+/g）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將1.2 所得質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)，導(dǎo)入代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI，進(jìn)行基線過(guò)濾、峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和歸一化處理后，輸出得到保留時(shí)間、質(zhì)荷比（m/z）和峰強(qiáng)度的數(shù)據(jù)矩陣（格式為.csv）。將數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA 軟件，進(jìn)行PCA和OPLS-DA。采用Masslynx 4.2 進(jìn)行峰提取和化合物鑒定。使用SPSS 19.0 進(jìn)行單因素差異顯著性分析和抗氧化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，采用Pearson 法進(jìn)行相關(guān)性分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（D）表示，以O(shè)rigin 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 百香果皮分級(jí)萃取物酚類(lèi)化合物成分分析

2.1.1 浸膏得率 百香果皮乙醇粗提物經(jīng)石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取后，得率降低，由大到小依次為 CE（18.06%）＞W(wǎng)E（8.30%）＞BE（3.70%）＞EE（1.18%）＞PE（0.58%），表明分級(jí)萃取對(duì)百香果皮中的化合物實(shí)現(xiàn)了分離。

2.1.2 總酚、總黃酮含量 結(jié)果如圖1，CE 中總酚含量32.61 mg/g，高于哥倫比亞紫皮百香果皮（24.96 mg/g）[13]；總黃酮含量24.07 mg/g，約為廣西雜交紫皮百香果（P.edulisדTai-Nong No.1”）果皮（12 mg/g）的2 倍[14]，說(shuō)明四川產(chǎn)紫皮百香果皮富含多酚。不同溶劑萃取物總酚、總黃酮含量呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），表明各溶劑對(duì)CE 中的多酚化合物實(shí)現(xiàn)了分離。結(jié)合得率分析可知，CE 得率最高，但測(cè)得總酚含量不高。EE 和BE 化合物得率較低，但等量浸膏中EE 總酚（62.42 mg/g）和總黃酮（43.90 mg/g）含量約為CE（32.61、24.07 mg/g）的2 倍，BE 總酚（47.63 mg/g）和總黃酮（28.84 mg/g）含量也顯著高于CE（P＜0.05），說(shuō)明乙酸乙酯[15]和正丁醇[16]能高效富集CE 中羥基苯甲酸類(lèi)（原兒茶酸）和黃酮醇類(lèi)（蘆丁）2 種類(lèi)型的多酚。WE 浸膏得率僅次于CE，但總酚（11.83 mg/g）和總黃酮（10.12 mg/g）含量保留不到CE 的1/2，推測(cè)WE 富集了較多紫外響應(yīng)差的大極性水溶性化合物。石油醚極性較小，PE 總酚（1.88 mg/g）和總黃酮（1.51 mg/g）含量最低，均約為CE 的6%，萃取的多酚種類(lèi)與含量均較少。

圖1 百香果皮各分級(jí)萃取物總酚和總黃酮含量Fig.1 Total phenols and total flavonoids of different fractional extracts from P.edulis peel

2.1.3 酚類(lèi)化合物鑒定 得到百香果皮粗提物和各分級(jí)萃取物總離子流圖（圖2），從中共鑒定出33 個(gè)酚類(lèi)化合物（表1），各分級(jí)萃取物多酚數(shù)量存在差別，CE、BE 和EE 多酚化合物數(shù)量明顯較多，這是由于不同種類(lèi)化合物在不同極性溶劑的溶解度有差異[7]。

表1 百香果皮各分級(jí)萃取物多酚化合物鑒定Table 1 Identification of phenolic compounds in different fractional extracts from P.edulis peel

圖2 百香果皮各分級(jí)萃取物的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of different fractional extracts from P.edulis peel

百香果皮粗提物和各分級(jí)萃取物中多酚種類(lèi)也不同（圖3），EE 和BE 中羥基苯甲酸類(lèi)和黃酮醇類(lèi)化合物占比較大，與上文總含量分析結(jié)果一致，說(shuō)明中等極性溶劑乙酸乙酯和較大極性溶劑正丁醇會(huì)更多富集粗提物中以原兒茶酸為代表的羥基苯甲酸類(lèi)化合物和以蘆丁為代表的黃酮醇類(lèi)化合物。PE 和WE 中酚類(lèi)化合物種類(lèi)較少，均只鑒定出2 個(gè)羥基苯甲酸類(lèi)和2 個(gè)黃酮醇類(lèi)化合物，可能原因是小極性溶劑石油醚更容易富集葉綠素等脂溶性成分，而經(jīng)各極性溶劑萃取富集后，WE 只余留了少量多酚。

圖3 百香果皮各分級(jí)萃取物酚類(lèi)化合物種類(lèi)占比Fig.3 Proportion of phenolic compounds in different fractional extracts from P.edulis peel

2.2 百香果皮各分級(jí)萃取物化合物組成差異分析

構(gòu)建無(wú)監(jiān)督PCA 模型對(duì)百香果皮粗提物和各分級(jí)萃取物中的化合物進(jìn)行差異分析。本次分析共提取出2 個(gè)包含化合物種類(lèi)、數(shù)量和含量等信息的主成分，其方差解釋率分別是59.98%，37.82%，累計(jì)方差解釋率為97.80%，說(shuō)明該模型精準(zhǔn)性和預(yù)測(cè)能力可靠。百香果皮各部位多酚代謝物3 次生物學(xué)重復(fù)數(shù)據(jù)能夠較好地集中在一起，提示實(shí)驗(yàn)樣品穩(wěn)定，數(shù)據(jù)重復(fù)性好。

圖4 顯示，百香果皮各分級(jí)萃取物數(shù)據(jù)分布于不同象限。在x 軸方向上，PE、EE 和BE、WE 分立于x 的負(fù)半軸和正半軸。y 軸方向上，PE 和WE 分布于負(fù)半軸，與分布于正半軸的EE 和BE 明顯區(qū)分，表明PE、EE、BE 和WE 中化合物種類(lèi)、數(shù)量及含量存在差異。CE 和BE 數(shù)據(jù)點(diǎn)沒(méi)有明顯分離，說(shuō)明CE和BE 化合物種類(lèi)數(shù)量或含量較為相似，這可能是因?yàn)橐掖己驼〈純H相差2 個(gè)碳原子，結(jié)構(gòu)相似，導(dǎo)致了二者對(duì)百香果皮中多酚化合物的相似溶解能力。

圖4 百香果皮各分級(jí)萃取物PCA（a）和OPLS-DA（b）圖Fig.4 PCA (a) and OPLS-DA (b) of different fractional extracts from P.edulis peel

OPLS-DA 模型表現(xiàn)出與PCA 類(lèi)似的結(jié)果，PE、EE、BE 和WE 分別分布于第三、二、一和四象限，支持了不同極性萃取溶劑能夠有效區(qū)分百香果皮中多酚化合物的結(jié)論。此外，差異代謝物是區(qū)分不同溶劑萃取的關(guān)鍵信息，變量重要性投影（Variable Importance in Projection，VIP）可表示不同化合物對(duì)于區(qū)分不同組分貢獻(xiàn)大小，VIP≥1 為常見(jiàn)的差異代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)。本研究共指認(rèn)了4 個(gè)VIP≥1 的酚類(lèi)代謝物（表2）作為解釋百香果皮各分級(jí)萃取物差異性的代表化合物。

表2 百香果皮的顯著差異代謝物Table 2 Significantly differential metabolites of fractional extracts from P.edulis peel

2.3 百香果皮差異酚類(lèi)化合物含量分析

采用外標(biāo)一點(diǎn)法測(cè)定4 個(gè)差異代謝物含量（表3）。不同溶劑萃取物中各差異物含量區(qū)分明顯（P＜0.05），CE、EE 和BE 中差異代謝物的含量普遍高于PE 和WE。對(duì)羥基苯甲酸和原兒茶酸都是羥基苯甲酸類(lèi)化合物，但原兒茶酸C6 位置比對(duì)羥基苯甲酸多一個(gè)OH，故分子極性增加，更易溶于極性較大的乙醇。因此，原兒茶酸在CE 的含量（152.40 μg/g）最高，EE（97.62 μg/g）和BE（27.97 μg/g）次之。對(duì)羥基苯甲酸則在極性適中的EE 中含量（653.44 μg/g）最高，其次為CE（556.65 μg/g）和BE（344.53 μg/g）。EE 中異槲皮苷（2420.64 μg/g）和異葒草苷（113.23 μg/g）含量最高，其異槲皮苷含量約為CE 的3 倍，高于香蕉百香果（Passiflora tripartitavar.Mollissima（Kunth）L.H.Bailey）果肉的9.80 μg/g[17]。異葒草苷是西番蓮屬的特征酚類(lèi)化合物[18]，Da 等[19]研究發(fā)現(xiàn)黃果西番蓮果皮中異葒草苷含量為270～870 μg/g，紫皮百香果皮EE 中異葒草苷約為CE 的5 倍。這可能是由于異槲皮苷和異葒草苷均為黃酮單糖苷類(lèi)化合物，極性適中，更易溶于中等極性溶劑乙酸乙酯。

表3 百香果皮各分級(jí)萃取物差異酚類(lèi)化合物含量（μg/g）Table 3 Content of differential phenolic compounds in different fractional extracts from P.edulis peel (μg/g)

2.4 百香果皮各分級(jí)萃取物體外抗氧化活性分析

2.4.1 DPPH 自由基清除測(cè)試結(jié)果 百香果皮各分級(jí)萃取物DPPH 自由基清除能力與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)一定量效關(guān)系（圖5）。各組分間DPPH 自由基清除能力存在差異，陽(yáng)性對(duì)照BHT、CE、EE 和BE 濃度—清除率曲線整體趨勢(shì)相似，WE、PE 與其他組分區(qū)分明顯。CE、EE、BE 和BHT 的SC50值差異不顯著（P＞0.05），單因素方差結(jié)果（表4）與圖5 結(jié)果一致，提示CE、EE 和BE 具有和陽(yáng)性對(duì)照相似的DPPH自由基清除效果。EE 的DPPH 自由基清除能力最強(qiáng)（SC50=0.02 mg/mL），約是CE 的4 倍。BE 的SC50（0.06 mg/mL）約為CE 的1.5 倍，高于陽(yáng)性對(duì)照BHT（SC50=0.04 mg/mL），說(shuō)明乙酸乙酯和正丁醇有效富集了百香果皮粗提物中的抗氧化活性化合物。WE（SC50=0.26 mg/mL）和PE（SC50=0.30 mg/mL）自由基清除能力顯著低于CE（P＜0.05）。

表4 百香果皮各分級(jí)萃取物含量及體外抗氧化活性Table 4 Content and activity of different fractional extracts from P.edulis peel

圖5 百香果皮提取物各分級(jí)萃取物和BHT 對(duì)DPPH 自由基清除能力Fig.5 Scavenging effect of different fractional extracts from P.edulis peel and BHT on DPPH free radicals

2.4.2 ABTS+自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Trolox 是水溶性維生素E 衍生物，與酚類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)相似，均有C6～C3 以及羰基結(jié)構(gòu)，被證實(shí)是最適合作為ABTS+自由基清除能力判斷的標(biāo)準(zhǔn)化合物。因此，酚類(lèi)化合物抗氧化能力常以 Trolox 為當(dāng)量表示[20]。以 Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=-1.996x+0.7180（R2=0.9993）。

由圖6 可知，百香果皮粗提物和各分級(jí)萃取物均具有ABTS+自由基清除能力，但存在顯著性差異（P＜0.05），由強(qiáng)到弱分別為：EE＞BE＞CE＞W(wǎng)E＞PE，與DPPH 自由基清除結(jié)果一致。CE 的ABTS+自由基清除能力為0.249 mmol TE/g，與甜果西番蓮（P.ligularisJuss）種籽有相似的ABTS+自由基清除能力（0.31～0.75 mmol TE/g）[21]。CE 經(jīng)分級(jí)萃取后，ABTS+自由基清除能力明顯升高，EE ABTS+自由基清除能力（0.911 mmol TE/g）最強(qiáng)，約為CE（0.249 mmol TE/g）的4 倍，其次為BE（0.379 mmol TE/g），約為CE 的1.5 倍。證明乙酸乙酯和正丁醇有效富集了抗氧化活性化合物。WE 和PE 的ABTS+自由基清除能力較差，分別僅達(dá)到EE 的11%和7%。

圖6 百香果皮提取物各分級(jí)萃取物對(duì)ABTS+自由基清除能力Fig.6 Scavenging effect of different fractional extract from P.edulis peel on ABTS+ free radicals

2.4.3 FRAP 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果如圖7，百香果皮各分級(jí)萃取物均具有Fe2+還原能力，但Fe2+還原能力差異明顯，由高到低依次為：EE＞BE＞CE＞W(wǎng)E＞PE，與DPPH自由基和ABTS+自由基清除能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。 EE 的Fe2+還原能力約是CE（0.212 mmol Fe2+/g）的2.5 倍，為0.505 mmol Fe2+/g。BE 的Fe2+還原能力（0.301 mmol Fe2+/g）也明顯高于CE，約是CE 的1.5 倍。而WE（0.143 mmol Fe2+/g）、PE（0.1 mmol Fe2+/g）的Fe2+還原能力顯著（P＜0.05）低于CE，PE 僅約為百香果皮CE 的1/2，但高于紫皮百香果葉醇提物Fe2+還原能力（0.078 mmol Fe2+/g）[22]。FRAP 基于SET 機(jī)制，該機(jī)制下物質(zhì)抗氧化能力取決于其電離勢(shì)，酚類(lèi)化合物給出電子將氧自由基轉(zhuǎn)化為陰離子從而達(dá)到還原效果，不同極性萃取物的多酚化合物物質(zhì)組成及含量使其電離勢(shì)有所區(qū)別，并使其抗氧化能力存在差異[23]。

圖7 百香果皮提取物各分級(jí)萃取物鐵離子還原能力Fig.7 Iron reduction ability of different fractional extracts from P.edulis peel

上述體外抗氧化能力測(cè)試結(jié)果表明CE 具有良好抗氧化能力，但經(jīng)過(guò)不同極性溶劑分級(jí)萃取后，各部位抗氧化能力明顯不同，EE 和BE 體外抗氧化活性增強(qiáng)，PE 和WE 活性減弱，說(shuō)明乙酸乙酯和正丁醇高效富集了CE 中抗氧化活性物質(zhì)。文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)羥基苯甲酸[24]、異槲皮苷[25]和異葒草苷[26]的抗氧化能力優(yōu)秀，而EE 中這3 個(gè)化合物含量高。此外EE中還鑒定出原花青素B2（28）等多個(gè)特有酚類(lèi)化合物，原花青素B2 被報(bào)道有效消除羥自由基、超氧陰離子自由基和強(qiáng)有力的金屬螯合能力，是目前國(guó)際上公認(rèn)的天然抗氧化劑[27]，由此推測(cè)這些化合物是EE高抗氧化力的原因。BE 鑒定出兒茶素衍生物[28]和咖啡酸衍生物[29]等具有高抗氧化性的酚類(lèi)化合物，其中毛蕊異黃酮是中草藥黃芪的主要抗氧化活性成分[30]，由此BE 在體外抗氧化測(cè)試中表現(xiàn)僅次于EE的良好活性。酚類(lèi)化合物種類(lèi)與含量較少應(yīng)該是造成PE 和WE 抗氧化活性較低的原因。

2.5 相關(guān)性分析

如圖8 所示，百香果皮總酚含量與ABTS+自由基清除能力、Fe2+還原能力呈顯著相關(guān)（P＜0.05），與DPPH 自由基清除能力呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），總黃酮含量與Fe2+還原能力呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），與DPPH、ABTS+自由基清除能力呈顯著相關(guān)（P＜0.05），提示百香果皮總酚對(duì)其發(fā)揮抗氧化能力貢獻(xiàn)突出，與Ghasemzadeh 等[31]發(fā)現(xiàn)總酚含量與抗氧化活性顯著相關(guān)的結(jié)果一致。

圖8 百香果皮各分級(jí)萃取物酚類(lèi)物質(zhì)含量與抗氧化活性相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis between phenolic components and antioxidant capacity of different fractional extracts from P.edulis peel

相關(guān)性分析結(jié)果表明異槲皮苷和異葒草苷為百香果皮抗氧化活性化學(xué)標(biāo)志物。異槲皮苷含量與ABTS+自由基清除能力和Fe2+還原能力顯著相關(guān)（P＜0.05），說(shuō)明異槲皮苷對(duì)百香果皮發(fā)揮抗氧化能力貢獻(xiàn)顯著。Xue 等[32]發(fā)現(xiàn)酚類(lèi)化合物糖基化對(duì)其抗氧化活性具有重要作用，異槲皮苷為C3-糖苷黃酮類(lèi)化合物，而C3-糖基化有利于穩(wěn)定糖苷的構(gòu)象，增強(qiáng)自由基清除能力，這可能是異槲皮苷與百香果皮抗氧化活性顯著相關(guān)的原因。異葒草苷含量與ABTS+自由基清除能力和鐵離子還原能力相關(guān)系數(shù)均高達(dá)0.99，與DPPH 自由基清除能力相關(guān)性也較高，提示異葒草苷也對(duì)百香果皮抗氧化活性有貢獻(xiàn)。多羥基賦予黃酮高的抗氧化、螯合和促氧化活性[33]，而且黃酮B 環(huán)的鄰二羥基結(jié)構(gòu)會(huì)進(jìn)一步提高其抗氧化能力[34]，這可能是異葒草苷對(duì)百香果皮發(fā)揮抗氧化活性起突出貢獻(xiàn)作用的原因。

3 結(jié)論

百香果皮粗提物多酚豐富，經(jīng)不同極性溶劑萃取后所得各部位的化合物和體外抗氧化活性均有差異，表明分級(jí)萃取能有效富集百香果皮各類(lèi)型多酚，因此開(kāi)發(fā)百香果皮抗氧化功能性產(chǎn)品時(shí)可進(jìn)行分級(jí)提取，提高其利用效率。粗提物CE 抗氧化活性弱于乙酸乙酯萃取物EE 和正丁醇萃取物BE，提示粗提物中存在不發(fā)揮抗氧化活性的化合物，且也存在分子間相互拮抗作用減弱其總抗氧化活性。乙酸乙酯可有效富集以C6～C1 構(gòu)型為主的酚酸類(lèi)化合物和黃酮醇類(lèi)化合物，表現(xiàn)出強(qiáng)于百香果皮粗提物的抗氧化能力，展現(xiàn)了開(kāi)發(fā)為百香果皮高品質(zhì)抗氧化相關(guān)產(chǎn)品的潛力。BE 差異酚類(lèi)物質(zhì)含量和抗氧化活性?xún)H次于EE，其酚類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)與含量豐富，且次級(jí)代謝物富集得率高，也是百香果皮抗氧化活性酚類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的高價(jià)值部位?？偡雍涂傸S酮是百香果皮發(fā)揮抗氧化能力的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，其中的異槲皮苷和異葒草苷是抗氧化活性化學(xué)標(biāo)志物。本研究為百香果皮抗氧化產(chǎn)品開(kāi)發(fā)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為促進(jìn)百香果產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)物的精準(zhǔn)高效開(kāi)發(fā)，科學(xué)拓展百香果產(chǎn)業(yè)鏈提供了支持。