張佳迪，程錦瀟，李華林，李芝萱，唐選明，耿新麗 ，潘艷芳,

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；2.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；3.新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所，新疆吐魯番 838200）

葉用萵苣（Lactuca sativaL.）俗稱生菜，是最常見的生食葉菜，維生素和膳食纖維含量豐富，具有調(diào)節(jié)酸堿平衡、提高免疫力、潤腸通便等功能[1]。但因其組織脆嫩、含水量高，采后極易失水萎蔫、黃化、腐爛變質(zhì)，導(dǎo)致貨架期短[2]。通過機械物理等技術(shù)手段開發(fā)生菜加工產(chǎn)品，不僅可以有效解決生菜產(chǎn)量過剩、采后腐爛等問題，還能豐富蔬菜加工制品種類[3]。鮮榨果蔬汁有“液體果蔬”之稱，可作為即食新鮮果蔬的替代品?，F(xiàn)行農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《非濃縮還原果蔬汁加工技術(shù)規(guī)程》（NY/T 3909-2021）[4]中明確，以水果、蔬菜為原料，通過機械方法直接制成的可發(fā)酵但未發(fā)酵的汁液制品為非濃縮還原（Not from concentrate，NFC）果蔬汁，而采用超高壓等非熱殺菌或巴氏殺菌的NFC 果蔬汁產(chǎn)品也可標(biāo)注為“鮮榨果蔬汁”。當(dāng)前市場以鮮榨水果汁為主，相比之下，鮮榨蔬菜汁具有低糖、低熱量、高膳食纖維等獨特優(yōu)勢，更符合未來消費者對天然風(fēng)味和營養(yǎng)健康的需求[5]。

不同于果汁加工工藝，蔬菜膳食纖維含量高、出汁率低[6]，且鮮榨加工過程中極易氧化褪綠，導(dǎo)致色澤等品質(zhì)下降[7]。漂燙處理一方面軟化蔬菜組織提高出汁率，另一方面可以鈍化多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）和過氧化物酶（Peroxidase，POD）等活性[8]，抑制色素氧化，使色素更容易溶出，降低營養(yǎng)成分的損失[9-14]。蔬菜汁破碎制汁后含有果膠、蛋白質(zhì)、膳食纖維等懸浮物質(zhì)，相互作用后形成不溶性的絮狀物質(zhì)而產(chǎn)生沉淀，影響蔬菜汁的感官品質(zhì)、貯藏性及商品性等。分離澄清技術(shù)可去除蔬菜汁中的果膠和懸浮物等，使得產(chǎn)品清透并且保持良好的感官品質(zhì)。殺菌是鮮榨生菜汁加工的必要和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響蔬菜汁的品質(zhì)和貨架期[15]。區(qū)別于傳統(tǒng)溫度較高或時間較長的熱殺菌造成鮮榨汁色澤、風(fēng)味、活性成分等的損失，超高壓（Ultra-high pressure，UHP）技術(shù)將果蔬汁密封包裝在密閉容器中，在100～1000 MPa的靜壓力下使果蔬制品中的細胞破碎、蛋白質(zhì)變性、淀粉糊化，并達到殺菌效果[16]，可最大程度保留產(chǎn)品原有的感官品質(zhì)和營養(yǎng)價值[17]。黃瓜汁飲料在500 MPa/2 min 的高壓處理后葉綠素含量與對照組無顯著差異，而85 ℃/15 s 的熱處理后葉綠素含量顯著下降[18]。

然而，以綠色葉菜為來源的鮮榨蔬菜汁尤其是鮮榨生菜汁市場缺乏，關(guān)鍵生產(chǎn)工藝對其制汁特性、品質(zhì)變化影響不明。因此，本實驗以綠蘿莎生菜為原料，探究漂燙、分離、殺菌三個關(guān)鍵生產(chǎn)工藝對鮮榨生菜汁色澤參數(shù)、理化指標(biāo)、葉綠素含量、酶活性及抗氧化能力的影響，闡明不同加工工藝對鮮榨生菜汁感官及品質(zhì)的影響，為鮮榨生菜汁規(guī)模化加工的質(zhì)量控制和品質(zhì)提升提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠蘿莎水培生菜 采于北京創(chuàng)世大業(yè)科技有限公司工業(yè)園區(qū)，選取綠色新鮮、生長周期（25±1）d、重量為（120±5）g 的綠蘿莎生菜，當(dāng)天采摘2 h 內(nèi)運回實驗室，現(xiàn)采現(xiàn)用；平板計數(shù)瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；無水乙醇、丙酮、濃硫酸、磷酸 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、考馬斯亮藍G-250 北京索萊寶科技有限公司；植物可溶性糖、總酚含量試劑盒、過氧化氫酶試劑盒、多酚氧化酶試劑盒、超氧陰離子清除能力試劑盒、總抗氧化能力試劑盒、羥基自由基清除能力試劑盒 蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

L12-P126 型高速破壁調(diào)理機 北京合千潤科貿(mào)有限公司；JML 型膠體磨 溫州市弘安機械有限公司；PAL-BX/ACID 5 型糖酸度計 日本愛拓公司；DigiEye 型電子眼 英國Verivide 公司；Sigma3k15臺式高速冷凍分離機 上海斯高勒生物科技有限公司；FiveEasy Plus pH 計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生菜汁的制備 鮮榨濁汁：選取無機械損傷的新鮮水培生菜，去根，清洗，瀝干水分，切段，打漿，過膠體磨，靜置1 h，2 層100 目過篩。

鮮榨清汁：將鮮榨生菜濁汁于6000×g 下4 ℃分離10 min，取上清，即得。漂燙濁汁：選取無機械損傷的新鮮水培生菜，去根，清洗，瀝干水分，切段，沸水中漂燙2 min，過冷水，瀝干水分，打漿，過膠體磨，靜置1 h，2 層100 目過篩，即得。漂燙清汁：將漂燙生菜濁汁于6000×g 下4 ℃分離10 min，取上清，即得。殺菌濁汁：將漂燙生菜濁汁罐裝于棕色瓶中，25 ℃下600 MPa 保壓120 s，即得。殺菌清汁：將漂燙生菜清汁罐裝于棕色瓶中，25 ℃下600 MPa 保壓120 s，即得。

將加工過程中得到的六種生菜汁樣品如圖1 所示，將其罐裝于棕色玻璃瓶中，一部分置于4 ℃冰箱，鮮樣待測（不超過3 d）。另一部分生菜汁樣品液氮速凍，置于-80 ℃待測。

圖1 生菜汁樣品Fig.1 Lettuce juice sample

1.2.2 微生物測定 根據(jù)（GB 4789.2-2016 和GB 4789.15-2016）[19-20]測定鮮榨生菜汁樣品中的總好氧菌（Total aerobic bacteria，TAB）及酵母菌和霉菌（Yeasts and molds，Y&M），分別吸取1 mL 樣品，平皿計數(shù)瓊脂和馬鈴薯葡萄糖瓊脂傾注平皿?？偤醚蹙冢?6±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（48±2）h。霉菌和酵母菌于（28±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（5±2）d。結(jié)果以每毫升生菜汁菌落形成單位數(shù)的十進制對數(shù)表示，為lgCFU/mL。

1.2.3 色澤測定 采用電子眼測定生菜汁的色度值，吸取5 mL 生菜汁樣品于35 mm 的培養(yǎng)皿中，電子眼拍照，分析生菜汁樣品的L*（明/暗）、a*（紅/綠）、b*（黃/藍）、C*（Chroma，飽和度）和h（Hue angle，色調(diào)）值。

1.2.4 可溶性固形物（Total soluble solids，TSS）、酸度（Acid）、pH 測定 TSS、Acid 通過手持式糖酸度儀測量，pH 用pH 計檢測。

1.2.5 葉綠素含量測定 參照Zhao 等[21]和El-nakhel等[22]方法檢測生菜汁樣品的葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素的含量。將500 mL 的生菜汁在10 mL 的丙酮（90%）中研磨，然后在3000×g 下離心10 min。收集上清液并再次加入丙酮（90%），直到達到25 mL的體積。用分光光度計在662、645 nm 的兩波長度下分別測量葉綠素a 和b 的吸光度。總?cè)~綠素被計算為葉綠素a 和b 的總和。葉綠素a 和b 的濃度用以下轉(zhuǎn)換公式計算。

1.2.6 可溶性糖含量測定 依據(jù)植物可溶性糖含量試劑盒說明書測定樣品的可溶性糖含量。

1.2.7 可溶性蛋白含量測定 牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0037x+0.0002，R2=0.9996。采用考馬斯亮藍法測定[23]，計算可溶性蛋白含量。

可溶性蛋白含量(mg/100 g)=100(m′×V)/(Vs×m×1000)

式中：m′—標(biāo)曲中查得的蛋白含量，μg；V—樣品提取液體積，mL；Vs—測定時所取樣品提取液體積，mL；m—樣品質(zhì)量，g。

1.2.8 總酚含量測定 依據(jù)總酚試劑盒說明書測定生菜汁樣品的總酚含量。

1.2.9 POD、PPO、CAT 活性測定 將生菜汁樣品液氮研磨并準(zhǔn)確稱取0.1 g，加入粗酶提取液（含1 mmoL PEG、4% PVPP 和1% Triton X-100）0.5 mL，在4 ℃下分離10 min，得上清液，依據(jù)試劑盒說明書測定POD、PPO、CAT 活性。

1.2.10 超氧陰離子自由基清除率、羥基自由基清除率和總抗氧化能力測定 依據(jù)試劑盒說明書測定超氧陰離子清除能力、羥基自由基清除能力、總抗氧化能力（DPPH 法）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗進行3～6 次重復(fù)，數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用OriginPro 9.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理與繪圖。采用SPSS 24.0 軟件檢驗不同樣品間差異顯著性，小寫字母不同表示在P＜0.05 水平上有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)鍵生產(chǎn)工藝對生菜汁微生物的影響

微生物指標(biāo)是評價果蔬汁安全性的基礎(chǔ)指標(biāo)，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《飲料》（GB 7101-2015）中微生物限量為：菌落總數(shù)≤2 lgCFU/mL、霉菌和酵母菌≤1.30 lgCFU/mL[24]。如圖2 所示，未處理組鮮榨生菜汁的初始TAB 和Y&M 分別為4.83±0.05、4.15±0.06 lgCFU/mL，均在國標(biāo)安全限量以上，存在較高的微生物安全風(fēng)險。分離工藝對生菜汁的TAB 和Y&M 無顯著影響（P＞0.05）。漂燙工藝顯著降低了生菜汁的TAB（P＜0.05），而對Y&M 無顯著影響（P＞0.05），漂燙對微生物的影響源于高溫導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、代謝酶失活以及DNA 損傷而殺滅微生物[25]。經(jīng)超高壓殺菌工藝后，生菜汁的TAB 和Y&M 顯著降低（P＜0.05），達到商業(yè)無菌狀態(tài)，該結(jié)果歸因于超高壓力使微生物代謝酶和蛋白質(zhì)的失活變性及對微生物細胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)完整性的破壞[5]。

圖2 鮮榨生菜汁的菌落總數(shù)、酵母和霉菌（n=3）Fig.2 TAB and Y&M of freshly-squeezed lettuce juice (n=3)

2.2 關(guān)鍵生產(chǎn)工藝對生菜汁色澤的影響

色澤直接影響鮮榨生菜汁的商品性和消費者的購買接受度。如圖1 和表1 所示，漂燙、分離和殺菌三種工藝均對生菜汁的L*、a*、b*、C*和h值等造成不同程度的影響。分離后的鮮榨清汁L*、a*、b*和C*值均顯著升高（P＜0.05），清汁更加明亮、綠色變淺、黃色加深和飽和度升高，這主要是由于清汁中的果肉含量少，葉綠素主要存在于果肉中，分離使得顯示綠色的葉綠素發(fā)生沉降，清汁中的葉綠素含量減少，綠色變淺而黃色加深。漂燙后生菜汁的L*、b*、C*和h值均升高，漂燙使得生菜汁更加明亮、黃色加深、顏色更加飽和且色調(diào)更加均勻，但是漂燙后生菜汁的a*值顯著下降（P＜0.05）。殺菌后生菜汁的a*值升高，表明殺菌使得生菜汁的綠色變淺。漂燙和殺菌使生菜汁的綠色更加濃郁，這可能是由于葉綠體中不同成分在高溫高壓下的分布變動，或者高溫使得葉綠素蛋白復(fù)合體中的蛋白變性導(dǎo)致葉綠素與蛋白質(zhì)分離生成游離葉綠素[26]。

表1 鮮榨生菜汁色澤參數(shù)變化Table 1 Changes of color parameters in freshly-squeezed lettuce juice

2.3 關(guān)鍵生產(chǎn)工藝對生菜汁理化指標(biāo)的影響

TSS 由游離或組合形式的還原糖和非還原糖組成，酸度表示酚酸和有機酸等的含量，糖酸比直接影響生菜汁的口感和風(fēng)味[27]。生菜汁中葉綠素降解包括酶促褐變和非酶促反應(yīng)，其中非酶促反應(yīng)中光、熱、氧和pH 均會誘導(dǎo)葉綠素降解[28]。如圖3 所示，三種工藝均對生菜汁的TSS 和Acid 影響較為顯著（P＜0.05），而對pH 的影響變化不大。圖3（a）顯示分離后鮮榨清汁的TSS 變化不大，漂燙和殺菌后生菜汁的TSS 顯著下降（P＜0.05），可能是由于漂燙和高壓造成植物細胞壁和細胞膜破裂，導(dǎo)致細胞內(nèi)溶物質(zhì)釋放[29-30]。圖3（b）顯示分離后鮮榨清汁的Acid 變化較小，漂燙和殺菌后生菜汁的Acid 顯著下降（P＜0.05），漂燙和殺菌顯著影響生菜汁的Acid 含量。圖3（c）顯示，三種關(guān)鍵工藝對生菜汁pH 影響變化不明顯，均在6 左右，表明加工過程對生菜汁的pH 影響較小，這與Helena 等[31]在菲油果汁加工中的研究結(jié)果一致。

圖3 鮮榨生菜汁TSS、Acid 和pH 變化Fig.3 Changes of TSS,Acid and pH in freshly-squeezed lettuce juice

2.4 關(guān)鍵生產(chǎn)工藝對生菜汁葉綠素含量的影響

與其他果蔬汁相比，生菜汁色澤為綠色是該產(chǎn)品的一大亮點和特色，而葉綠素是影響鮮榨生菜汁顏色變化的主要指標(biāo)之一[32]。如圖4 所示，分離后的清汁葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素含量顯著下降（P＜0.05），其中鮮榨濁汁的總?cè)~綠素含量從3.26±0.16 mg/100 g 下降到1.42±0.07 mg/100 g，表明分離對生菜汁葉綠素含量影響顯著，主要原因是分離使葉綠體沉降，導(dǎo)致葉綠素含量減少。Xu 等[33]研究表明獼猴桃濁汁的葉綠素含量經(jīng)分離工藝后降低了79.8%，與本研究結(jié)果一致。漂燙和殺菌后生菜濁汁的葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素含量均顯著升高（P＜0.05），漂燙和殺菌后濁汁的總?cè)~綠素含量分別為4.46±0.04 mg/100 g 和4.13±0.10 mg/100 g，分別升高了36.81%和26.69%，這可能是由于高溫高壓使得細胞結(jié)構(gòu)、細胞器膜等破壞，游離葉綠素溶出增加[34]。Sánchez 等[35]研究發(fā)現(xiàn)高壓處理使西蘭花葉綠素b 含量增加了20%、菠菜葉綠素a 含量增加了15%，與本研究結(jié)果一致。

圖4 鮮榨生菜汁葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素含量變化Fig.4 Changes of chlorophyll a,chlorophyll b and total chlorophyll content in freshly-squeezed lettuce juice

2.5 關(guān)鍵生產(chǎn)工藝對生菜汁可溶性糖、可溶性蛋白和總酚含量的影響

生菜汁可溶性糖、可溶性蛋白和總酚含量變化如圖5 所示。圖5（a）顯示，分離后鮮榨清汁的可溶性糖無顯著變化（P＞0.05），清汁可溶性糖的保留率達到98.8%，因此分離對鮮榨生菜汁可溶性糖含量影響不顯著。漂燙和殺菌后生菜濁汁的可溶性糖含量顯著降低（P＜0.05），保留率分別為91.24%和88.3%，可能是漂燙使得可溶性糖溶于漂燙液中以及高溫高壓使得糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。圖5（b）顯示，與鮮榨濁汁相比，分離后鮮榨清汁的可溶性蛋白含量顯著降低（P＜0.05），同時漂燙和殺菌后生菜濁汁的可溶性蛋白含量也顯著降低（P＜0.05）。漂燙濁汁和殺菌濁汁的可溶性蛋白的保留率分別為64.22%和60.60%，表明漂燙和殺菌顯著影響生菜汁的可溶性蛋白含量，可能與高溫高壓使得可溶性蛋白變性或溶出于漂燙液中有關(guān)[36]。

圖5 鮮榨生菜汁可溶性糖、可溶性蛋白和總酚含量變化Fig.5 Changes of soluble sugars,soluble proteins and total phenols content in freshly-squeezed lettuce juice

酚類化合物具有還原性、隔離活性氧、抗氧化和調(diào)節(jié)某些細胞酶活性等能力。圖5（c）顯示，分離對生菜汁總酚含量無顯著影響（P＞0.05），漂燙和殺菌后濁汁的總酚含量顯著降低（P＜0.05）。其中，漂燙使總酚含量從135.61±2.14 μg/mL 降低到63.31±0.78 μg/mL，降低了53.31%，殺菌使總酚含量從135.61±2.14 μg/mL 降低到59.28±1.71 μg/mL，降低了56.28%。先前研究表明，微波漂燙顯著降低了芒果、蘋果、香蕉和橙子的果皮總酚含量[37]。總酚含量的下降可能是漂燙和殺菌使通過醚、酯和碳-碳鍵與結(jié)構(gòu)蛋白、纖維素和果膠等大分子結(jié)合酚類化合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)被破壞而釋放、多酚類化合物降解轉(zhuǎn)化，影響了酚類化合物的組成[38]。

2.6 關(guān)鍵生產(chǎn)工藝對生菜汁酶活性的影響

酶促褐變是造成生菜汁色澤變化的因素之一，主要由PPO 和POD 在氧氣條件下將生菜汁中的酚類物質(zhì)氧化為活性較強的醌類物質(zhì)，并進一步發(fā)生褐變[39]。CAT 廣泛存在于植物體中，用于去除過氧化氫，有利于生菜汁的抗氧化性。關(guān)鍵生產(chǎn)工藝對生菜汁PPO、POD 和CAT 酶活性的影響如圖6 所示，分離后鮮榨清汁的PPO 活性無顯著變化（P＞0.05），表明PPO 主要存在于生菜汁溶液中，而分離后清汁的POD 和CAT 活性分別降低了8.16%和61.32%，表明POD 和CAT 主要存在于懸浮物質(zhì)和果肉中，分離降低了二者活性。漂燙和殺菌后濁汁的PPO、POD 和CAT 三種酶活性顯著降低（P＜0.05），漂燙使PPO、POD 和CAT 的失活率分別達到83.76%、84.87%和90.80%，殺菌使PPO、POD 和CAT 的失活率分別為85.83%、99.10%和97.83%。漂燙和殺菌對生菜汁酶活性的作用顯著，這是由于高溫高壓使酶結(jié)構(gòu)改變、活性鈍化。先前同樣有研究報道漂燙工藝顯著降低了甘蔗汁的PPO 和POD 活性[40]。

圖6 鮮榨生菜汁PPO、POD 和CAT 活性變化Fig.6 Changes of PPO,POD and CAT activities in freshlysqueezed lettuce juice

2.7 關(guān)鍵生產(chǎn)工藝對生菜汁抗氧化能力的影響

關(guān)鍵生產(chǎn)工藝對生菜汁抗氧化能力的影響如圖7 所示，分離對生菜汁的羥基自由基清除率無顯著影響（P＞0.05）。漂燙后濁汁的超氧陰離子清除率略有上升，而羥基自由基清除率顯著升高（P＜0.05），表明漂燙可以提高生菜汁的羥基自由基清除率。殺菌后濁汁的羥基自由基清除率和超氧陰離子清除率均顯著上升（P＜0.05）。鮮榨濁汁的抗氧化能力為0.23±0.02 μmol Trolox/mL，分離、漂燙和殺菌后生菜汁的抗氧化能力分別降低了34.78%、82.61%和73.91%，漂燙和殺菌均顯著降低了生菜汁的抗氧化能力（P＜0.05）。先前研究表明，超高壓及高溫短時處理均降低了菠蘿果汁中的抗氧化能力[41]，與本研究結(jié)果一致。生菜汁的抗氧化活性降低可能與酚類化合物的損失有關(guān)[42]。

圖7 鮮榨生菜汁羥基自由基清除率、超氧陰離子清除率和總抗氧化能力變化Fig.7 Changes of hydroxyl radical scavenging,superoxide anion scavenging and total antioxidant capacity in freshlysqueezed lettuce juice

3 結(jié)論

本研究從微生物、色澤參數(shù)、理化指標(biāo)、營養(yǎng)物質(zhì)等方面探究了漂燙（95 ℃/2 min）、分離（6000×g/10 min）、殺菌（600 MPa，25 ℃/2 min）三個關(guān)鍵生產(chǎn)工藝對鮮榨生菜汁品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，分離和漂燙后的生菜汁仍存在微生物安全風(fēng)險，而經(jīng)殺菌工藝后鮮榨生菜汁總好氧菌小于2 lgCFU/mL，霉菌和酵母菌小于1.3 lgCFU/mL，達到商業(yè)無菌狀態(tài)。因此，殺菌是鮮榨生菜汁加工的必要環(huán)節(jié)。分離工藝顯著影響生菜汁的色澤參數(shù)，鮮榨清汁色澤更加明亮、綠色變淺、飽和度升高，總?cè)~綠素含量下降了56.44%。漂燙工藝對鮮榨生菜汁PPO、POD 和CAT 的失活率分別達到83.76%、84.87%和90.80%，a*值顯著降低，綠色更加明亮。因此，漂燙主要通過鈍化生菜內(nèi)源性酶活性，保持生菜汁鮮綠色澤。此外，漂燙和殺菌工藝均顯著影響了生菜汁的活性成分和抗氧化能力，總酚含量分別損失了53.31%和56.28%，抗氧化能力分別降低了82.61%和73.91%。本研究可為鮮榨生菜汁規(guī)模化加工的質(zhì)量控制和品質(zhì)提升提供理論依據(jù)，研究結(jié)果也可推廣應(yīng)用到其他葉類蔬菜加工。