黃慧芹，徐友強(qiáng),2, ，李微微,2，張成楠,2，朱 華，王紅安，李秀婷,2

（1.北京工商大學(xué)食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048；2.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048；3.北京華都釀酒食品有限責(zé)任公司，北京 102212）

傳統(tǒng)發(fā)酵白酒是中國特色蒸餾酒，生產(chǎn)歷史悠久[1]。由于自然環(huán)境、原料、發(fā)酵劑的種類和生產(chǎn)工藝不同，白酒形成了許多風(fēng)格獨(dú)特的香型[2]。隨著白酒研究的不斷深入，人們也認(rèn)識到不同香型白酒風(fēng)味的形成與發(fā)酵微生物的組成和演替變化是緊密相關(guān)的。作為三大基本香型之一，醬香型白酒以優(yōu)雅獨(dú)特的醬香味著稱[3]，發(fā)酵過程需要一年時(shí)間，期間需要經(jīng)歷7 輪次取酒[4]。普遍認(rèn)為，第一輪、第二輪的基酒澀味大，這很可能是由于原料高粱中的化學(xué)物質(zhì)單寧和多酚引起的，這些化學(xué)物質(zhì)可以通過蒸餾遷移到基酒中，第三、第四和第五輪的基酒質(zhì)量較好[5]，又稱為“大回酒”，而第六輪和第七輪基酒質(zhì)量再度變差，有苦味和焦糊的味道[6]。綜合比較，第四輪次的基酒風(fēng)味最為突出[7-8]，作為醬香型白酒勾調(diào)過程中最重要的組成部分，具有較高的研究價(jià)值。

微生物的代謝是醬香型白酒釀造過程物料轉(zhuǎn)化的內(nèi)在動力[9]，在整個(gè)釀造周期中，微生物種類和豐度處于動態(tài)變化之中，影響最終風(fēng)味化合物的形成。醬香型白酒釀造工藝復(fù)雜，條件獨(dú)特，釀造過程的微生物來源主要包括大曲、酒醅和環(huán)境微生物三部分。在堆積發(fā)酵的整個(gè)過程中，酒醅暴露在開放式環(huán)境中，富集了許多環(huán)境中的微生物，這些微生物參與到后續(xù)入窖發(fā)酵過程中，賦予輪次酒獨(dú)特風(fēng)味[10]。例如，王琳等[11]對茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒的七個(gè)輪次發(fā)酵的釀造環(huán)境進(jìn)行細(xì)菌菌群分析，在第四輪次中發(fā)現(xiàn)特殊菌屬Corynebacterium（棒狀桿菌屬），可利用環(huán)境中的碳源發(fā)酵產(chǎn)生賴氨酸改善酒的風(fēng)味；張春林等[12]對第二輪次堆積發(fā)酵酒醅進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)對風(fēng)味形成影響最大的微生物為Bacillus（芽孢桿菌屬）、Emericella（裸胞殼屬）、Oceanobacillus（海洋芽孢桿菌屬）；胡小霞等[13]對堆積和窖池發(fā)酵過程的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，入窖發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性和豐度均低于堆積發(fā)酵，即堆積發(fā)酵中富集的微生物需要在入窖發(fā)酵過程中進(jìn)一步演替。這些研究表明，分析入窖之后酒醅發(fā)酵過程中微生物及風(fēng)味物質(zhì)變化具有重要意義，有助于合理調(diào)節(jié)白酒發(fā)酵過程，提高醬香型白酒產(chǎn)品質(zhì)量。團(tuán)隊(duì)前期研究[14]發(fā)現(xiàn)第五、六輪次酒醅中的優(yōu)勢細(xì)菌屬均為Lactobacillus（乳芽孢桿菌屬）、Oceanobacillus（海洋芽孢桿菌屬）、Virgibacillus（枝芽孢桿菌屬），但入窖發(fā)酵過程中豐度并不一致，第六輪次優(yōu)勢真菌屬為Issatchenkia（伊薩酵母屬）、Thermoascus（嗜熱子囊菌屬）和Byssochlamys（絲衣菌屬），而Thermoascus（嗜熱子囊菌屬）和Aspergillus（曲霉屬）的對應(yīng)豐度遠(yuǎn)低于第五輪，并提出第六輪次入窖酒醅中酯合成真菌的減少可能是酯類風(fēng)味物質(zhì)濃度下降的原因。團(tuán)隊(duì)近期研究[15]通過分析前三輪次入窖酒醅的微生物和風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)第三輪入窖酒醅中的風(fēng)味物質(zhì)濃度有所提高，提出風(fēng)味物質(zhì)的變化是第三輪次基酒質(zhì)量提高的重要原因。然而，總體來講目前對于醬香型白酒入窖酒醅發(fā)酵過程的研究較少，限制了人們對發(fā)酵過程的科學(xué)認(rèn)知，特別是對于關(guān)鍵輪次第四輪次入窖酒醅發(fā)酵過程中微生物和風(fēng)味物質(zhì)的變化尚未見報(bào)道。

本文通過高通量測序技術(shù)對北京地區(qū)醬香型白酒第四輪次入窖發(fā)酵過程中酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，分析了微生物菌群的演替變化；利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對酒醅的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行了定性和相對定量分析。通過分析白酒發(fā)酵過程中微生物及風(fēng)味物質(zhì)的變化，定位核心微生物，探討微生物與風(fēng)味物質(zhì)的相互關(guān)聯(lián)，從中挖掘與風(fēng)味相關(guān)的功能微生物，有助于為后續(xù)通過功能微生物理性擾動發(fā)酵體系，為提高北京地區(qū)醬香型白酒的產(chǎn)品品質(zhì)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磷酸緩沖液、Taq DNA 聚合酶試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；4-辛醇（色譜級）天津福晨化學(xué)試劑有限公司；瓊脂糖 南京生興生物技術(shù)有限公司；50×TAE 緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；DNA Marker Takara；核酸染料Gengreen 上海賽百盛有限公司；引物 上海捷瑞生物工程股份有限公司；E.Z.N.A.Soil DNA Kit 試劑盒 Omega Bio-Tek公司。

CP153 電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；T100-Thermal Cycler PCR 儀 美國Bio-Rad 公司；EPS301 瓊脂糖凝膠電泳儀 北京六一儀器廠；YXQ-LS-50SII 立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Aquaplore3S 超純水系統(tǒng)美國艾科浦公司；KQ5200DA 超聲波清洗儀 上海超聲儀器廠；GC 7890-5975 MSD 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抽樣方法 酒醅樣品采自北京華都酒廠窖池發(fā)酵生產(chǎn)車間2020 年第四輪次12 號南池入窖發(fā)酵酒醅，入窖前已提前進(jìn)行5 d 的薄層堆積發(fā)酵。根據(jù)前期研究基礎(chǔ)[15]，入窖酒醅選取入窖0、7、14、21、30 d 為取樣時(shí)間點(diǎn)，15 點(diǎn)取樣，窖池發(fā)酵周期為30 d。在每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)取樣時(shí)，按酒醅上、中、下三個(gè)層面，每個(gè)層面選擇中間及四周邊緣位置采取樣品，取樣位點(diǎn)參考圖1，各層樣品混勻后作為一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的取樣樣品。將采集的樣品分為兩份：一份用于提取總DNA，另一份儲存在-80 ℃用于進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析。

圖1 醬香型白酒第四輪次入窖酒醅取樣位點(diǎn)參考Fig.1 Sampling sites of Sauce-flavored Baijiu in the fourthround of cellar

1.2.2 樣品DNA 提取和PCR 擴(kuò)增 通過E.Z.N.A.Soil DNA Kit 提取試劑盒提取酒醅樣品中的微生物宏基因組，提取步驟參照說明書。根據(jù)前期研究方法[16]進(jìn)行基因擴(kuò)增，細(xì)菌擴(kuò)增16S rRNA 基因所用引物，338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT-3'）；真菌擴(kuò)增18S rRNA 基因所用引物，ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'），使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶大小。

基因PCR 體系如表1 所示；基因擴(kuò)增方法如表2 所示。

表1 PCR 反應(yīng)體系Table 1 PCR reaction system

表2 PCR 反應(yīng)程序Table 2 PCR reaction procedure

1.2.3 Illumina 公司MiSeq 測序 將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物等分子量匯集在Illumina MiSeq PE300 平臺/NovaSeq PE250 平臺（Illumina，上海），并根據(jù)上海Majorbio生物制藥科技有限公司（中國，上海）的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行配對端測序。原始測序數(shù)據(jù)已提交到NCBI SRA 數(shù)據(jù)庫，提交編號為SUB8652827。

1.2.4 揮發(fā)性化合物的提取與分析 結(jié)合宮俐莉等[17]的研究，本研究通過頂空-固相微萃取分析揮發(fā)性化合物。樣品前處理方法參照李鳳蘭等[5]的研究進(jìn)行：準(zhǔn)確稱取2.00 g 酒醅樣品于20 mL 頂空瓶中，向其中加入5 mL 的飽和氯化鈉溶液，加入6 μL 4-辛醇（0.5 mg/mL）作為內(nèi)標(biāo)物，以90 W 功率超聲10 min。頂空-固相微萃取使用TG-5MS 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，J&W Science，F(xiàn)olsom，CA，USA），通過火焰電離檢測器分析風(fēng)味化合物。氣相色譜條件：溫度以2 ℃/min 的速率升至100 ℃并保持5 min，然后以2 ℃/min 的速率升至150 ℃并保持2 min，最后以10 ℃/min 速率升至230 ℃并保持5 min。氦氣載氣的流速為1.5 mL/min。質(zhì)譜采用電子轟擊電離（EI）離子源，離子源溫度230 °C，電子能量70 eV，離子掃描范圍為35～450 m/z。風(fēng)味成分的鑒定通過與NIST 11 a.L 數(shù)據(jù)庫（安捷倫科技公司）中的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖進(jìn)行比對，使用內(nèi)標(biāo)法對風(fēng)味化合物進(jìn)行相對定量分析。通過自動積分程序獲得各色譜峰的面積，計(jì)算樣品中各組分峰面積分別與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積之比，定量各風(fēng)味組分的含量。酒醅中風(fēng)味物質(zhì)的定量數(shù)據(jù)處理主要采用Microsoft Office Excel 2021 應(yīng)用程序進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，通過TBtools、R 語言完成相關(guān)圖形的繪制。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有測定平行三次進(jìn)行，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。方差分析使用SPSS 26.0 軟件（SPSS Inc.，美國伊利諾伊州芝加哥）進(jìn)行。使用Origin 8.5 軟件進(jìn)行揮發(fā)性成分分析和微生物圖譜分析。采用Pheatmap 軟件包進(jìn)行相關(guān)性分析，使用相關(guān)熱圖進(jìn)行可視化，分析風(fēng)味物質(zhì)與微生物之間的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 第四輪次釀造過程中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性

2.1.1 細(xì)菌多樣性 稀釋曲線可以比較不同的測量數(shù)據(jù)樣本的物種豐富度，也可以說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理，圖2 中稀釋性曲線趨于平坦，說明測序的數(shù)據(jù)量和豐富度是合理的[18]。圖2a 展示了醬香型白酒第四輪次入窖酒醅細(xì)菌樣本的稀釋曲線在測序數(shù)5000 時(shí)驟增，后逐漸趨于平坦，這表明本實(shí)驗(yàn)的各細(xì)菌樣本測序數(shù)據(jù)量合理，測序深度達(dá)到要求，與實(shí)際生物信息相符合。利用Shannon 曲線對不同樣本的物種多樣性進(jìn)行了比較，如圖2b 所示，所有樣本中細(xì)菌的Shannon 曲線在測序數(shù)1000 左右時(shí)驟增，后變得平坦，說明測量數(shù)據(jù)的量可以覆蓋樣本中絕大多數(shù)細(xì)菌多樣性信息，測序數(shù)據(jù)量和深度是可靠的。實(shí)際測量結(jié)果可以代表樣本的實(shí)際情況。

圖2 醬香型白酒第四輪次入窖酒醅的細(xì)菌樣本基于Sobs 指數(shù)與Shannon 指數(shù)的稀釋曲線圖Fig.2 Dilution plots of bacterial samples of the fourth round Jiupei of sauce-flavored Baijiu based on the Sobs index and the Shannon index

門水平上，在醬香型白酒第四輪次入窖酒醅中共檢出16 個(gè)細(xì)菌門。圖3a 展示了酒醅中相對豐度大于1%的細(xì)菌門，有Firmicutes（厚壁菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Actinobacterieta（放線菌門）。在整個(gè)發(fā)酵期間，F(xiàn)irmicutes（厚壁菌門）一直處于絕對的優(yōu)勢地位，平均相對豐度＞85%，該結(jié)果與醬香型白酒（山東產(chǎn)區(qū)）[19]、清香型白酒[20]、濃香型白酒[21]、芝麻香型白酒[22]研究結(jié)論一致。在醬香型、芝麻香型、清香型白酒釀造過程中發(fā)現(xiàn)Firmicutes（厚壁菌門）也是主要細(xì)菌門，說明Firmicutes 是中國白酒發(fā)酵過程中的關(guān)鍵微生物。不同的是，南方產(chǎn)區(qū)的醬香型白酒優(yōu)勢細(xì)菌門有兩種，研究發(fā)現(xiàn)貴州產(chǎn)區(qū)的醬香型白酒發(fā)酵過程中，F(xiàn)irmicutes（厚壁菌門）、Proteobacteria（變形菌門）兩個(gè)門占主導(dǎo)地位[9]。以上結(jié)果表明白酒發(fā)酵中后期（14～30 d），細(xì)菌門水平群落多樣性降低，發(fā)酵微生態(tài)結(jié)構(gòu)由多菌系演替為單一的Firmicutes（厚壁菌門）為主導(dǎo)的發(fā)酵模式，是白酒酒醅發(fā)酵細(xì)菌門水平演替的普遍模式。目水平上，共檢出89 個(gè)細(xì)菌目，豐度大于1%的有9 個(gè)，包括Lactobacillales（乳酸桿菌目）、Bacillales（桿菌目）、Thermoactinomycetales（熱放線菌目）、Pseudomonadales（假單胞菌目）、Propionibacteriales（丙酸桿菌目）、Burkholderiales（伯克霍爾德氏菌目）、Staphylococcales（葡萄球菌目）、Acetobacterales（醋酸菌目）、Enterobactrales（腸桿菌目）（如圖3b 所示）。在發(fā)酵前期（1～14 d），Lactobacillales（乳酸桿菌目）相對豐度較低，Bacillales（桿菌目）則相對豐度較高，其次是Thermoactinomycetales（熱放線菌目）。發(fā)酵14 d，細(xì)菌物種多樣性豐富且相對豐度分布比較多樣。之后，Lactobacillales（乳酸桿菌目）相對豐度顯著增加，說明此時(shí)的環(huán)境適宜乳酸桿菌的生長，此時(shí)窖池處于厭氧環(huán)境，厭氧型細(xì)菌成為優(yōu)勢種群出現(xiàn)，且一直持續(xù)到出窖階段。屬水平上，共檢出260 個(gè)細(xì)菌屬，豐度大于1%的有16 個(gè)，如圖3c 所示，其中平均相對豐度較高的10 個(gè)菌屬包括Lactobacillus（乳酸桿菌屬）、Virgibacillus（枝芽孢桿菌屬）、Kroppenstedtia（克羅彭斯特菌屬）、Oceanobacillus（海洋芽孢桿菌屬）、Bacillus（芽孢桿菌屬）、Thermoactinomyces（高溫放線菌屬）、Pseudomtonas（假單胞菌屬）、unclassified_f_Bacillacese（未分類芽孢細(xì)菌屬）、Scopulibacillus（火山渣芽胞桿菌屬）、Ralstonia（羅爾斯通菌屬）。其中，Lactobacillus（乳酸桿菌屬）占細(xì)菌數(shù)量的3.55%～89.96%，平均相對豐度為67.70%，入窖初期相對含量較低，在入窖第21 d 達(dá)到最高值，后期保持在較高水平。Virgibacillus（枝芽孢桿菌屬）占細(xì)菌數(shù)量的2.90%～26.32%，平均相對豐度為14.28%，Kroppenstedtia（克羅彭斯特菌屬）占細(xì)菌數(shù)量的2.32%～25.57%，平均相對豐度為10.70%，兩個(gè)菌屬在入窖初期相對含量較高，相對豐度均在入窖第21 d開始降低。

圖3 醬香型白酒第四輪次入窖酒醅中門、目、屬水平細(xì)菌群落組成Fig.3 Composed of bacterial communities in the middle of the door,order and genus of the fourth round Jiupei of sauce-flavored Baijiu

發(fā)酵0 d 時(shí)，酒醅中Virgibacillus（枝芽孢桿菌屬）相對豐度最高，Kroppenstedtia（克羅彭斯特菌屬）、Oceanobacillus（海洋芽孢桿菌屬）、Lactobacillus（乳桿菌屬）、Bacillus（芽孢桿菌屬）和Thermoactinomyces（熱放線菌屬）依次降低。在發(fā)酵第7 d，Lactobacillus（乳桿菌屬）在酒醅中的相對豐度明顯增大，Virgibacillus（枝芽孢桿菌屬）、Kroppenstedtia（克羅彭斯特菌屬）、Oceanobacillus（海洋芽孢桿菌屬）的相對豐度均降低。發(fā)酵14 d，豐度小于1%的其余細(xì)菌總相對豐度占比增加。與目水平一致的是，發(fā)酵前期（0～7 d）以Virgibacillus（枝芽孢桿菌屬）和Kroppenstedtia（克羅彭斯特菌屬）兩個(gè)為優(yōu)勢屬，14 d 始，Lactobacillus（乳桿菌屬）演替為絕對的優(yōu)勢屬，這表明細(xì)菌在整個(gè)發(fā)酵階段以發(fā)酵14 d為分界線出現(xiàn)了明顯的優(yōu)勢屬的交替，在第一、二、五、六輪次的發(fā)酵14 d 入窖酒醅中均發(fā)生了優(yōu)勢屬Lactobacillus的相對豐度明顯升高的現(xiàn)象[14-15]。

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵中后期Lactobacillus（乳桿菌屬）相對豐度增加，尤其是發(fā)酵第14 d 開始相對豐度顯著增加，且一直維持到出窖，這期間窖池處于厭氧狀態(tài)，適應(yīng)厭氧呼吸的乳桿菌屬快速生長，一些好氧或兼性好氧性細(xì)菌生長受到抑制，這也是細(xì)菌演替變化的表現(xiàn)，在王玉榮等[23]的研究中也發(fā)現(xiàn)Lactobacillus為第四輪次出窖酒醅中的絕對優(yōu)勢細(xì)菌屬。而作為好氧的枝芽孢桿菌屬則是呈現(xiàn)明顯的減少趨勢，與乳桿菌屬相比，幾乎呈現(xiàn)完全相反的變化趨勢。研究將平均相對豐度＞1%且至少在50%的樣品中豐度超過1%的微生物定義為核心微生物[24-25]，本文將醬香型白酒第四輪次入窖酒醅的優(yōu)勢細(xì)菌屬定位到乳桿菌屬和芽孢桿菌屬，這兩種優(yōu)勢細(xì)菌屬在多種香型白酒發(fā)酵過程均有報(bào)道[19-20,22,26]。芽孢桿菌可代謝產(chǎn)生多種水解發(fā)酵原料的酶類，包括淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等，發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生吡嗪類、有機(jī)酸等風(fēng)味物質(zhì)，對于白酒風(fēng)味具有重要影響[27-29]。乳桿菌屬在發(fā)酵過程中利用糖類產(chǎn)生乳酸，為乳酸乙酯的合成提供前體物質(zhì)，提高了酒體的醇厚感，其產(chǎn)生的有機(jī)酸類也與酒體酸味呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性[26,30]。此外，與南方醬香型白酒發(fā)酵中優(yōu)勢細(xì)菌屬相比[12]，Virgibacillus（枝芽孢桿菌屬）、Oceanobacillus（海洋芽孢桿菌屬）、Ralstonia（羅爾斯通菌屬）是北京地區(qū)醬香型白酒發(fā)酵中獨(dú)有的優(yōu)勢細(xì)菌屬，而這些特有菌屬在白酒釀造中的功能及對白酒風(fēng)味的貢獻(xiàn)尚無深入研究。以上結(jié)果表明北京地區(qū)醬香型白酒發(fā)酵優(yōu)勢細(xì)菌屬除了具有和南方地區(qū)醬香型白酒發(fā)酵的優(yōu)勢共性細(xì)菌屬外，還存在著其所特有的優(yōu)勢細(xì)菌屬（圖3c）。

2.1.2 真菌多樣性 如圖4a 所示為醬香型白酒第四輪次入窖酒醅中所測樣品的真菌Sobs 指數(shù)稀釋曲線，各真菌樣本的測序數(shù)據(jù)量合理，測序深度足夠，與實(shí)際生物信息相符合。如圖4b 所示，所有樣品的真菌Shannon 曲線在測序數(shù)在1000 左右時(shí)均趨向平坦，說明本實(shí)驗(yàn)中樣本的測序數(shù)據(jù)量足夠大，已經(jīng)覆蓋了樣本中絕大多數(shù)真菌的多樣性信息，結(jié)果科學(xué)可靠。

圖4 醬香型白酒第四輪次入窖酒醅的真菌樣本基于Sobs 指數(shù)與Shannon 指數(shù)的稀釋曲線圖Fig.4 Dilution plots of fungal samples of the fourth round Jiupei of sauce-flavored Baijiu based on the Sobs index and the Shannon index

門水平上，在醬香型白酒第四輪次入窖發(fā)酵酒醅中共檢測到7 個(gè)門，其中豐度大于1%的真菌門包含Ascomycota（子囊菌門）、Basidiomycota（擔(dān)子菌門）（圖5a）。其中，Ascomycota（子囊菌門）在醬香型白酒第四輪次入窖發(fā)酵過程中相對豐度達(dá)95%以上，占絕對主導(dǎo)地位，這與戴亦杰[31]研究結(jié)果相同，說明在白酒發(fā)酵過程中，真菌門水平群落多樣性較低，發(fā)酵微生態(tài)結(jié)構(gòu)是由Ascomycota 和Basidiomycota 為主導(dǎo)的真菌微生物組合。

圖5 醬香型白酒第四輪次入窖酒醅中門、目、屬水平真菌群落組成Fig.5 Composed of fungal communities in the middle of the door,order and genus of the fourth round Jiupei of sauce-flavored Baijiu

目水平上，共檢出36 個(gè)真菌目，豐度大于1%的有7 個(gè)，包括Eurotiales（散囊菌目）、Saccharomycetales（酵母菌目）、unclassified_p_Ascomycota（未分類子囊菌目）、Trichosporonalles（毛孢菌）、Microascales（小囊菌目）、Hypocreales（肉座菌目）、Pleosporales（格孢腔菌目）（圖5b）。在發(fā)酵期間，Eurotiales 相對豐度呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定的趨勢，在第21 d處于最高值。相反的，Saccharomycetales 的相對豐度逐漸減小，同樣，在第30 d 達(dá)到最小值。在目水平上，Eurotiales 和Saccharomycetales 占據(jù)絕對優(yōu)勢。

屬水平上共檢出169 個(gè)真菌屬，豐度大于1%的有16 個(gè)，其中排名前10 的包括Thermoascus（嗜熱子囊菌屬）、Aspergillus（曲霉屬）、Issatchenkia（伊薩酵母屬）、Pichia（畢赤酵母屬）、Thermomyces（嗜熱真菌屬）、Rasamsonia、unclassified_o_Saccharomycetales（未分類酵母菌屬）、Monascus（紅曲霉屬）、Byssochlamys（絲衣霉屬）、Penicillium（青霉屬）（圖5c）。其中，Thermeascus（嗜熱子囊菌屬）占真菌數(shù)量的15.34%～45.46%，平均相對豐度為35.40%，在入窖第14 d 達(dá)到最高值。Aspergillus（曲霉屬）占真菌數(shù)量的3.44%～20.74%，平均相對豐度為14.76%，在入窖第7 d 相對含量開始劇增，在第14 d 達(dá)到最高值。Issatchenkia（伊薩酵母屬）占真菌數(shù)量的2.46%～35.92%，平均相對豐度為14.45%，在發(fā)酵前期相對豐度較高，后逐步下降。在整個(gè)發(fā)酵期間，Thermeascus（嗜熱子囊菌屬）、Aspergillus（曲霉屬）相對豐度呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，相反的，Issatchenkia（伊薩酵母屬）相對豐度呈現(xiàn)減少的趨勢，這與目水平的結(jié)果一致，也進(jìn)一步說明了Thermeascus（嗜熱子囊菌屬）、Aspergillus（曲霉屬）和Issatchenkia（伊薩酵母屬）均為優(yōu)勢屬。

真菌的代謝活動產(chǎn)生了豐富的酶類物質(zhì)，如酸性蛋白酶、纖維素酶、糖化酶、液化酶、酯化酶等，這些酶類物質(zhì)對于糧食中大分子的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、淀粉、脂質(zhì)等起到了一定的轉(zhuǎn)化作用[32]。雖然不同香型白酒主要的香味物質(zhì)不同，但它們共同的特點(diǎn)是大部分都來自于釀造過程中微生物的代謝，真菌群落組成結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，霉菌、酵母菌占比較大，這與后期白酒的酒精含量和香氣成分緊密相關(guān)。酵母菌和霉菌作為主要的功能菌，酵母菌通過代謝活動產(chǎn)生酒精，霉菌則為發(fā)酵前期生成有機(jī)酸和酯類物質(zhì)的主要菌種[33]。在醬香型白酒的生產(chǎn)中，通過吸附萃取和熱脫附結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用儀測定白酒中酯類成分，可以發(fā)現(xiàn)霉菌不僅代謝產(chǎn)生檸檬酸、葡萄糖酸、草酸等有機(jī)酸，還能生成淀粉酶、蛋白酶等酶制劑[34]。綜合分析上述結(jié)果，醬香型白酒第四輪次入窖發(fā)酵酒醅中的核心微生物包括細(xì)菌屬的Lactobacillus（乳酸桿菌屬）、Kroppenstedtia（克羅彭斯特菌屬）、Virgibacillus（枝芽孢桿菌屬），以及真菌屬的Thermeascus（嗜熱子囊菌屬）、Issatchenkia（伊薩酵母屬）、Aspergillus（曲霉屬）。醬香型白酒第四輪次入窖酒醅中，與細(xì)菌多樣性相比，真菌的多樣性差異較小，其余輪次中酒醅的微生物多樣性與第四輪次類似，也表現(xiàn)為真菌多樣性低于細(xì)菌多樣性的特征[14-15]。

2.2 第四輪次釀造過程中風(fēng)味物質(zhì)變化

2.2.1 白酒發(fā)酵過程酒醅風(fēng)味物質(zhì)分析 第四輪次酒醅樣品共檢出50 種揮發(fā)性物質(zhì)，包含酯類28 種、醇類9 種、脂肪酸5 種、醛類2 種、其他化合物6 種。表3 展示了酒醅中揮發(fā)性化合物的相對含量， 其中酯類占比最高，其次是醇類和酸類。在白酒發(fā)酵過程中醇類、酯類、酸類化合物的含量隨著入窖發(fā)酵時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的規(guī)律，而總酯相對含量在每一個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)都較高。

表3 基于氣相色譜-質(zhì)譜分析的樣品揮發(fā)性化合物含量（mg/kg）Table 3 Volatile compound content of samples based on GC-MS spectrometry (mg/kg)

發(fā)酵30 d 時(shí)酒醅中揮發(fā)性化合物中，酯類物質(zhì)的種類是所有測出的揮發(fā)性成分中最豐富的。我國的白酒與其他蒸餾酒的不同之一就是以酯香為主，尤其是體現(xiàn)在醬香型白酒中[35]，大回酒酒質(zhì)較好就是由于酯類、酸類物質(zhì)占比高[36]。戴奕杰等[37]的研究顯示在酒質(zhì)較好的“大回酒”中，四大酯（乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯）的含量達(dá)到了釀造過程中的最高含量。本研究中乳酸乙酯（7.01±0.70 mg/kg）含量最高，其次是（E）-9-十八烯酸乙酯（3.31±0.64 mg/kg）、己酸乙酯（1.30±0.21 mg/kg）、琥珀酸二乙酯（0.87±0.05 mg/kg）、乙酸乙酯（0.31±0.02 mg/kg）等，均高于前三輪次入窖酒醅相應(yīng)的酯含量[15]，為醬香型白酒提供酯香風(fēng)味。其中，乳酸乙酯含量由0 d 的2.99±0.17 mg/kg 提高到7.01±0.70 mg/kg；己酸乙酯含量由0.17±0.01 mg/kg 提高到1.30±0.21 mg/kg；乙酸乙酯含量由0.12±0.01 mg/kg 提高到0.31±0.02 mg/kg。醇類在21 d 含量最高，其中乙醇含量最高，其次為苯乙醇、糠醇、正戊醇、異戊醇、苯甲醇。其中乙醇含量由 0 d 的 3.75±0.28 mg/kg 增加到 21 d 的5.68±0.75 mg/kg，此后含量基本穩(wěn)定不變；苯乙醇是除乙醇以外含量最高的醇類物質(zhì)，含量由 0 d 的 2.90±0.19 mg/kg 增加到 30 d 的 4.28±0.27 mg/kg，在發(fā)酵后期（21～30 d）基本保持不變。高級醇在形成酒的味道、提高酒的豐滿度和厚重感方面起著重要作用，它不僅本身可以呈香呈味，而且是白酒中甜味劑和助香劑的主要來源[38-39]。21 d 酒醅中酸性物質(zhì)含量較高，出窖時(shí)含量降低，酸性物質(zhì)中乙酸含量最高，其次為正己酸、α-（1-羥乙基）-苯丙酸、棕櫚酸、苯甲酸。與其它香型相比，醬香型白酒中含量最高的酸是乙酸和丙酸[40]，尤其是乙酸，在本研究中酒醅乙酸相對含量也較為突出，酸類物質(zhì)的作用主要是影響白酒的口感和后味，起到呈香、助香、減少刺激和緩沖平衡的作用。在發(fā)酵過程中，其他揮發(fā)物（如酚類和醛類）的量沒有觀察到顯著差異。

2.2.2 風(fēng)味化合物與微生物群落的相關(guān)性 微生物代謝是白酒中風(fēng)味化合物的重要來源，如Lactobacillus等產(chǎn)酸微生物使白酒酸味增加，Bacillus、Saccharomyces等相對豐度的提高能夠使醛酮類、酯類等香氣成分含量增加[41]，圖6 分析了北方醬味白酒第四輪次發(fā)酵過程中不同微生物與風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性。

圖6 醬香型白酒第四輪次入窖酒醅微生物群落與風(fēng)味化合物的相關(guān)性Fig.6 Correlation between the microbial community and flavor substances in the fourth round Jiupei of sauce-flavored Baijiu

在關(guān)鍵細(xì)菌群落中（圖6a），Lactobacillus與乳酸乙酯（A2）、琥珀酸二乙酯（A5）、（E）-10-十七碳烯-8-炔二酸甲酯（A8）、苯乙酸乙酯（A9）、月桂酸乙酯（A25）等呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），結(jié)合已報(bào)道的其余輪次入窖發(fā)酵情況，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus在醬香型白酒發(fā)酵過程中具有重要的酯類合成作用[14-15,42]，是一種重要的功能微生物；Virgibacillus與苯甲酸（A40）、十二烷基七聚乙二醇醚（A43）、1-（1H-吡咯-2-基）-乙酮（2-乙?；量ˋ49）呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），與乳酸乙酯（A2）、琥珀酸二乙酯（A5）和苯乙酸乙酯（A9）呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；同樣地，Kroppenstedtia與琥珀酸單乙酯（A24）、苯甲醇（A30）、苯乙醇（A33）、十二烷基七聚乙二醇醚（A43）、1,2-二-4-吡啶-1,2-乙二醇（A47）、1-（1H-吡咯-2-基）-乙酮（2-乙酰基吡咯）（A49）呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），這與Virgibacillus正相關(guān)的風(fēng)味化合物相近，而兩種菌的負(fù)相關(guān)性化合物也極為相似，包括乳酸乙酯（A2）、琥珀酸二乙酯（A5）、苯乙酸乙酯（A9）以及月桂酸乙酯（A25），這些顯著相關(guān)的風(fēng)味化合物與白酒發(fā)酵過程中酒醅細(xì)菌群落多樣性的演替相對應(yīng)，即發(fā)酵過程中優(yōu)勢屬由Virgibacillus、Kroppenstedtia逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)長actobacillus。

在關(guān)鍵真菌群落中，Thermoascus與十八乙二醇單十二烷基醚（A48）呈正相關(guān)，與DL-亮氨酸乙酯（A4）、癸酸乙酯（A22）、棕櫚酸乙酯（A23），苯甲醇（A30）呈負(fù)相關(guān)（圖6b）。Aspergillus曲霉菌與乳酸乙酯（A2）、（E）-9 十八烯酸乙酯（A14）呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），與苯甲醇（A30）呈負(fù)相關(guān)（圖6b）。Issatchenkia與DL-亮氨酸乙酯（A4）、4-乙基愈創(chuàng)木酚（A46）呈正相關(guān)，與丁酸（A41）呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。Thermoascus與Issatchenkia相關(guān)的部分風(fēng)味化合物呈現(xiàn)出相反的相關(guān)性，這對發(fā)酵期間優(yōu)勢屬Thermeascus相對豐度呈現(xiàn)逐漸增加而Issatchenkia相對豐度逐漸減少的演替過程提供佐證（圖5c）。

在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，對白酒風(fēng)味具有貢獻(xiàn)的關(guān)鍵酯類物質(zhì)有48 種[2]，傳統(tǒng)觀點(diǎn)中與白酒的風(fēng)味密切相關(guān)的四大乙酯（乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯）均包含在內(nèi)，通過對第四輪次發(fā)酵酒醅中微生物與風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)Monascus、Lactobacillus和Wickerhamomyces分別與乙酸乙酯、乳酸乙酯和己酸乙酯呈顯著正相關(guān)（P＜0.01）。已有研究顯示紅曲霉通過產(chǎn)酯化酶可提升白酒中乙酸乙酯[43]、己酸乙酯[44]等酯類含量，石馨等[45]已將Wickerhamomyces應(yīng)用于模擬發(fā)酵提升己酸乙酯含量，同樣地可以在白酒發(fā)酵過程中利用功能微生物菌屬M(fèi)onascus、Lactobacillus等改善其余輪次基酒風(fēng)味，有助于提高白酒的品質(zhì)。

3 結(jié)論

醬香型白酒采用傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵模式，開放式的發(fā)酵過程導(dǎo)致環(huán)境中多種微生物參與其中，隨著入窖發(fā)酵的進(jìn)行，原料消耗、窖池環(huán)境變化使每輪入窖都形成感官有差異的輪次酒，不同輪次酒的微生物結(jié)構(gòu)和風(fēng)味物質(zhì)組成存在著明顯不同，其中以大回酒中第四輪次酒風(fēng)味最佳。本文以北京地區(qū)醬香型白酒第四輪次發(fā)酵酒醅為研究對象，分析了發(fā)酵過程中核心微生物的結(jié)構(gòu)變化和風(fēng)味物質(zhì)的差異。第四輪次發(fā)酵酒醅中，優(yōu)勢細(xì)菌屬為Lactobacillus、Virgibacillus和Kroppenstedtia，優(yōu)勢真菌屬為Thermoascus、Issatchenkia和Aspergillus，在整個(gè)發(fā)酵過程中，優(yōu)勢菌屬由Virgibacillus、Kroppenstedtia、Issatchenkia交替為Lactobacillus、Thermoascus、Aspergillus。白酒發(fā)酵過程中關(guān)鍵風(fēng)味化合物醇類、酯類、酸類的含量隨著入窖發(fā)酵時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的規(guī)律，并且酯類相對含量較高，這顯著影響醬香型白酒的產(chǎn)品品質(zhì)。關(guān)聯(lián)性分析顯示Monascus、Lactobacillus和Wickerhamomyces分別與白酒中關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)乙酸乙酯、乳酸乙酯和己酸乙酯呈正相關(guān)。本研究有助于尋找醬香型白酒發(fā)酵過程中潛在的功能微生物、明晰微生物與風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性，為不同輪次醬香型白酒微生物區(qū)系波動和風(fēng)味物質(zhì)關(guān)聯(lián)比較分析提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，有助于推動提高醬香型白酒品質(zhì)的研究。