耿 琦,李敬偉,凌江紅,蔣 健

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院消化內(nèi)科,上海 200021)

功能性消化不良(Functional dyspepsia,FD)是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的一種功能性胃腸病,以胃和十二指腸功能紊亂引起的餐后飽脹、早飽感、上腹痛或上腹燒灼感等癥狀為主[1-3],是中醫(yī)治療的優(yōu)勢(shì)病種。隨著現(xiàn)代社會(huì)生活壓力的與日俱增,伴有焦慮、抑郁等精神障礙的FD患者亦日趨增多,除促動(dòng)力外,抗抑郁在FD的治療中同樣具有重要的作用。臨床研究亦證實(shí)促動(dòng)力聯(lián)合抗抑郁是FD的優(yōu)選治療方案[4-6]。但是,長(zhǎng)期服用西藥大多存在不良反應(yīng)較多、易耐藥、易產(chǎn)生依賴性等缺點(diǎn),中醫(yī)中藥則可發(fā)揮一定的優(yōu)勢(shì)[7]。

半夏瀉心湯是《傷寒論》的經(jīng)典名方,現(xiàn)代多項(xiàng)臨床研究表明本方對(duì)FD具有較好的療效[8-11]。前期研究亦證實(shí)了半夏瀉心湯在改善FD餐后飽脹不適和早飽癥狀的同時(shí),還具有抗抑郁的作用[12-13]。本研究通過(guò)觀察半夏瀉心湯對(duì)FD大鼠抑郁狀態(tài)及促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(Corticotropin releasing factor,CRF)及其相關(guān)受體CRF-R1、CRF-R2的影響,探討其抗抑郁的作用及其相關(guān)機(jī)制,旨在為本方治療FD提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用Wistar大鼠,雄雌隨機(jī),SPF級(jí),48只,7周齡,體重(220±20) g,購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(滬)2018-0004,合格證號(hào)：20180004038434。飼養(yǎng)于上海大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,予標(biāo)準(zhǔn)飼料及飲用水,室溫20～23 ℃,濕度40%～70%,12 h晝夜交替,動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水。本研究獲得上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào) PZSHUTCM200703021)。

1.1.2 藥物與試劑：半夏瀉心湯飲片每劑含制半夏、黃芩、大棗各12 g,干姜、人參片、炙甘草各9 g,黃連6 g,購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中草藥房。鹽酸氟西汀膠囊(國(guó)藥準(zhǔn)字J20130010),每粒20 mg,購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院西藥房。石蠟,leica(39601095);二甲苯,泰坦(1018114);乙醇,泰坦(1101143);樹(shù)膠,BBI(E675007);蘇木素/伊紅染色試劑盒,Thremo(7211);CRF抗體(Invitrogen,PA5-102356);CRF-R1抗體(Invitrogen,PA5-27121);CRF-R2抗體(Bioss,BS6620R);兔二抗(Abcam,M21002F)等。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：正置顯微鏡,leica(DMT50);石蠟切片機(jī),leica(RM2076);純水儀,銳思捷(Unique-R10);酶標(biāo)儀(Thermo,MuLTiSKANeMK3);微量移液器(Eppendrof,3120000.216);渦旋混合器(麒麟貝爾,XW-80A);離心機(jī)(中佳,SC-3610);超微量核酸測(cè)定儀(Thermo,Nanodrop one);RT-qPCR儀(伯樂(lè),CFX Connect);掌上離心機(jī)(SCILOGEX,D1008U);電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠,DYCZ-40);全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(Tanon,Tanon-4200);GEL image system(Tanon,Tanon-1000)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型建立：48只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、氟西汀組、半夏瀉心湯低劑量組、半夏瀉心湯中劑量組、半夏瀉心湯高劑量組,共六組,每組8只。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,第8天起除空白組外,其余五組用紗布包裹止血鉗輕度鉗夾鼠尾后1/3處,立即放開(kāi),每次30 min,2次/d;每周二、四、六禁食,余日給足量飼料,持續(xù)21 d,若有抓傷,予碘伏消毒傷口,以防感染。造模后大鼠體重下降、糖水偏好度及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)移動(dòng)總距離和直立次數(shù)明顯下降,且與空白組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異提示造模成功。

1.2.2 分組與給藥：造模成功后,每組大鼠每日按1 ml/100 g體重灌胃,1次/d,持續(xù)14 d。半夏瀉心湯低、中、高劑量組根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》“人和動(dòng)物間按體表面積折算等效劑量”計(jì)算得出給藥劑量,并擴(kuò)大2倍灌胃給藥,半夏瀉心湯低劑量組(0.62 g/ml)、半夏瀉心湯中劑量組(1.24 g/ml)、半夏瀉心湯高劑量組(2.48 g/ml);氟西汀組(2 mg/kg);空白組和模型組每日均以同等容積的蒸餾水灌胃。

1.2.3 一般狀態(tài)觀察：每日8：00測(cè)量各組大鼠體重,并觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度、活動(dòng)范圍、攝食量及排便情況。

1.2.4 糖水偏好實(shí)驗(yàn)：分別于給藥前和給藥后進(jìn)行1%糖水偏好實(shí)驗(yàn)。分別采用1%的蔗糖水溶液和蒸餾水作為實(shí)驗(yàn)飲水,在訓(xùn)練中,大鼠在前24 h每籠放入兩瓶1%(W/V)的蔗糖溶液(即1 g蔗糖溶解于蒸餾水后定容至100 ml),緊接著24 h將其中的一瓶換成純水,適應(yīng)結(jié)束后,禁食禁水24 h,之后12 h的基線測(cè)試開(kāi)始進(jìn)行。在測(cè)試中,一瓶為1%(W/V)的蔗糖溶液,另一瓶為純水,禁食,12 h后,取走兩瓶并稱(chēng)重,記錄大鼠的總液體消耗,糖水消耗和純水消耗。糖水偏好度=蔗糖水消耗/(蔗糖水消耗+正常水消耗)×100%。

1.2.5 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：分別于給藥前、給藥結(jié)束后進(jìn)行曠場(chǎng)活動(dòng)行為學(xué)測(cè)試。將大鼠放置于敞箱底部中心方格內(nèi),觀察大鼠移動(dòng)總距離和直立(大鼠的兩前爪騰空或者是兩前爪攀附墻壁方可記錄)的次數(shù)。測(cè)定5 min內(nèi)大鼠移動(dòng)總距離和直立的次數(shù)。每只大鼠測(cè)試前均用20%乙醇清除曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱的殘留氣味。

1.2.6 HE染色觀察大鼠胃竇組織基本形態(tài)：糖水偏好、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,用10%水合氯醛麻醉大鼠,剖腹取胃,剪取胃竇組織,經(jīng)脫水、石蠟、包埋、切片(5 μm)、HE染色、封固后制成組織切片,置于光學(xué)顯微鏡下觀察,并顯微照相。

1.2.7 RT-qPCR法檢測(cè)大鼠下丘腦中CRF、CRF-R1、CRF-R2的mRNA表達(dá)水平：取大鼠適量下丘腦組織,采用Trizol法提取總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,測(cè)定CRF、CRF-R1、CRF-R2的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)條件依次為：95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s循環(huán)40次,60 ℃逐漸升溫至95 ℃,每5 s升高0.5 ℃,循環(huán)71次。每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)量3次,采用ΔΔCt值方法,ΔCt=目的基因Ct值-GAPDH Ct值,ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組,目的基因相對(duì)表達(dá)倍數(shù)=2-ΔΔCt。引物序列見(jiàn)表1。

表1 CRF、CRF-R1、CRF-R2 mRNA引物序列

1.2.8 Western blot法檢測(cè)大鼠下丘腦中CRF、CRF-R1、CRF-R2的蛋白表達(dá)：取大鼠適量下丘腦組織,加入RIPA裂解液,低溫勻漿,4 ℃ 12000 r/min離心,取上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度,配置10%SDS-PAGE分離膠、5%SDS-PAGE濃縮膠。依次進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、用5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1 h后,分別加入一抗CRF(1∶2000)、CRF-R1(1∶1000)、CRF-R2(1∶1000),孵育過(guò)夜,洗膜3次,每次10 min,加入對(duì)應(yīng)的鼠二抗(1∶3000)、兔二抗(1∶3000),室溫孵育1 h,洗膜3次,每次10 min,曝光顯影,拍照,保存圖像,采用GEL Image圖像分析系統(tǒng)對(duì)目的條帶灰度進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均采用雙側(cè)檢驗(yàn),計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述,前后重復(fù)測(cè)量資料及多組計(jì)數(shù)資料間的兩兩比較比較均采用廣義估計(jì)方程;P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)比較 給藥前,除空白組外,其他各組大鼠活動(dòng)增多,暴躁易怒,不容易抓取,經(jīng)常發(fā)生籠內(nèi)互相撕咬的情況,皮毛凌亂,發(fā)黃無(wú)光澤且不順滑,飲食飲水量減少,糞便較為干燥。給藥后,氟西汀組、半夏瀉心湯低、中、高劑量組精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn),毛發(fā)逐漸順滑有光澤,性情趨于溫順,飲食飲水量增加,糞便基本正常;模型組大鼠仍然暴躁易怒,皮毛凌亂,發(fā)黃無(wú)光澤。

2.2 各組大鼠給藥前后體重比較 見(jiàn)表2。與空白組比較,模型組大鼠給藥后體重明顯降低(P<0.01);與模型組比較,氟西汀組、半夏瀉心湯低、中、高各劑量組大鼠的體重均明顯增加(P<0.05)。

表2 各組大鼠給藥前后體重比較(g)

2.3 各組大鼠給藥前后糖水偏好度比較 見(jiàn)表3。給藥前,與空白組比較,模型組、氟西汀組、半夏瀉心湯低、中、高各劑量組大鼠糖水偏好度均明顯下降(P<0.01)。給藥后,與空白組比較,模型組大鼠糖水偏好度明顯下降(P<0.01);與模型組比較,氟西汀組、半夏瀉心湯低、中、高各劑量組大鼠的糖水偏好度均明顯提高(P<0.01);與氟西汀組比較,半夏瀉心湯低、中、高各劑量組雖有所提高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠給藥前后糖水偏好度比較(%)

2.4 各組大鼠給藥前后曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)比較 見(jiàn)表4。給藥前,與空白組比較,模型組、氟西汀組、半夏瀉心湯低、中、高各劑量組大鼠曠場(chǎng)移動(dòng)總距離均明顯減少(P<0.01),模型組大鼠曠場(chǎng)直立次數(shù)減少(P<0.05),氟西汀組、半夏瀉心湯低、中、高各劑量組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)直立次數(shù)亦低于空白組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給藥后,與空白組比較,模型組大鼠曠場(chǎng)移動(dòng)總距離和直立次數(shù)均明顯減少(P<0.01);與模型組比較,氟西汀組、半夏瀉心湯低、中、高各劑量組大鼠曠場(chǎng)移動(dòng)總距離和直立次數(shù)均明顯增加(P<0.05);與氟西汀組比較,半夏瀉心湯低、中、高各劑量組大鼠曠場(chǎng)移動(dòng)總距離和直立次數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 各組大鼠給藥前后曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)比較

2.5 各組大鼠胃竇組織基本形態(tài)比較 見(jiàn)圖1。經(jīng)HE染色后觀察各組大鼠胃竇組織基本形態(tài),結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組大鼠胃竇組織結(jié)構(gòu)基本完整,未見(jiàn)變性、壞死、炎性浸潤(rùn)等明顯器質(zhì)性病變。

A：空白組;B：模型組;C：氟西汀組;D：半夏瀉心湯低劑量組;E：半夏瀉心湯中劑量組;F：半夏瀉心湯高劑量組

2.6 各組大鼠下丘腦中CRF、CRF-R1、CRF-R2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 見(jiàn)表5。與空白組比較,模型組FD大鼠下丘腦中CRF、CRF-R1 mRNA表達(dá)升高(P<0.01),CRF-R2 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)。與模型組比較,氟西汀組、半夏瀉心湯低、中、高各劑量組FD大鼠下丘腦中CRF、CRF-R1 mRNA的表達(dá)量均明顯降低(P<0.01),CRF-R2 mRNA的表達(dá)量均明顯升高(P<0.01)。

表5 各組大鼠下丘腦中CRF、CRF-R1、CRF-R2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.7 各組大鼠下丘腦中CRF、CRF-R1、CRF-R2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 見(jiàn)表6(圖2)。與空白組比較,模型組FD大鼠下丘腦中CRF、CRF-R1蛋白表達(dá)升高(P<0.01),CRF-R2蛋白表達(dá)降低(P<0.01)。與模型組比較,氟西汀組、半夏瀉心湯高劑量組FD大鼠下丘腦中CRF蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.01),氟西汀組、半夏瀉心湯低、中、高各劑量組FD大鼠下丘腦中CRF-R1蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.01),氟西汀組、半夏瀉心湯低、中、高各劑量組FD大鼠下丘腦中CRF-R2蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)。

圖2 各組大鼠下丘腦中CRF、CRF-R1、CRF-R2蛋白表達(dá)

表6 各組大鼠下丘腦中CRF、CRF-R1、CRF-R2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

FD是一種身心疾病,與精神因素關(guān)系密切[14]。中醫(yī)學(xué)多將本病歸屬于“胃痞”范疇,其病位在胃,與肝、脾二臟關(guān)系密切;情志不暢、飲食不節(jié)是本病的主要病因;情志不暢、肝氣郁結(jié),橫逆乘脾犯胃,加之飲食不節(jié)、脾胃失調(diào),升降失常,中焦樞機(jī)不利,氣機(jī)郁滯不暢,是主要病機(jī)[15]。因此調(diào)和肝脾,恢復(fù)中焦氣機(jī)升降,乃是本病的主要治療法則。半夏瀉心湯是《傷寒論》的經(jīng)典名方,主治心下痞證(即胃痞)?！秲?nèi)經(jīng)》云：“辛走氣,辛以散之”,散痞者,必以辛為助,方中以辛溫、辛熱之半夏、干姜消痞散結(jié)、和胃降逆,以分陰而行陽(yáng);《內(nèi)經(jīng)》又云：“苦先入心,以苦泄之”,故瀉心者,必以苦為主,是以黃連、黃芩苦寒,瀉熱消痞,以降陽(yáng)而升陰;成無(wú)己《注解傷寒論》云：“陰陽(yáng)不交曰痞,上下不能為滿。欲通上下,交陰陽(yáng),必和其中”,人參、大棗甘溫,補(bǔ)脾和中益氣;甘草調(diào)和諸藥。全方通上下、交陰陽(yáng)、和其中,可調(diào)暢中焦氣機(jī),恢復(fù)氣機(jī)升降,既可消痞還可疏郁,與FD病機(jī)相契合。

本研究采用不規(guī)則喂養(yǎng)聯(lián)合夾尾刺激的雙因素造模方法制備了FD模型[16]。結(jié)果顯示,各造模組大鼠飲食飲水量明顯減少,并且出現(xiàn)糞便干燥的表現(xiàn),而胃竇黏膜組織病理切片卻未見(jiàn)明顯器質(zhì)性病變。另外,各造模組大鼠出現(xiàn)活動(dòng)增多,暴躁易怒,不容易抓取,經(jīng)常發(fā)生籠內(nèi)互相撕咬等情況;通過(guò)糖水偏好和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的測(cè)試,各造模組大鼠愉悅感缺失、運(yùn)動(dòng)度和對(duì)陌生空間的探索能力下降,提示大鼠陷入了抑郁狀態(tài)。以上表明通過(guò)不規(guī)則喂養(yǎng)聯(lián)合夾尾刺激法制備的FD大鼠模型成功。

糖水偏好和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)均是經(jīng)典的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抑郁、焦慮樣行為和相關(guān)性快感缺乏癥的方法[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn),半夏瀉心湯低、中、高各劑量組FD大鼠的糖水偏好度、移動(dòng)總距離和直立次數(shù)均較模型組增加,提示其能改善大鼠的愉悅感、活動(dòng)度,以及對(duì)新異環(huán)境的好奇程度和探索能力。同時(shí)經(jīng)半夏瀉心湯治療后的FD大鼠精神狀態(tài)亦逐漸好轉(zhuǎn),性情趨于溫順,皮毛順滑光澤。以上均表明半夏瀉心湯能有效改善FD大鼠抑郁狀態(tài),具有一定的抗抑郁作用。

CRF是一種含有41個(gè)氨基酸的神經(jīng)多肽,廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[19],同時(shí)在胃腸道中也有表達(dá)[20]。CRF主要有兩個(gè)亞型,即CRF-R1和CRF-R2。CRF與CRF-R1受體具有高度的親和力,在垂體前葉、海馬、大腦皮質(zhì)和杏仁核等與應(yīng)激和情感調(diào)節(jié)相關(guān)的腦區(qū)與CRF重疊分布;CRF與CRF-R2受體的親和力則較低,多位于離散的腦區(qū),其具有抵消CRF-R1刺激引起的應(yīng)激反應(yīng)的作用[21]。大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明,CRF是“腦-腸”軸在心理應(yīng)激反應(yīng)時(shí)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[22],其與CRF-R1和CRF-R2受體的平衡失調(diào)在精神壓力導(dǎo)致的多種功能性胃腸病中扮演了重要的角色[23-24]。在健康人群中,CRF-R1和CRF-R2維持著動(dòng)態(tài)平衡,而在腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome,IBS)、FD等功能性胃腸病中發(fā)現(xiàn)CRF-R1和CRF-R2處于失衡狀態(tài)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)CRF-R1和CRF-R2的失衡介導(dǎo)了IBS的內(nèi)臟高敏狀態(tài),并提出了CRF-R1和CRF-R2信號(hào)的平衡方向決定了IBS結(jié)腸的敏感性和蠕動(dòng)力[25]。碘乙酰胺誘導(dǎo)的FD模型大鼠可引起抑郁樣行為,其下丘腦中CRF表達(dá)明顯升高,用CRF-R1拮抗劑則可逆轉(zhuǎn)大鼠抑郁樣行為,提示大鼠抑郁樣行為可能與CRF-R1表達(dá)過(guò)度升高有關(guān)[26]。本研究顯示,FD大鼠下丘腦中CRF、CRF-R1 mRNA的表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平均較空白對(duì)照組升高,而CRF-R2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低,提示FD大鼠存在CRF-R1和CRF-R2的失衡狀態(tài),其抑郁的發(fā)生可能與CRF、CRF-R1升高和CRF-R2降低有關(guān)。半夏瀉心湯可通過(guò)下調(diào)大鼠下丘腦中CRF、CRF-R1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平,同時(shí)上調(diào)CRF-R2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平,恢復(fù)CRF-R1和CRF-R2的平衡狀態(tài),發(fā)揮抗抑郁的作用。

綜上所述,半夏瀉心湯可通過(guò)調(diào)控CRF通路,恢復(fù)CRF-R1和CRF-R2的平衡狀態(tài),發(fā)揮抗抑郁作用,關(guān)于其具體作用靶點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。