摘" " 要：為探索羧化殼聚糖（carboxymethyl chitin， CMCS）在豬精液常溫保存過程中的抗氧化及抗菌作用，采集某豬場(chǎng)杜洛克品系公豬不同批次精液，并在常溫條件下保存，第0天和第3天添加3種濃度CMCS（0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1），分別測(cè)定其對(duì)精子活力、總抗氧化能力（T-AOC）、活性氧水平（ROS）、丙二醛濃度（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性影響，篩選確定CMCS的最佳添加濃度;同時(shí)對(duì)所有批次精液進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定并測(cè)定CMCS抗菌效果。結(jié)果表明，與空白對(duì)照相比，在常溫保存過程中，添加0.05 mg·mL-1CMCS可顯著提高精子活力及T-AOC、CAT、SOD、GSH-PX抗氧化活性（Plt;0.05），降低ROS和MDA氧化指標(biāo)（Plt;0.05）。另外，從采集的精液中分離出3株革蘭氏陰性細(xì)菌，16SrDNA測(cè)序分析結(jié)果顯示，3株細(xì)菌與變形桿菌參考菌株相似性最高，分別為99.93%、100%、99.79%，并且0.05 mg·mL-1殼聚糖添加組可顯著降低豬精液常溫保存中的細(xì)菌含量（Plt;0.05）。綜上，CMCS在豬精液常溫保存過程中的適宜添加濃度為0.05 mg·mL-1，該濃度CMCS可有效提高豬精液常溫保存過程中的抗氧化性及抗菌活性。研究結(jié)果可為CMCS在豬精液常溫保存過程中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：羧化殼聚糖;豬精液;常溫;保存;抗氧化;抑菌

中圖分類號(hào)： S826" " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A" " " "DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2024.12.010

Effects of Carboxymethyl Chitin on the Antioxidant and Antibacterial Properties in Boar Semen during Normal Temperature Preservation

TANG Peijuan1， SUN Jiuying2， DOU Shuhao1， LI Xinlei2， SUN Yingfeng2， FU Yongli1

（1. Tianjin Agricultural Development Service Center， Tianjin 300061， China; 2. College of Animal Science and Animal Medicine， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300392， China）

Abstract： To explore the antioxidant and antibacterial effects of carboxymethyl chitosan （CMCS） in boar semen during normal temperature， different batches of Duroc male boar semen were collected from pig farms. The total antioxidant capacity（T-AOC）， reactive oxygen species（ROS）， malondialdehyde（MDA） content， catalase（CAT）， superoxide dismutase （SOD）， and glutathione peroxidase （GSH-PX） activity were determined on day 0 and day 3 under room temperature storage conditions in three CMCS concentrations （0.05 mg·mL-1， 0.10 mg·mL-1， 0.15 mg·mL-1） groups for determination the optimal concentration. Simultaneously， bacterial isolation and identification were performed on all batches of semen， and the antibacterial effect of CMCS was further analyzed. The results showed that compared with the blank control， adding 0.05 mg·mL-1 CMCS could significantly increase sperm motility and antioxidant activities such as T-AOC， CAT， SOD， GSH-PX （Plt;0.05）， while it could reduce oxidative indicators such as ROS and MDA （Plt;0.05）during room temperature storage， suggestting that 0.05 mg·mL-1CMCS was the appropriate concentration inboar semen. Three strains of Gram negative bacteria were isolated from some batches of semen， and the 16S rDNA sequencing analysis showed that the bacteria were highest similarity with the reference strain of Proteus， with 99.93%， 100%， and 99.79%， respectively. Moreover， 0.05 mg·mL-1 CMCS could significantly reduce the bacterial content during room temperature storage （Plt;0.05）. In conclusion， the appropriate concentration of CMCS in normal temperature storage of pigs is 0.05 mg · mL-1， which can effectively improve the antioxidant and antibacterial activities of pigs in normal temperature storage. The results provide a theoretical basis for the application of CMCS in normal temperature storage of pigs.

Key words：CMCS; boar semen; room temperature; stored; antioxidant; antibacterial

目前人工授精技術(shù)在提高生豬生產(chǎn)效率、優(yōu)化種群遺傳結(jié)構(gòu)和疾病防控方面展現(xiàn)出了巨大潛力，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，其中精液常溫保存技術(shù)是人工授精的重要環(huán)節(jié)[1]。豬精液常溫保存過程中易受多種因素影響，如時(shí)間、溫度、滲透壓，抗氧化水平、微生物繁殖等，其中精子自身代謝會(huì)產(chǎn)生大量活性氧累積，使精子質(zhì)膜脂質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞膜，線粒體、DNA等，影響其受精能力及子代品質(zhì)[2]。此外，由于精液的采集和處理沒有進(jìn)行嚴(yán)格的無菌操作，易出現(xiàn)微生物污染的情況，對(duì)公豬精液質(zhì)量會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響[3]。因此，篩選具有抗氧化應(yīng)激且抗菌的添加劑對(duì)于提高精液保存質(zhì)量和保證臨床安全生產(chǎn)具有重要意義。

羧化殼聚糖（carboxymethyl chitin，CMCS）是一種改性的水溶性殼聚糖衍生物，具有無毒副作用和生物相容性，可以結(jié)合并清除羥自由基，具有較好的抗氧化性。張嚴(yán)偉等[4]研究表明，福瑞鯉飼喂羧化殼聚糖能夠明顯增強(qiáng)血漿中超氧化物歧化酶的活性，同時(shí)減少丙二醛水平。此外，CMCS對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率達(dá)90%以上，表現(xiàn)出高抗菌效率，是一種潛在的天然抗菌劑[5]。本試驗(yàn)旨在探討CMCS 在豬精液常溫保存過程中的抗氧化及抗菌作用，以期為CMCS在豬精液常溫保存過程中的實(shí)際應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)精液

試驗(yàn)材料為天津地區(qū)某豬場(chǎng)杜洛克精液。

1.2 主要試劑

CMCS （純度≥90%）為國內(nèi)某公司產(chǎn)品，T-AOC、ROS、SOD、CAT、MDA、GSH試劑盒購自南京建成公司，瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒提試劑盒為天根生化試劑有限公司產(chǎn)品，5× MLV buffer、dNTP、MLV、RandomPrimer等分子生物學(xué)相關(guān)試劑為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.3 儀器與設(shè)備

細(xì)菌培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋為天津泰斯特儀器有限公司，電子分析天平為上海精密儀器儀表有限公司，PCR 擴(kuò)增儀、電泳儀和凝膠成像儀為BioRad公司產(chǎn)品。

1.4 CMCS溶液配制

準(zhǔn)確稱取2.5 g CMCS放入滅菌燒杯內(nèi)，溶解于Modena稀釋液中，并定容到500 mL，配制成5 mg·mL-1溶液，在無菌臺(tái)過濾除菌，在4 ℃條件下保存，備用。

1.5 精液的稀釋

將5 mg·mL-1CMCS溶液在水浴鍋內(nèi)預(yù)熱到17 ℃，時(shí)間持續(xù)5 min，備用;取15 mL滅菌試管，分別取0.1、0.2、0.3 mL CMCS溶液與精液混合，定容至10 mL，配制成0.05、0.10、0.15 mg·mL-1濃度溶液，每個(gè)濃度重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)置不添加CMCS空白對(duì)照組（CK）。所有處理組均放置17 ℃恒溫箱中保存，每隔12 h緩慢搖動(dòng)1次。

1.6 CMCS對(duì)精液品質(zhì)的影響

1.6.1 精子活力的檢測(cè) 在第0 天、第1天、第2天和第3天，分別從17 ℃恒溫條件下保存的精液樣本中取樣，用顯微鏡在3個(gè)不同視野下觀察精子的運(yùn)動(dòng)情況，測(cè)定并記錄精子活力。

1.6.2 精液中抗氧化指標(biāo)的檢測(cè) 選擇添加CMCS處理的第3天精液樣品，每個(gè)濃度3次重復(fù)，檢測(cè)精液樣品的 MDA、T-AOC、SOD、CAT、ROS、GSH-PX指標(biāo)。依據(jù)試劑盒的使用指南進(jìn)行操作，并對(duì)測(cè)定的相應(yīng)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。

1.7 CMCS對(duì)精液中細(xì)菌含量的影響

對(duì)所有批次精液進(jìn)行細(xì)菌分離純化、革蘭氏染色和16S rDNA 基因PCR擴(kuò)增與測(cè)序分析，選擇CMCS最佳添加濃度處理的精液，分別于添加處理的第1天、第2天、第3天進(jìn)行平板法活菌計(jì)數(shù)，分析CMCS對(duì)精液中細(xì)菌含量的影響。

1.8 數(shù)據(jù)處理

本研究利用 IBM SPSS Statistics 軟件對(duì)本試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”的形式展示，差異顯著性的判定標(biāo)準(zhǔn)為Plt;0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMCS對(duì)豬精液中精子活力的影響

如表1所示，在添加CMCS的第0天，所有組的精子活力差異不顯著（Pgt;0.05）; 在添加CMCS的第1天，與空白對(duì)照組（0 mg·mL-1）相比，0.05 mg·mL-1CMCS處理組的精子活力差異不顯著（Pgt;0.05），0.10、0.15 mg·mL-1CMCS處理組的精子活力顯著差異（Plt;0.05）;在添加CMCS的第2天，與空白對(duì)照組（0 mg·mL-1）相比，所有CMCS添加處理組的精子活力顯著差異（Plt;0.05），并且0.05 mg·mL-1 CMCS處理組的精子活力最高;在添加CMCS的第3天，與空白對(duì)照組（0 mg·mL-1）相比，0.05、0.10 mg·mL-1CMCS處理組的精子活力差異顯著（Plt;0.05），并且0.05 mg·mL-1 CMCS處理組的精子活力最高。

2.2 CMCS對(duì)豬精液相關(guān)氧化指標(biāo)的影響

2.2.1 CMCS對(duì)豬精液中總抗氧化能力的影響 向豬精液中加入不同濃度CMCS，并在常溫下保存3 d，檢測(cè)其對(duì)總抗氧化能力（T-AOC）的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，豬精液常溫保存3 d，與空白對(duì)照組相比，0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1CMCS處理組的總抗氧化能力差異顯著，并且0.05 mg·mL-1 CMCS處理組的效果最好。

2.2.2 CMCS對(duì)豬精液中丙二醛含量的影響 向豬精液中加入不同濃度CMCS，并在常溫下保存3 d，檢測(cè)其對(duì)丙二醛（MDA）含量的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，與空白組相比，0.05、0.10、0.15 mg·mL-1CMCS處理組的MDA含量均顯著下降（Plt;0.05），其中0.05 mg·mL-1 CMCS處理組的效果最好。

2.2.3 CMCS對(duì)豬精液中活性氧含量的影響 在豬精液中添加不同濃度CMCS，常溫保存3 d，測(cè)定其對(duì)活性氧含量（ROS）的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，與空白組相比，0.05、0.10、0.15 mg·mL-1 CMCS處理組的ROS水平均顯著下降（Plt;0.05），其中0.05 mg·mL-1CMCS處理組的效果最好。

2.2.4 CMCS對(duì)豬精液中過氧化氫酶活性的影響 向豬精液中加入不同濃度CMCS，并在常溫下保存3 d，檢測(cè)其對(duì)過氧化氫酶（CAT）的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，與空白組相比，0.05、0.10、0.15 mg·mL-1CMCS處理組的CAT活性顯著增加（Plt;0.05），其中0.05 mg·mL-1CMCS處理組的效果最好。2.2.5 CMCS對(duì)豬精液中超氧化物歧化酶活性的影響 向豬精液中加入不同濃度CMCS，并在常溫下保存3 d，檢測(cè)其對(duì)超氧化物歧化酶（SOD）的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，與空白組相比，0.05、0.10、0.15 mg·mL-1 CMCS處理組的SOD含量顯著增高（Plt;0.05），其中0.05 mg·mL-1CMCS處理組的效果最好。

2.2.6 CMCS對(duì)豬精液中谷胱甘肽過氧化酶活性的影響 在豬精液中添加不同濃度CMCS，常溫保存3 d，測(cè)定其對(duì)谷胱甘肽過氧化酶（GSH-PX）活性的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可以看出，與空白組相比，0.05、0.10、0.15 mg·mL-1 CMCS處理組的GSH-PX活性顯著增加（Plt;0.05），其中0.05 mg·mL-1CMCS處理組的效果最好。

2.3 CMCS對(duì)豬精液中細(xì)菌含量的影響

2.3.1 豬精液中細(xì)菌的分離鑒定 對(duì)所有批次精液進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定并進(jìn)行16SrDNA擴(kuò)增測(cè)序分析。從采集的50份精液中分離出3株細(xì)菌，分別命名為A、B、C菌株，革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性菌（圖7）。利用特異性引物進(jìn)行16SrDNA擴(kuò)增，3株細(xì)菌均能擴(kuò)增出1 500 bp條帶，與預(yù)期位置大小一致。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序序列和Blast序列比對(duì)分析，結(jié)果表明，3株細(xì)菌均與變形桿菌參考菌株相似性最高，相似度分別為99.93%、100%、99.79%，并且遺傳進(jìn)化樹顯示，3株細(xì)菌處于同一大分支（圖8）。

2.3.2 CMCS對(duì)豬精液中細(xì)菌的抑制作用 在含有細(xì)菌的豬精液中添加0.05 mg·mL-1 CMCS，常溫保存3 d，每天測(cè)定其對(duì)細(xì)菌含量的影響，結(jié)果見圖9。由圖9可知，精液保存至第1天、第2天、第3天時(shí)，與空白對(duì)照組相比，0.05 mg·mL-1CMCS處理均能顯著降低豬精液中細(xì)菌含量（Plt;0.05）。這表明0.05 mg·mL-1 CMCS處理能夠抑制細(xì)菌增長。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

近年來，隨著規(guī)?；B(yǎng)豬的發(fā)展，豬人工授精技術(shù)在推動(dòng)產(chǎn)業(yè)降本增效和優(yōu)良品種推廣應(yīng)用方面表現(xiàn)出了積極的現(xiàn)實(shí)意義，其中因常溫保存技術(shù)成本低及易操作特點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中得到了大力推廣，但在豬精液常溫保存過程中，精子會(huì)產(chǎn)生ROS蓄積，進(jìn)而發(fā)生氧化損傷，導(dǎo)致精子活力下降或死亡，影響精液品質(zhì)，降低母豬受胎率[5]。因此，在精液常溫保存中，為了防止過多的活性氧（ROS）引起氧化應(yīng)激，并保護(hù)和提升精子的活力，在稀釋精液或使用稀釋粉時(shí)，添加抗氧化劑是一項(xiàng)關(guān)鍵措施[6]。研究報(bào)道，CMCS具有清除氧自由基功能，是一種理想的天然抗氧化劑[4，7]。因此，探索CMCS對(duì)豬精液常溫保存效果研究，可為下一步開發(fā)出穩(wěn)定高效的CMCS稀釋配方提供理論依據(jù)，以期提升豬精液常溫保存質(zhì)量。

T-AOC是反映生物體防御氧化損傷能力的重要指標(biāo)，T-AOC 活性越強(qiáng)，抵抗氧化損傷能力越強(qiáng);MDA含量是精子膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，含量越高，說明精子各部位損害越大。本研究結(jié)果表明，添加CMCS能夠顯著增強(qiáng)總抗氧化能力（T-AOC），并有效降低丙二醛（MDA）含量，說明適量添加CMCS能在一定程度上清除自由基，這與王騫等[8]研究結(jié)果基本一致。其次，ROS是細(xì)胞需氧代謝過程中產(chǎn)生的不穩(wěn)定代謝產(chǎn)物，主要包括SOD、CAT 和 GSH-PX，是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)細(xì)胞代謝系統(tǒng)中抗氧化水平重要指標(biāo)，如左旋肉堿能促進(jìn)SOD、GSH-PX 和乳酸脫氫酶（LDH）的合成，發(fā)揮抗氧化作用[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)常溫保存過程中，添加CMCS可以顯著降低 ROS活性，提高SOD、CAT 和 GSH-PX活性。因此， CMCS能在精液常溫保存環(huán)境中發(fā)揮抗氧化能力，提升精子保存效果。

殼聚糖對(duì)真菌、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都表現(xiàn)出抗菌活性，已被廣泛應(yīng)用于抗菌領(lǐng)域，其中化學(xué)改性可顯著提高殼聚糖抗菌活性，例如羧甲基化改性不僅可以提高殼聚糖的水溶性，還能擴(kuò)大其抗菌譜。使用不同類型的殼聚糖進(jìn)行體外抗枯草桿菌和大腸桿菌試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水溶性殼聚糖的抗菌效能優(yōu)于高分子量殼聚糖[10]。

3.2 結(jié)論

本研究在常溫條件下添加不同濃度CMCS，并在不同時(shí)間觀察不同處理組的細(xì)菌含量變化情況，結(jié)果顯示，添加CMCS的處理組有明顯的抑菌效果，這與謝東淇[11]研究結(jié)果相似。另外，本課題組前期研究報(bào)道，天津地區(qū)公豬精液中細(xì)菌攜帶比例高達(dá)38.87%（192/494），其中變形桿菌屬（Proteus）最高，為26.53%（52/192），并且豬對(duì)四環(huán)素、林可霉素等已產(chǎn)生高度耐藥性[12]。本研究對(duì)精液中細(xì)菌進(jìn)行了分離鑒定，遺傳進(jìn)化樹顯示，3株細(xì)菌均為變形桿菌屬成員，原因推測(cè)為豬精液在采集過程中受到污染，這提示人們應(yīng)注意采集規(guī)范化操作。同時(shí)，添加CMCS的處理能夠抑制細(xì)菌增長。由于本研究的樣品數(shù)量相對(duì)較少，建議在后續(xù)研究中加大樣品的數(shù)量以及跟蹤母豬臨床繁殖效果，以進(jìn)一步完善評(píng)估CMCS在精液中應(yīng)用效果。

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作者簡介：唐佩娟（1979—），女，天津人，獸醫(yī)師，碩士，主要從事畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)技術(shù)推廣研究。

通訊作者簡介：付永利（1964—），男，天津人，高級(jí)畜牧師，主要從事畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣服務(wù)研究。