冷 婧，溫國(guó)平，張雪麗，王宏圖，胡建軍，張 偉

（1.塔里木大學(xué)兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300；2.阿克蘇地區(qū)沙雅中等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，新疆沙雅 842200；3.塔里木大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；4.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；5.阿克蘇市西域牧業(yè)發(fā)展有限公司，新疆阿克蘇 843000）

支原體種類繁多，在自然界中廣泛存在，能感染牛且有致病性的支原體主要有牛支原體（Mycoplasmabovis，M.bovis）、 牛鼻支原體（Mycoplasmabovirhinis，M.bovirhinis）、殊異支原體（Mycoplasmadispar，M.dispar）和精氨酸支原體（Mycoplasmaarginini，M.arginini）。1983年，我國(guó)首次成功分離到6 株牛支原體[1-2]。支原體可通過(guò)飛沫或接觸傳播，感染牛后可引發(fā)呼吸系統(tǒng)綜合征、結(jié)膜炎、中耳炎、乳腺炎、關(guān)節(jié)炎等疾病[3-8]，嚴(yán)重時(shí)能導(dǎo)致患畜死亡，通常在規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)呈季節(jié)性流行。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，支原體耐藥性逐漸增強(qiáng)，部分菌株呈多重耐藥，而目前市面上可用于支原體病治療的抗生素較少，嚴(yán)重影響臨床治療效果[9～11]。

圖1 鼻拭子支原體16S rRNA 基因PCR 鑒定結(jié)果

為進(jìn)一步掌握新疆南疆地區(qū)集約化奶牛場(chǎng)支原體的分子特征及耐藥現(xiàn)狀，采集8 個(gè)集約化奶牛場(chǎng)犢牛鼻拭子樣品進(jìn)行了支原體分離純化、分子生物學(xué)鑒定、形態(tài)學(xué)鑒定、生化鑒定及耐藥基因檢測(cè)，以期為該地區(qū)牛支原體病防控提供數(shù)據(jù)支撐，為指導(dǎo)該地臨床用藥，研發(fā)牛支原體病疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2021年12月—2022年3月，采集新疆南疆地區(qū)8 個(gè)集約化奶牛場(chǎng)有咳喘、流鼻涕等呼吸道癥狀的1月齡犢牛鼻拭子樣本41 份，置于-80 ℃保存。樣品信息見表1。

表1 樣品信息表

1.1.2 主要試劑與儀器 PPLO 肉湯、支原體肉湯、瓊脂，購(gòu)于生工生物工程有限公司；生化鑒定管、藥敏試紙，購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司；DL 2 000 DNA Marker、2 ×TaqPCR Master Mix、DNA 凝膠回收試劑盒、TIAN gel Midi Purification Kit，購(gòu)于天根生化科技有限公司；丙酮酸鈉、氨芐青霉素鈉，購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。PCR儀，購(gòu)于TECHNE 公司；電泳儀，購(gòu)于Thermo Fisher 公司；凝集成像儀，購(gòu)于Bio-RAD 公司。

1.1.3 引物合成 參照文獻(xiàn)[12-13]合成支原體16S rRNA 通用引物，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物信息見表2。

表2 引物信息表

1.2 方法

1.2.1 菌株分離 將鼻拭子樣本經(jīng)0.22 μm 濾器過(guò)濾后，加入PPLO 肉湯/支原體肉湯中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d；待培養(yǎng)基由橙紅色變?yōu)辄S色時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，按1:10 比例傳代3 次；將培養(yǎng)液按10-1～10-3稀釋，分別取100 μL 涂布于PPLO 瓊脂/支原體瓊脂上，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 d。

1.2.2 菌株DNA 提取 取2 mL 液體培養(yǎng)物，經(jīng)13 000 r/min 離心30 min 后棄上清液；用0.1 mol/L PBS 緩沖液沖洗沉淀3 次后，加入50 μL PBS 緩沖液煮沸10 min，立即冰浴15 min；5 000 r/min 離心5 min 后取上清液，即為DNA 模板，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR 鑒定 PCR 反應(yīng)體系：2×TaqMaster Mix 8.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板3.0 μL，ddH2O 8.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將反應(yīng)產(chǎn)物送至上海派森諾生物公司測(cè)序，將獲得的序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)，使用DNAstar 進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.2.4 形態(tài)學(xué)鑒定

1.2.4.1 鏡檢 在固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)4～6 d后，在顯微鏡下觀察形態(tài)。

1.2.4.2 Dienes 染色 在培養(yǎng)分離株的固體培養(yǎng)基表面滴加10 倍稀釋的Dienes 染液，1～2 min 后棄掉染液，用PBS 或生理鹽水沖洗2 次，3 min/次，吸盡液體。

1.2.5 生化鑒定 按試劑說(shuō)明書分別對(duì)分離株進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、甘露醇分解試驗(yàn)、精氨酸水解試驗(yàn)和明膠液化實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 耐藥基因檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[14～17]合成6類19 種耐藥基因的特異性引物進(jìn)行檢測(cè)。引物信息見表3。

表3 耐藥基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 PCR 鑒定

用支原體16S rRNA 通用引物檢測(cè)41 份鼻拭子樣品。結(jié)果（圖1）顯示，有16 份鼻拭子樣品檢出1 021bp 目的片段。

對(duì)16 份支原體陽(yáng)性牛鼻拭子樣品進(jìn)行核苷酸序列同源性比對(duì)。結(jié)果（表4）顯示：共檢出4 種支原體，分別為牛支原體43.75%（7/16）、牛鼻支原體18.75%（3/16）、殊異支原體18.75%（3/16）和精氨酸支原體18.75%（3/16）。8 個(gè)集約化奶牛場(chǎng)的支原體個(gè)體陽(yáng)性率為25.00%～60.00%，場(chǎng)群陽(yáng)性率為100%（8/8）。4 種支原體在阿克蘇地區(qū)均有檢出，最常檢出的是牛支原體單感染，其次為殊異支原體+牛鼻支原體混合感染。

表4 8 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)牛支原體PCR 檢測(cè)結(jié)果

將其中8 個(gè)陽(yáng)性鼻拭子樣本序列分別命名為牛支原體NZ1、NZ2，殊異支原體SY1、SY2，牛鼻支原體NB1、NB2，精氨酸支原體JAS1、JAS2。使用DNAstar 進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建。結(jié)果（圖2）顯示：NZ1 與匈牙利流行株（登錄號(hào)KX462371）同源性達(dá)92.4%，NZ2 與美國(guó)流行株（登錄號(hào)NR_102850）、瑞典流行株（登錄號(hào)U02968）同源性高達(dá)100%；SY1、SY2 與英國(guó)流行株（登錄號(hào)NR_025182）同源性達(dá)99.3%～99.5%；NB1與美國(guó)流行株（登錄號(hào)NR_025986）、日本流行株（登錄號(hào)LC158834）同源性達(dá)94.3～97.6%，NB2 與土耳其流行株（登錄號(hào)MK789478）同源性達(dá)100%；JAS1、JAS2 與美國(guó)流行株（登錄號(hào)U15794、HQ661819）、日本流行株（登錄號(hào)LC158832）、土耳其流行株（登錄號(hào)MK789485）的同源性達(dá)99.5%～99.9%。

圖2 支原體16S rRNA 序列系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

2.2.1 鏡檢 通過(guò)分離培養(yǎng)，共獲得6 株支原體，其中牛支原體4 株、殊異支原體2 株。在體視顯微鏡下觀察，可看到具有中心臍的“煎蛋樣”菌落，與典型支原體菌落形態(tài)一致（圖3～4）。

圖3 牛支原體菌落形態(tài)

圖4 殊異支原體菌落形態(tài)

2.2.2 Dienes 染色 分別取1 株牛支原體和殊異支原體進(jìn)行Dienes 染色。結(jié)果（圖5～6）顯示，菌落呈中心深藍(lán)色，邊緣淺藍(lán)色的透明圈。

圖5 牛支原體Dienes 染色形態(tài)（60×）

圖6 殊異支原體Dienes 染色形態(tài)（40×）

2.3 生化鑒定

對(duì)2 種支原體分離株分別進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果分別符合牛支原體和殊異支原體的生化特性（表5）。

表5 生化鑒定結(jié)果

2.4 耐藥基因檢測(cè)

對(duì)6 株支原體分離株進(jìn)行6 類19 種耐藥基因檢測(cè)。結(jié)果顯示，牛支原體的TEM、tetC、gyrA基因檢出率均為100%，parC檢出率為75%（阿克蘇地區(qū)C 場(chǎng)未檢出），其余15 種耐藥基因均未被檢測(cè)到；殊異支原體的TEM、tetC、gyrA、parC基因檢出率均為100%，其余15 種耐藥基因均未被檢測(cè)到。

3 討論

支原體感染難以治愈，是引發(fā)牛呼吸系統(tǒng)疾病的重要病原之一。我國(guó)目前關(guān)于牛支原體的研究相對(duì)較多，但關(guān)于牛鼻支原體、殊異支原體、精氨酸支原體的報(bào)道仍十分少見。2018年馬艷君等[18]研究發(fā)現(xiàn)，四川省部分地區(qū)存在牛支原體、殊異支原體和牛鼻支原體感染。本試驗(yàn)通過(guò)分析陽(yáng)性樣本序列證實(shí)，新疆南疆地區(qū)集約化奶牛場(chǎng)均存在牛支原體、牛鼻支原體、殊異支原體和精氨酸支原體感染，檢出率分別為43.75%、18.75%、18.75%和18.75%，其中檢出頻次最高的支原體組合是殊異支原體與牛鼻支原體，其次是殊異支原體和牛支原體，而3 種或4 種支原體同時(shí)存在于一個(gè)場(chǎng)的檢出率為0；遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，4 類支原體與國(guó)外多個(gè)流行株同源性為92.4%～100%。以上結(jié)果說(shuō)明，新疆南疆地區(qū)存在多種支原體流行，其感染組合模式也與國(guó)外研究[19-21]相似，極有可能是由境外輸入我國(guó)的，這提示相關(guān)部門應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)引進(jìn)檢疫工作，防控輸入型流行株感染。

因未設(shè)置支原體藥敏試驗(yàn)對(duì)照菌株，故本研究進(jìn)行了耐藥基因檢測(cè)。結(jié)果顯示：牛支原體分離株檢測(cè)到4 種耐藥基因，頭孢菌素類TEM、喹諾酮類gyrA、四環(huán)素類tetC的檢出率均為100%，喹諾酮類parC基因的檢出率為75.0%，其余15 種耐藥基因均未被檢測(cè)到；殊異支原體分離株也檢測(cè)到4 種耐藥基因，頭孢菌素類TEM，喹諾酮類gyrA、parC和四環(huán)素類tetC 檢出率均為100%，其余15 種耐藥基因均未被檢測(cè)到；分離菌株含3 種、4 種耐藥基因的占比分別為16.67%、83.33%，與孟凡艷[22]等在新疆石河子地區(qū)進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)結(jié)果相似。

新疆南疆地區(qū)存在多種支原體流行，其耐藥情況不容樂觀，給該地區(qū)支原體病防控與治療帶來(lái)極大困難，應(yīng)引起足夠重視。