葛 婷，宋瑞其

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832003）

牛環(huán)形泰勒蟲（Theileriaannulata）是一種由璃眼蜱屬（Hyalommasp.）蜱蟲傳播的原生動物，可引起熱帶黃痿病[1]。患畜主要表現(xiàn)為發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大以及貧血等臨床癥狀[2-3]。該病主要在地中海、中東地區(qū)流行，我國也存在該病，其發(fā)病率和病死率均較高，給畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。念珠菌（假絲酵母，Candidatusmidichloriasp.）廣泛存在于人類、動物和自然環(huán)境中，是常見的條件致病菌。通常因?qū)σ赘袆游镩L期使用抗菌藥物，造成其黏膜屏障、免疫功能受損，從而感染念珠菌出現(xiàn)假絲酵母菌血癥（又稱為念珠菌菌血癥）[6]。念珠菌不僅在動物血液中被發(fā)現(xiàn)，在蜱唾液腺中也被檢測到[7]。無漿體是影響人類和動物健康的細(xì)胞內(nèi)革蘭氏陰性菌，其中綿羊無漿體（Anaplasma ovis）是主要種類之一[8]，在我國河北、貴州、浙江、新疆、甘肅、云南、河南、四川和青海等省（自治區(qū)）均有流行[8-15]。血液寄生蟲/菌病是威脅牛健康和生產(chǎn)力的重要因素之一，尤其是在畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的新疆地區(qū)。為對新疆托克遜縣一頭有癥狀牛進(jìn)行病原確定，采用光學(xué)顯微鏡（LM）觀察、常規(guī)血液檢測（RBT）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等方法進(jìn)行診斷，病牛最終被確診為牛環(huán)形泰勒蟲、念珠菌和綿羊無漿體混合感染。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例情況 2021年8月17日，新疆托克遜縣一頭4 歲的西門塔爾母牛表現(xiàn)出發(fā)熱（39.7 ℃）、瘤胃脹氣、肌肉震顫、流涎、血紅蛋白尿（血尿）和黃疸等一系列癥狀。動物醫(yī)院對患牛進(jìn)行了臨床和血常規(guī)檢查，并在其體表發(fā)現(xiàn)正在叮咬的蜱蟲。

1.1.2 試劑 組織/全血DNA 提取試劑盒，購自德國QIAGEN 公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；pMD18-T 載體，購自寶生物工程（大連）有限公司；大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純，所用水為超純水。

1.2 樣品采集

3 只蜱蟲樣品，采集自病牛體表。采集病牛耳尖靜脈血液，直接制備薄血液涂片；使用頸靜脈采血法，采集牛全血樣品置于含有EDTA 的抗凝管中，以備后續(xù)血常規(guī)檢測和DNA 提取用。

1.3 染色鏡檢

取10 μL 從耳尖靜脈采集的血液制備薄血液涂片，然后按標(biāo)準(zhǔn)程序[16]對血液涂片進(jìn)行吉姆薩染色。在雙目顯微鏡（Nikon Eclipse E 200）油浸鏡片下，對染色的血液涂片進(jìn)行觀察和拍照。

1.4 血常規(guī)檢測

血常規(guī)是臨床上最基礎(chǔ)的化驗(yàn)檢查之一。采用動物型血液分析儀測定采集的牛全血樣品血常規(guī)17 項(xiàng)參數(shù)：白細(xì)胞（WBC）、淋巴細(xì)胞（LYM）、單核細(xì)胞（MONO）、中性粒細(xì)胞（NEU）、淋巴細(xì)胞百分比（LYM/%）、單核細(xì)胞百分比（MONO/%）、中性粒細(xì)胞百分比（NEU/%）、紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血紅蛋白壓積（HCT）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、平均血紅蛋白含量（MCH）、平均血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細(xì)胞分布寬度CV（RDWR）、紅細(xì)胞分布寬度SD（RDWA）、血小板（PLT）、平均血小板體積（MPV）。

1.5 DNA 提取

取200 μL 抗凝牛全血樣品，備用；取蜱蟲3 只，以PBS 清洗3 次后經(jīng)液氮研磨成粉狀，置于1.5 mL EP 管中，加入200 μL PBS 溶解，備用。使用組織/全血DNA 提取試劑盒，分別對全血樣品和蜱蟲處理樣品進(jìn)行DNA 提取，并將提取的DNA 保存在-20 ℃冰箱備用。

1.6 PCR 檢測

根據(jù)血涂片鏡檢結(jié)果，對牛環(huán)形泰勒蟲、念珠菌和綿羊無漿體特定基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件詳見參考文獻(xiàn)[17-20]）。牛環(huán)形泰勒蟲擴(kuò)增引物為18S-seq-F、18S-seq-R 和Tams 1-seq-F、Tams 1-seq-R；采用套式PCR 擴(kuò)增念珠菌16S rRNA 基因，初始擴(kuò)增引物為EC9 和EC12A，第二輪擴(kuò)增引物為IS58-62f 和IS58-594r；綿羊無漿體PCR檢測，選用裂殖子表面蛋白4基因（MSP4）為目的基因，擴(kuò)增引物為MSP4-F 和MSP4-R。引物信息詳見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列及目的條帶大小

擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定無誤后，以DNA 回收試劑盒進(jìn)行回收；將回收產(chǎn)物分別連接至pMD18-T 載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞；挑取單菌落接種于含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基，待菌液擴(kuò)繁后收集500 μL 菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.7 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

根據(jù)獲得的牛環(huán)形泰勒蟲Tams1、念珠菌16S rRNA 和綿羊無漿體MSP4等基因序列，分別構(gòu)建3 種病原的系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用MEGA version 6.06軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，采用相鄰連接法，選擇Tamura 3參數(shù)模型，伽馬分布值設(shè)置為0.84，采用1 000 次引導(dǎo)重復(fù)計算、UPGMA 和節(jié)點(diǎn)支持的統(tǒng)計方法[21-22]。

2 結(jié)果

2.1 染色鏡檢

對染色的血液涂片進(jìn)行鏡檢觀察和拍照。結(jié)果（圖1）顯示，在顯微鏡下可見紅細(xì)胞間存在大量呈卵圓形的芽孢和絲狀的假菌絲，疑似念珠菌（圖1-A 中黑色箭頭）；紅細(xì)胞內(nèi)存在1 個或2 個較大的圓形/卵圓形病原，疑似牛環(huán)形泰勒蟲（圖1-B中紅色箭頭）；紅細(xì)胞內(nèi)有單個細(xì)小原點(diǎn)狀病原，疑似綿羊無漿體（圖1-B 中藍(lán)色箭頭）。

圖1 血液涂片鏡檢結(jié)果（比例尺5 μm）

2.2 血常規(guī)檢測

血常規(guī)檢測結(jié)果（表2）顯示，血紅蛋白、血紅細(xì)胞壓積、平均血紅蛋白濃度、中性粒細(xì)胞、血小板和淋巴細(xì)胞百分比等指標(biāo)均有不同程度改變。結(jié)果提示，該牛機(jī)體存在貧血和炎癥反應(yīng)。

表2 血常規(guī)檢測報告單

2.3 PCR 檢測

使用前面所述的物種特異性引物，分別對所提取的血液、蜱蟲DNA樣品進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果（圖2）顯示：對于血液樣品，牛環(huán)形泰勒蟲、念珠菌和綿羊無漿體PCR 檢測均呈陽性；對于蜱蟲樣品，僅牛環(huán)形泰勒蟲18S rRNA 基因PCR 檢測為陽性，其他均為陰性。

圖2 PCR 檢測結(jié)果

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

2.4.1 牛環(huán)形泰勒蟲 18S rRNA 和Tams1基因被認(rèn)為是泰勒蟲屬/巴貝斯蟲屬鑒定和基因分型的潛在靶點(diǎn)?；?8S rRNA 基因的序列分析顯示，新疆托克遜縣牛環(huán)形泰勒蟲株與相應(yīng)土耳其株（宿主：盾陷璃眼蜱；GenBank sequence ID：MK918607）、中國株（宿主：瘤牛；GenBank sequence ID：MK415058）、伊拉克株（宿主：駱駝 科；GenBank sequence ID：MK855091）、 阿爾及利亞株（宿主：具環(huán)方頭蜱/牛蜱；GenBank sequence ID：MH327776）和巴基斯坦株（宿主：牛；GenBank sequence ID：MG599091） 均具有100%的同源性，說明18S rRNA 基因過于保守，不適于構(gòu)建進(jìn)化樹?；赥ams1基因的序列分析顯示，新疆托克遜縣牛環(huán)形泰勒蟲株Tams1基因序列與我國河南株（GenBank sequence ID：KX904526）和突尼斯株（GenBank sequence ID：AF214905）同源性分別為99.25%和98.16%，與印度株（GenBank sequence ID：KT222946）和英國株（GenBank sequence ID：KX981032）同源性均為97.0%，與埃及株（GenBank sequence ID：AB917290） 和蘇丹株（GenBank sequence ID：AF214831）同源性均為96.0%。結(jié)果表明，Tams1基因序列在牛泰勒蟲屬中呈現(xiàn)出多樣性[23]，故可基于該基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析?；赥ams1基因構(gòu)建的進(jìn)化樹（圖3）顯示，本研究分離的牛環(huán)形泰勒蟲株與河南株的遺傳距離最近，其次是突尼斯株，而與蘇丹株遺傳距離最遠(yuǎn)（與同源性比對結(jié)果相一致）。因此，Tams1基因更適用于PCR 診斷牛環(huán)形泰勒蟲感染。

圖3 基于部分牛環(huán)形泰勒蟲Tams 1 基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4.2 念珠菌 同源性比對結(jié)果顯示，本研究檢出的念珠菌16S rRNA 基因序列與意大利菌株HM9（宿主：邊緣璃眼蜱；GenBank sequence ID：LT898326）[24]關(guān)系最為相近（同源性96.26%），與澳大利亞菌株Ixholo2（宿主：全環(huán)硬蜱；GenBank sequence ID：FM992373）[25]和泰國菌株Hw191（宿主：微形血蜱；GenBank sequence ID：AF497582）[25]同源性較低，分別為95.23% 和93.52%。基于念珠菌16S rRNA 基因構(gòu)建的進(jìn)化樹（圖4）顯示，本研究檢出的念珠菌菌株自成一分支，推測這可能與地域和種間差異有關(guān)。

圖4 基于部分念珠菌16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4.3 綿羊無漿體 同源性比對結(jié)果顯示，病牛攜帶的綿羊無漿體MSP4基因序列與美國株（宿主：黑尾鹿；GenBank sequence ID：DQ320146）同源性為97.91%，與土耳其株（宿主：羊；GenBank sequence ID：KY283958） 和中國株（宿主：羊；GenBank sequence ID：HQ456349）同源性均為96.26%，與蒙古國株（宿主：山羊；GenBank sequence ID：LC4120088） 同源性為96.17%?；贛SP4基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹（圖5）顯示：病牛攜帶的綿羊無漿體自成一分支，與美國株的遺傳距離最近，與蒙古國株相距最遠(yuǎn)。

圖5 基于部分綿羊無漿體MSP4 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

本研究采用臨床診斷、鏡檢、血常規(guī)檢測、PCR 檢測等方法，對新疆托克遜縣患病牛進(jìn)行了全面檢查，最終確認(rèn)病牛同時被牛環(huán)形泰勒蟲、念珠菌和綿羊無漿體等3 種病原感染。

血涂片鏡檢結(jié)果顯示，病牛疑似存在牛環(huán)形泰勒蟲、念珠菌和綿羊無漿體混合感染。該牛表現(xiàn)為嚴(yán)重的瘤胃脹氣癥狀，可能與感染血液寄生蟲后瘤胃反芻遲緩有關(guān)[26]。血常規(guī)檢測結(jié)果顯示，血紅蛋白壓積低于正常值（僅22.9%），血小板值高達(dá)858×109/L，推測是因病原感染造成紅細(xì)胞破裂和動物機(jī)能受損引起的[27]，從而導(dǎo)致患牛表現(xiàn)貧血、肌肉震顫和共濟(jì)失調(diào)等癥狀[3]。另外，細(xì)菌和其他病原體可與血小板發(fā)生直接或間接的相互作用[27]，使宿主機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[28]，從而呈現(xiàn)出血小板值偏高和平均血小板體積偏低等現(xiàn)象；白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞偏低、淋巴細(xì)胞百分比偏高，則預(yù)示著感染可能造成了免疫系統(tǒng)功能下降[29]。

PCR 檢測結(jié)果顯示，在牛全血和體表蜱蟲中均檢出牛環(huán)形泰勒蟲18S rRNA 基因陽性，表明患?？赡鼙粩y帶牛環(huán)形泰勒蟲的蜱蟲叮咬而感染。但蜱蟲樣品中牛環(huán)形泰勒蟲Tams1基因檢測結(jié)果為陰性，推測可能由于Tams1是牛環(huán)形泰勒蟲在紅細(xì)胞內(nèi)裂殖子期的表面抗原基因，故在蜱蟲（牛環(huán)形泰勒蟲子孢子期）樣品中未被檢測出。牛環(huán)形泰勒蟲通過媒介蜱蟲傳播，這可能是該病在當(dāng)?shù)貜V泛流行的一個重要因素[30-31]。牛環(huán)形泰勒蟲在我國主要分布于北方半干旱和荒漠草原，包括新疆、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古、陜西、山西、黑龍江、吉林、遼寧、河北、山東、河南和湖北等地[30]。新疆牛環(huán)形泰勒蟲感染率高達(dá)65%，導(dǎo)致的急性死亡率為30～50%[32]，特別在吐魯番托克遜縣，該病原非常流行。據(jù)報道[33]，2014—2016年托克遜縣約49.46%（412/835）的無癥狀牛血檢呈牛環(huán)形泰勒蟲陽性。在托克遜縣，蜱蟲是牛環(huán)形泰勒蟲的主要傳播媒介[34]，但并未在其體內(nèi)檢測出念珠菌屬和綿羊無漿體等病原。然而，在意大利北部[35]、尼日利亞[36]、加拿大哈巴羅夫斯克[37]、俄羅斯[38]和伊朗[39]等國家（地區(qū)）媒介硬蜱上曾發(fā)現(xiàn)念珠菌。另外，綿羊無漿體是反芻動物蜱傳熱的病原體，可由草原革蜱、森林革蜱、邊緣革蜱[40]和銀盾革蜱[41]等傳播。該病在新疆阿克蘇、喀什[42-43]、昌吉和呼圖壁[44]等地區(qū)均有報道，因此不排除托克遜縣媒介蜱蟲未攜帶、傳播這些病原，這有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，3 種病原在不同地區(qū)、不同宿主間存在基因差異，這可能由于地理隔離、遺傳分化等因素造成。目前，牛環(huán)形泰勒蟲、念珠菌和綿羊無漿體混合感染牛只的病例尚未見報道，然而這些疾病存在對牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成經(jīng)濟(jì)損失等潛在風(fēng)險。蜱蟲在疾病傳播中起到了關(guān)鍵作用，因此要加強(qiáng)對蜱蟲的防控以及提升病原檢測能力，從而促進(jìn)新疆牛產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，提高邊疆地區(qū)牧民生活水平。