胡毅軍，丁文桂，黃潔瑩，羅 律，賴 穎，王自強(qiáng)，李 敏，張險(xiǎn)朋

（1.東莞市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東東莞 523086；2.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣東廣州 511400）

水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展極大刺激了內(nèi)陸水域魚類養(yǎng)殖產(chǎn)量的增長(zhǎng)。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)：從1990年到2020年全球水產(chǎn)養(yǎng)殖年產(chǎn)量增長(zhǎng)了609%，年均增速為6.7%，總產(chǎn)量達(dá)8 800萬(wàn)t[1]。自1991年起我國(guó)羅非魚養(yǎng)殖總量一直高于全球其他國(guó)家產(chǎn)量的總和，到2021年羅非魚產(chǎn)量達(dá)到166.26 萬(wàn)t，約占全球產(chǎn)量的1/3。羅非魚養(yǎng)殖業(yè)在蓬勃發(fā)展的同時(shí)也遭受到各種病原體的威脅，包括細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等，其中細(xì)菌引起的死亡率最高[2-3]，嚴(yán)重影響了羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。羅非魚鏈球菌病已被公認(rèn)為是威脅全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的最重要疾病之一，在世界范圍內(nèi)廣泛分布。近年來(lái)，羅非魚鏈球菌病發(fā)病率明顯增加，造成的經(jīng)濟(jì)損失逐漸增大，2019年僅給亞洲國(guó)家就造成高達(dá)5 億美元的經(jīng)濟(jì)損失[1]。無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌是羅非魚鏈球菌病的主要病原。目前，針對(duì)這兩種病原的檢測(cè)方法主要有細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、膠體金免疫層析法（CICA）以及普通PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）。本文從病原學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)方面，綜述了羅非魚鏈球菌檢測(cè)方法的研究進(jìn)展和應(yīng)用情況，分析各種檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，以期為更好地預(yù)防和控制羅非魚鏈球菌病提供參考。

1 細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定

傳統(tǒng)上，無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌的檢測(cè)是基于病原體分離和生理生化特征鑒定來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在流行病學(xué)調(diào)查中，主要選擇死亡或垂死的魚，將其解剖后從腦、腎臟、肝臟、脾臟等器官少量取樣，然后接種于選擇性增菌肉湯培養(yǎng)基中（如加入慶大霉素、萘啶酸和綿羊血的Todd-Hewitt 肉湯培養(yǎng)基，或者加入黏桿菌素和萘啶酸的Lim 肉湯培養(yǎng)基），在35～37 ℃條件下培養(yǎng)18～24 h[4]。但競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)研究[5]發(fā)現(xiàn)：無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌濃度低于6×102CFU/mg（低于水中總細(xì)菌濃度，水族箱2.27×104CFU/mg、池塘6.68×103CFU/mg）時(shí)，將難以精準(zhǔn)分離到目標(biāo)菌；組織樣品中如果存在糞腸球菌等，就會(huì)抑制選擇性肉湯中無(wú)乳鏈球菌或海豚鏈球菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致傳代后培養(yǎng)物檢測(cè)為陰性，檢出率大幅降低。為避免這種假陰性結(jié)果，在接種選擇性肉湯培養(yǎng)基增菌前，可以在血平板、選擇性血平板（添加新霉素和萘啶酸或黏菌素和萘啶酸的血平板）、Granada 固體培養(yǎng)基或顯色固體培養(yǎng)基上劃線，35～37 ℃條件下培養(yǎng)（Granada 平板需厭氧環(huán)境）24～48 h 后再檢查菌落[6]。如果觀測(cè)到目標(biāo)菌落，則可以將其接種于選擇性肉湯培養(yǎng)基中增菌，從而縮短分菌時(shí)間，增加分菌率。擴(kuò)增培養(yǎng)過(guò)夜后，應(yīng)再次接種到固體培養(yǎng)基上傳代，直至細(xì)菌分離性狀穩(wěn)定，以備后續(xù)檢測(cè)。

近年來(lái)，用于分離、檢測(cè)致病菌的顯色培養(yǎng)基發(fā)展迅速，主要通過(guò)在培養(yǎng)基中添加與吲哚基顯色劑相連的酶底物來(lái)實(shí)現(xiàn)。在有氧環(huán)境下，吲哚分子氧化和二聚化形成靛藍(lán)染料，沉淀在菌落中[6]。經(jīng)過(guò)幾十年研究已有幾款用于無(wú)乳鏈球菌檢測(cè)的商用顯色培養(yǎng)基上市，包括bioMérieux 公司生產(chǎn)的ChromID Strepto B、Bio-Rad 公司生產(chǎn)的StrepB Select、Oxoid 公司生產(chǎn)的Brilliance GBS 以及CHROMagar 公司生產(chǎn)的CHROMagar StrepB 等。由于顯色底物的存在，配制好的培養(yǎng)基在儲(chǔ)存過(guò)程中須盡量減少光照，且須在黑暗中進(jìn)行培養(yǎng)，否則分離株的顯色結(jié)果將不可靠。顯色培養(yǎng)基為無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌的分離提供了一種相對(duì)快速簡(jiǎn)便的方法，但這種方法不具備良好的特異性和敏感性。實(shí)際應(yīng)用中，如果臨床樣品中存在其他種類的鏈球菌，如牛鏈球菌、豬鏈球菌、唾液鏈球菌、化膿性鏈球菌，以及腸球菌屬和葡萄球菌屬的部分菌種等，則都可以形成和無(wú)乳鏈球菌或海豚鏈球菌相似的顯色菌落，從而出現(xiàn)假陽(yáng)性可能。因此，為避免假陽(yáng)性，在使用顯色培養(yǎng)基的同時(shí)，仍須通過(guò)生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法來(lái)完成最終判定。

完善的生理生化特征試驗(yàn)一直是臨床鑒定細(xì)菌的基石。如今已經(jīng)開發(fā)出將多個(gè)常規(guī)表型測(cè)試集成到單個(gè)程序中的各種測(cè)試系統(tǒng)，如鑒定鏈球菌的快速生化鑒定盒（bioMérieux 公司生產(chǎn)的API Rapid Strep 鑒定試劑盒和Remel 公司生產(chǎn)的RapID STR 試劑盒）和自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)（API 20 Strep、API CH 50、Rapid Strept 32 以及Vitek 等）。在對(duì)各項(xiàng)生理生化試驗(yàn)結(jié)果判定后，結(jié)合鑒定系統(tǒng)中擬定的特征，生成一個(gè)生物型編號(hào)，再將編號(hào)與數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，識(shí)別細(xì)菌種類。然而，這些系統(tǒng)識(shí)別微生物的能力取決于數(shù)據(jù)庫(kù)的準(zhǔn)確性及物種覆蓋度。盡管這些試劑盒和系統(tǒng)可用于鑒定無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌，但也并非100%準(zhǔn)確。就無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌而言，因其表型相似，可能導(dǎo)致錯(cuò)誤識(shí)別，且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，從分離到生理生化鑒定至少需3～5 d。

2 免疫學(xué)方法

免疫檢測(cè)技術(shù)是利用特異性抗體或細(xì)胞免疫反應(yīng)等生物學(xué)特性，對(duì)病原、藥物、生物標(biāo)志物等進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)?，F(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)通過(guò)引入酶催反應(yīng)、熒光或同位素標(biāo)記等作為抗原抗體特異性結(jié)合的特異性指標(biāo)，使靈敏、快速的診斷檢測(cè)技術(shù)建立成為可能，并發(fā)展出多種免疫學(xué)檢測(cè)方法。免疫檢測(cè)技術(shù)在人類醫(yī)學(xué)以及獸醫(yī)、水產(chǎn)及其他領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，如臨床診斷、抗體檢測(cè)、藥物研發(fā)、食品安全檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA 是基于酶催化反應(yīng)來(lái)提高抗原抗體特異性結(jié)合的一種高敏感性免疫測(cè)定技術(shù)，被廣泛用于多種病原微生物檢測(cè)，是過(guò)去幾十年最成功的檢測(cè)技術(shù)之一。無(wú)乳鏈球菌間接ELISA 檢測(cè)方法[7-8]，是以魚源無(wú)乳鏈球菌為抗原，通過(guò)免疫兔獲得的高效價(jià)多克隆抗體作為一抗，以辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG 作為酶標(biāo)二抗，將待檢組織樣品經(jīng)勻漿反復(fù)凍融后用于檢測(cè)，其抗原最佳包被濃度為l06CFU/mL，最低檢測(cè)限為103～104CFU/mL，在發(fā)病羅非魚中的病原檢出率為80%～100%，在無(wú)癥狀帶菌羅非魚組織中的病原檢出率為0～50%，其中脾臟中的檢出率高于腦和肝臟。但也有報(bào)道[9]稱，羅非魚無(wú)乳鏈球菌雙抗體夾心ELISA 檢測(cè)方法靈敏度僅為0.85×106CFU/mL，不能滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)需求。目前針對(duì)無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌的研究中，ELISA 技術(shù)更多的是被應(yīng)用于宿主特異性抗體水平評(píng)價(jià)[10-13]和蛋白鑒定[14-15]，而不是直接針對(duì)抗原的檢測(cè)。間接ELISA 檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低，以及對(duì)檢測(cè)儀器及試驗(yàn)人員技術(shù)要求低等優(yōu)勢(shì)，但因其發(fā)展晚、靈敏度不高、前處理繁瑣等，還不是當(dāng)前主流的檢測(cè)方法，仍有發(fā)展推廣空間。

2.2 膠體金免疫層析法（CICA）

CICA 是20世紀(jì)80—90年代，在ELISA、乳膠凝集試驗(yàn)、單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上開發(fā)出的，一種基于膠體金顆粒及抗原與抗體相互作用的快速免疫檢測(cè)方法。它結(jié)合了免疫反應(yīng)和色譜層析原理，用于檢測(cè)特定物質(zhì)（通常是抗原或抗體）的存在與否，因其具有操作方便、檢測(cè)時(shí)間短、裸眼即可觀察結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，在臨床診斷、抗體評(píng)價(jià)及藥物殘留檢測(cè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。2017年Wu 等[16]開發(fā)了一種針對(duì)于羅非魚無(wú)乳鏈球菌的膠體金免疫層析條，用于快速檢測(cè)羅非魚無(wú)乳鏈球菌感染。該研究將獲得的無(wú)乳鏈球菌單克隆抗體4C12 和3A9 分別作為膠體金單克隆抗體偶聯(lián)物和捕獲抗體，用于特異性檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌。該方法允許用于養(yǎng)殖場(chǎng)所，靈敏度為1.5×104CFU/mL，測(cè)定時(shí)間少于15 min，是當(dāng)前相同靈敏度中的最方便快捷的檢測(cè)方法，具有一定的實(shí)際推廣應(yīng)用價(jià)值，但其靈敏度仍有待提高。周雅[17]基于夾心法免疫結(jié)合原理，建立了海豚鏈球菌膠體金層析試紙條檢測(cè)法。免疫Balb/c 雌鼠后，將其脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0 進(jìn)行電融合，經(jīng)篩選和亞克隆得到單抗分泌細(xì)胞株6C11 和6G8；后以單抗6C11 標(biāo)記膠體金，單抗E1H8 包被檢測(cè)線，建立了膠體金試紙條系統(tǒng)。該方法檢測(cè)限可達(dá)2×105CFU/mL，但在對(duì)6 株常見(jiàn)魚類致病菌的特異性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對(duì)3 株革蘭氏陽(yáng)性菌也呈現(xiàn)陽(yáng)性，因而其特異性并不強(qiáng)，仍然需要進(jìn)一步完善。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

隨著新技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，對(duì)病原微生物的研究已從常規(guī)的病原學(xué)分離鑒定深入到分子生物學(xué)水平，基于分子生物學(xué)的無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌檢測(cè)方法陸續(xù)被建立。分子生物學(xué)檢測(cè)方法既可以定性，也可以定量，甚至可以區(qū)分菌的血清型或判斷毒力因子基因的有無(wú)。

3.1 普通PCR 方法

PCR 方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行快速準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷。近年來(lái)，PCR 方法已被廣泛應(yīng)用于無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌檢測(cè)，并取得了顯著進(jìn)展。Mata 等[18]開發(fā)了基于海豚鏈球菌乳酸氧化酶基因（lctO）的PCR 檢測(cè)方法。該方法可快速、特異地檢測(cè)不同樣品中的海豚鏈球菌，其擴(kuò)增產(chǎn)物為870 bp，檢測(cè)限為（31～62）×103CFU/mL。該研究還證實(shí)了lctO基因是開發(fā)海豚鏈球菌PCR 檢測(cè)方法的合適基因靶標(biāo)。Zhou 等[19]通過(guò)對(duì)海豚鏈球菌10 個(gè)分離株和1 個(gè)參考菌株（ATCC29178）的16S—23S rRNA 基因間隔區(qū)（ITS）進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)，設(shè)計(jì)了用于檢測(cè)海豚鏈球菌的PCR 引物。該方法檢測(cè)固體培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)物或受感染魚組織中的海豚鏈球菌。過(guò)去針對(duì)無(wú)乳鏈球菌的PCR檢測(cè)方法多用于乳制品和人類樣品檢測(cè)，但其許多引物會(huì)與海豚鏈球菌發(fā)生交叉反應(yīng)，因而不能滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的需求。Cui 等[20]根據(jù)無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌ITS 序列的差異設(shè)計(jì)PCR 引物，建立了能夠同時(shí)檢測(cè)和區(qū)分羅非魚無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌的PCR 方法，但由于普通PCR 方法的局限性，其檢測(cè)限僅能達(dá)到105CFU/mL。在最近的研究中，Leigh 等[21]基于無(wú)乳鏈球菌的groEL2基因設(shè)計(jì)引物建立了PCR 方法，其對(duì)分離自魚類以及陸地和水生哺乳動(dòng)物的97 個(gè)無(wú)乳鏈球菌分離株都可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)片段的有效擴(kuò)增，且與10 株海豚鏈球菌和其他22 個(gè)相近菌株無(wú)交叉反應(yīng)，解決了水產(chǎn)養(yǎng)殖中無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌感染魚類臨床癥狀相似、基因組高度相似、引物特異性差、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)難以區(qū)分等問(wèn)題。

3.2 多重 PCR 方法

多重PCR 又稱多重引物PCR，是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種技術(shù)，其在一個(gè)PCR 體系中加入多對(duì)特異性引物，可同時(shí)擴(kuò)增不同的DNA片段，能同時(shí)快速檢測(cè)多種病原體或不同的細(xì)菌血清型，大大提高了檢測(cè)效率，節(jié)省了人力、物力和財(cái)力。為方便大規(guī)模調(diào)查與養(yǎng)殖魚類疾病有關(guān)的細(xì)菌，并評(píng)估這些致病菌對(duì)養(yǎng)殖魚類的影響程度，Diyie 等[22]建立了可同時(shí)檢測(cè)海豚鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌和柱狀黃桿菌等6 種致病菌的多重PCR 檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)14.9%的羅非魚存在這6 種菌的混合感染，其中海豚鏈球菌檢出率最高（88%），無(wú)乳鏈球菌次之（72%）。多重PCR 技術(shù)不但可以同時(shí)檢測(cè)多種病原體，也能實(shí)現(xiàn)細(xì)菌多種血清型的分型和多重毒力因子基因的檢測(cè)。為將泰國(guó)羅非魚養(yǎng)殖場(chǎng)分離的無(wú)乳鏈球菌進(jìn)行生物分型，并研究細(xì)菌血清型與毒力之間的相關(guān)性，Kannika 等[23]建立了14 種毒力基因的多重PCR 檢測(cè)方法，可用于預(yù)測(cè)分離株致病性并跟蹤其感染趨勢(shì)，另外還建立了黏附型、入侵型和免疫逃逸型3 種毒力基因類別的多重PCR 分型方法，可用于預(yù)測(cè)無(wú)乳鏈球菌的致病性。

3.3 實(shí)時(shí)熒光PCR 方法

實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)不僅具有傳統(tǒng)PCR 擴(kuò)增效率高的特點(diǎn)，而且具有特異性高、靈敏度高、精度高等特點(diǎn)。目前實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于各類病原微生物的檢測(cè)，同時(shí)還可以解決免疫學(xué)檢測(cè)的“窗口期”問(wèn)題，判斷感染是處于潛伏期還是亞臨床階段。此外，實(shí)時(shí)熒光PCR 可以定量檢測(cè)不同組織中的病原體，這是血清抗體檢測(cè)方法無(wú)法做到的。Su 等[24]根據(jù)16S—23S rRNA 基因間隔區(qū)片段設(shè)計(jì)了1 對(duì)引物IGS-s/IGS-a，建立了用于檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法，可用于調(diào)查受感染魚的細(xì)菌組織嗜性，以及監(jiān)測(cè)恢復(fù)期魚的細(xì)菌定殖。相較于傳統(tǒng)微生物分離鑒定方法（金標(biāo)準(zhǔn)）和普通PCR 方法，實(shí)時(shí)熒光PCR 方法優(yōu)點(diǎn)突出。Ferreira 等[25]對(duì)在母體定殖的無(wú)乳鏈球菌檢測(cè)方法對(duì)比研究中發(fā)現(xiàn)，金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)的定殖率為3.8%，普通PCR 為17.7%，而實(shí)時(shí)熒光PCR為29.2%。與金標(biāo)準(zhǔn)和普通PCR 方法相比，實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法具有更好的性能，更適用于常規(guī)篩查，是新生兒無(wú)乳鏈球菌感染的有效篩查方法。He 等[5]在對(duì)華南羅非魚主產(chǎn)區(qū)鏈球菌病的流行病學(xué)調(diào)查中，共采集了387 條羅非魚樣本，其中疑似健康24 條、垂死35 條、死魚328 條，對(duì)這3種樣本，細(xì)菌分離鑒定檢出率分別為0、100%和94.82%，而實(shí)時(shí)熒光PCR 檢出率分別為0、100%和98.78%。目前針對(duì)海豚鏈球菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法研究較少，2021年研究者首次對(duì)該方法的特異性、適用性、靈敏度、再現(xiàn)性和效率進(jìn)行了驗(yàn)證，證實(shí)實(shí)時(shí)熒光PCR 方法可作為海豚鏈球菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的一種準(zhǔn)確和靈敏的常規(guī)檢測(cè)方法。丁文桂等[26]根據(jù)羅非魚無(wú)乳鏈球菌的Sip基因和海豚鏈球菌的LysR基因建立了雙重?zé)晒釶CR 方法，發(fā)現(xiàn)無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌的最低檢測(cè)限分別為29.6 和10.7 CFU/mL，與水生動(dòng)物疫病常見(jiàn)病原沒(méi)有交叉反應(yīng)，與細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定方法的符合率為100%，可以同時(shí)檢測(cè)和鑒別羅非魚無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌。

3.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（LAMP）

LAMP 是日本學(xué)者Notomi 于2000年開發(fā)的一種核酸擴(kuò)增技術(shù)，因其簡(jiǎn)單、快速且無(wú)需昂貴的試劑和設(shè)備而受到廣泛關(guān)注[27]。Zhou 等[28]使用標(biāo)記有雙功能探針的金納米粒子（AuNP）和LAMP技術(shù)相結(jié)合建立了海豚鏈球菌LAMP-AuNP 檢測(cè)方法。該研究基于AuNPs 自聚集和與配體生物偶聯(lián)的特點(diǎn)，使結(jié)果可以通過(guò)顏色變化實(shí)現(xiàn)肉眼觀察，并與LAMP 擴(kuò)增法串聯(lián)，使檢測(cè)方法具有高靈敏度和易操作的特點(diǎn)；同時(shí)，對(duì)雙探針的改進(jìn)充分利用了LAMP 方法的特性，使該檢測(cè)方法的結(jié)果得到了穩(wěn)定展示。該方法最低檢測(cè)限為102CFU/mL，與普通PCR 方法和AuNPs 檢測(cè)試紙條相比，其靈敏度更高，檢測(cè)時(shí)間少于2 h，且不需要PCR 擴(kuò)增儀，檢測(cè)人員在魚塘邊即可進(jìn)行方便快捷的檢測(cè)。Pepey等[29]采用FTA 洗提卡和LAMP 技術(shù)相結(jié)合的方式，建立了羅非魚無(wú)乳鏈球菌FTA-e/LAMP 檢測(cè)方法。該方法包括兩個(gè)主要步驟：首先使用FTA 洗提卡提取DNA，隨后對(duì)提取的DNA 進(jìn)行LAMP 反應(yīng)。該方法的體外靈敏度為1.9×102CFU/mL，但在特異性方面無(wú)法有效區(qū)分無(wú)乳鏈球菌和停乳鏈球菌，仍需優(yōu)化。另外，該方法不能確定反應(yīng)的終點(diǎn)，無(wú)法做到定量檢測(cè)，并且容易受到污染而造成假陽(yáng)性。

3.5 微滴式數(shù)字PCR 方法（ddPCR）

ddPCR 是在實(shí)時(shí)熒光PCR 方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新一代技術(shù)，可用于目標(biāo)核酸的絕對(duì)定量。在微滴生成器中，反應(yīng)體系被分隔成10 000～20 000個(gè)油包水微滴來(lái)充當(dāng)PCR 反應(yīng)室，每個(gè)反應(yīng)室都有目標(biāo)核酸的0 個(gè)或1 至多個(gè)拷貝。每個(gè)液滴都是一個(gè)特定的封閉區(qū)域，可防止反應(yīng)室之間的交叉污染。目前較成熟的劃分樣品方法，除微滴式外還有微孔式、微流體室[30]等。微滴生成后進(jìn)行常規(guī)PCR 擴(kuò)增，最終通過(guò)類似于流式細(xì)胞儀的微滴讀取儀單獨(dú)分析液滴是否含有熒光，并依據(jù)泊松分布原理確定目標(biāo)基因拷貝數(shù)。目前商品化的ddPCR 系統(tǒng)已被應(yīng)用于臨床，例如BioMark HD dPCR、OpenArray、QuantStudio 12K Flex dPCR、RainDropTM、Bio-Rad QX200TMDroplet Digital 以及NAICATM 等。ddPCR 技術(shù)在獸醫(yī)領(lǐng)域已有廣泛應(yīng)用[31-32]，但在魚類疫病病原體檢測(cè)中應(yīng)用較少。Zhao 等[33]基于ddPCR 技術(shù)建立了羅非魚細(xì)小病毒（TiPV）ddPCR 快速定量檢測(cè)方法。該方法最佳退火溫度為59.3 ℃，引物和探針的最佳濃度分別為900 和250 nmol/L，且具有高特異性和靈敏度。驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ddPCR 檢出限（0.07 copies/μL）和臨床樣品陽(yáng)性檢出率（32%）均優(yōu)于實(shí)時(shí)熒光PCR 方法（4.63 copies/μL，18%）。李敏等[34]選擇hypothetical protein 編碼基因設(shè)計(jì)引物探針，建立了TiLV RT-ddPCR 檢測(cè)方法，其檢測(cè)限可低至2 copies/μL，且與其他5 種常見(jiàn)的水生動(dòng)物病毒無(wú)交叉反應(yīng)。張險(xiǎn)朋等[35]首次應(yīng)用數(shù)字PCR 技術(shù)建立了針對(duì)羅非魚無(wú)乳鏈球菌的ddPCR 方法，其最低檢測(cè)限達(dá)2.56 copies/μL，與實(shí)時(shí)熒光PCR 方法相比具有更高的靈敏度，在梯度稀釋至低濃度時(shí)仍有良好線性關(guān)系，且可做到精準(zhǔn)定量，更適用于羅非魚無(wú)乳鏈球菌感染的早期檢測(cè)，以及魚苗、種魚、魚肉產(chǎn)品、魚塘環(huán)境中微量羅非魚無(wú)乳鏈球菌的檢測(cè)。但ddPCR 方法的應(yīng)用也受到了其固有缺點(diǎn)的影響：應(yīng)用泊松分布分析結(jié)果時(shí)，ddPCR 檢測(cè)模板濃度上限受到了液滴數(shù)量的限制，因此當(dāng)模板濃度高時(shí)需要適當(dāng)稀釋以獲得準(zhǔn)確數(shù)據(jù)；ddPCR 檢測(cè)方法所需設(shè)備和試劑價(jià)格昂貴，較少有檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室和研究機(jī)構(gòu)能夠負(fù)擔(dān)得起。在后續(xù)研究中可以嘗試將更多的羅非魚細(xì)菌病病原體納入反應(yīng)體系，實(shí)現(xiàn)一次PCR 程序檢測(cè)多種病原體，以降低檢測(cè)成本。

4 展望

本文通過(guò)綜合闡述，深入探討了羅非魚鏈球菌檢測(cè)方法的研究進(jìn)展，特別關(guān)注了分子生物學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域的技術(shù)創(chuàng)新。這些新方法的不斷涌現(xiàn)為羅非魚鏈球菌病的快速、準(zhǔn)確診斷提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。不過(guò)不同的檢測(cè)方法因其優(yōu)缺點(diǎn)不同，有著不同的應(yīng)用場(chǎng)景，因此了解其特點(diǎn)后根據(jù)具體需求選擇合適的檢測(cè)技術(shù)，將更有意義。這些方法的建立，對(duì)于羅非魚健康養(yǎng)殖，保障漁民利益，促進(jìn)地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著重要應(yīng)用價(jià)值。

盡管羅非魚鏈球菌檢測(cè)方法研究取得了顯著進(jìn)展，但仍然有一些挑戰(zhàn)需要克服。首先，需要進(jìn)一步提高方法的靈敏度、特異性以及多重檢測(cè)等性能，以便更早地檢測(cè)到感染，減少疫情傳播。其次，應(yīng)用這些方法需要得到更多的實(shí)驗(yàn)室以及技術(shù)支持，因此推廣和普及這些技術(shù)對(duì)于各種規(guī)模的養(yǎng)殖場(chǎng)至關(guān)重要。再次，對(duì)于海豚鏈球菌的檢測(cè)方法研究相對(duì)較少，因此還有很多工作需要做。最后，也需要繼續(xù)研究羅非魚鏈球菌的抗藥性和毒力機(jī)制，以更好地應(yīng)對(duì)由其導(dǎo)致的潛在流行病威脅?？傊?，羅非魚鏈球菌檢測(cè)方法仍然需要不斷地研究和創(chuàng)新，以確保羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的健康和持續(xù)發(fā)展。希望未來(lái)的研究能進(jìn)一步完善這些方法，為羅非魚鏈球菌病防控提供更多有效的技術(shù)支持。