崔國(guó)林，閆雪敏，孟晨晨，李佳佳，趙 洋，王雪芬，薛曉陽，周守長(zhǎng)

（1.華裕農(nóng)業(yè)科技有限公司，河北邯鄲 056000；2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056038）

Sm24/Rif12/Ssq 疫 苗（ 商 品 名AviPro?SalmonellaVac E）株是由腸炎沙門菌PT4 通過化學(xué)誘變方式獲得的一種代謝漂移突變株[1]，亦是國(guó)內(nèi)外普遍使用的腸炎沙門菌弱毒活疫苗株之一[2]。相較于腸炎沙門菌野毒株，Sm24/Rif12/Ssq 疫苗株生長(zhǎng)代次時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞膜通透性升高，對(duì)紅霉素敏感，但對(duì)利福平和鏈霉素耐藥[1]；它可在動(dòng)物體內(nèi)存活14～21 d，但不能在自然環(huán)境中存活[3]。Sm24/Rif12/Ssq 疫苗免疫可顯著降低雞蛋載菌量和載菌率[4]，減少泄殖腔排毒率[5-6]。研究[7-8]顯示，SPF 雞感染腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株CVCC3377 后，從感染后7 d 開始持續(xù)性排毒至21 d，并從感染后7 d開始出現(xiàn)可檢測(cè)的平板凝集抗體和ELISA 抗體。然而，Sm24/Rif12/Ssq 疫苗株中部分基因的缺失和突變導(dǎo)致其毒力弱化，同時(shí)也導(dǎo)致疫苗株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性發(fā)生變化[1]，其在蛋雞體內(nèi)的定殖規(guī)律不同于腸炎沙門菌野毒株。因此，本研究選取0日齡、6 周齡和16 周齡蛋雞，分別進(jìn)行Sm24/Rif12/Ssq疫苗首免、二免和三免，并于免疫后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)疫苗株核酸及抗體產(chǎn)生情況，以期明確疫苗株在蛋雞體內(nèi)定殖和抗體產(chǎn)生規(guī)律，從而為科學(xué)制定或優(yōu)化免疫程序提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

0日齡（出雛當(dāng)日，60 只）、6 周齡（40 只）和16 周齡（40 只）海蘭褐蛋雞，飼養(yǎng)于華裕農(nóng)業(yè)科技有限公司育雛場(chǎng)和產(chǎn)蛋場(chǎng)。

1.2 主要試劑

鏈霉素、利福平，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BPW 培養(yǎng)基和BGA 培養(yǎng)基，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；腸炎沙門菌疫苗Sm24/Rif12/Ssq（商品名AviPro?SalmonellaVac E），購(gòu)自禮藍(lán)（上海）動(dòng)物保健有限公司；AceQ qPCR Probe Master Mix，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；雞白痢、雞傷寒多價(jià)染色平板凝集試驗(yàn)抗原，購(gòu)自北京中海生物科技有限公司；D 群沙門菌ELISA 試劑盒，購(gòu)自BioChek 公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物免疫程序

1.3.1 首免 選擇60 只0日齡海蘭褐蛋雞，對(duì)其中50 只滴口免疫1 羽份Sm24/Rif12/Ssq 疫苗（1×108CFU/只），剩余10 只滴口免疫等體積滅菌生理鹽水（空白對(duì)照組）。

1.3.2 二免 選擇40 只已完成Sm24/Rif12/Ssq疫苗首免的6 周齡海蘭褐蛋雞，對(duì)其中30 只滴口免疫1 羽份Sm24/Rif12/Ssq 疫苗（1×108CFU/只），剩余10 只滴口免疫等體積滅菌生理鹽水（空白對(duì)照組）。

1.3.3 三免 選擇40 只已完成Sm24/Rif12/Ssq疫苗二免的16 周齡海蘭褐蛋雞，對(duì)其中30 只滴口免疫1 羽份Sm24/Rif12/Ssq 疫苗（1×108CFU/只），剩余10 只滴口免疫等體積滅菌生理鹽水（空白對(duì)照組）。

1.4 首免后檢測(cè)

分別于Sm24/Rif12/Ssq 疫苗首免后1、3、5 和7 d，隨機(jī)采集10 只試驗(yàn)組和2 只空白對(duì)照組雛雞的咽拭子、泄殖腔拭子和單根盲腸樣品，并置于含200 μg/mL 鏈霉素和100 μg/mL 利福平的BPW 培養(yǎng)液中，37 ℃靜置培養(yǎng)16～24 h。取1 mL BPW 菌懸液，12 000 r/min 離心5 min后，以50 μL 生理鹽水重懸沉淀并煮沸15 min，即為樣品核酸模板。采用qPCR 檢測(cè)上述樣品核酸模板。 反應(yīng)體系（20.0 μL）[9]：AceQ qPCR Probe Master Mix 10.0 μL，ROX 0.4 μL，invAF（5'-GCTGCTTTCTCTACTTAAC-3'）0.4 μL（10 μmol/L），invAR（5'-GTAATGGAATGACGAACAT-3'）0.4 μL（10 μmol/L），invAP（5'-FAM-CATCACCATTAGTACCAGAATCAGTMGB-3'）0.4 μL（10 μmol/L），核酸模板2.0 μL，無菌水6.4 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，40 個(gè)循環(huán)。

圖1 首免后Sm24/Rif12/Ssq 疫苗在蛋雞體內(nèi)載量變化情況（柱形圖上標(biāo)表示陽性率/%）

同時(shí)，在每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)采集上述雛雞肝臟樣品，稱重后置于1 mL 含2 顆鋼珠的生理鹽水中，50 Hz 勻漿1 min，取100 μL 勻漿液涂布于含有200 μg/mL 鏈霉素和100 μg/mL 利福平的BGA 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16～24 h 后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

于免疫后30 d，采集10 只雞血清，利用雞白痢、雞傷寒多價(jià)染色平板凝集試驗(yàn)抗原測(cè)定平板凝集抗體；同時(shí)，利用D 群沙門菌ELISA 試劑盒測(cè)定ELISA 抗體。ELISA 試劑盒結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：S/P≥0.5，腸炎沙門菌抗體陽性；S/P＜0.5，腸炎沙門菌抗體陰性。S/P＝ 0.5 時(shí)，抗體滴度為654.39。

1.5 二免和三免后檢測(cè)

于Sm24/Rif12/Ssq 疫苗二免或三免后4 d，采集30 只試驗(yàn)組和10 只空白對(duì)照組雞泄殖腔拭子置于含200 μg/mL 鏈霉素和100 μg/mL 利福平的BPW 培養(yǎng)液中，37 ℃靜置培養(yǎng)16～24 h 后，采用1.4 方法進(jìn)行qPCR 檢測(cè)。

于二免后30 d，三免后30、60、100 d，分別采集30 只試驗(yàn)組和10 只空白對(duì)照組雞血清，測(cè)定平板凝集抗體和ELISA 抗體。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism 9 軟件進(jìn)行圖表繪制，利用IBM SPSS Statistics 25 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。首免后臟器細(xì)菌載量采用one-way ANOVA 進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，二免和三免后泄殖腔疫苗株載量采用T-test 進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sm24/Rif12/Ssq 疫苗首免后定殖檢測(cè)

盲腸、肝是腸炎沙門菌在機(jī)體內(nèi)的主要定殖器官[3，10]，因此將二者作為本研究疫苗株定殖檢測(cè)的靶位。由于樣品雜菌較多，直接進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)誤差過大，故采用qPCR 方法測(cè)定細(xì)菌核酸，核酸量與細(xì)菌載量呈正比。結(jié)果顯示：咽拭子和盲腸樣品中疫苗株細(xì)菌載量呈先上升后下降趨勢(shì)，單個(gè)時(shí)間點(diǎn)咽拭子細(xì)菌載量變異系數(shù)為0.13～0.44，盲腸樣品細(xì)菌載量變異系數(shù)為0.19～0.34，細(xì)菌陽性率呈逐步下降趨勢(shì)，至免疫后7 d，細(xì)菌陽性率已降至60%～70%（圖1-A）；泄殖腔拭子細(xì)菌載量相對(duì)穩(wěn)定，單個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)菌載量波動(dòng)更小，變異系數(shù)為0.07～0.13，細(xì)菌陽性率均在90%以上（圖1-A）；肝臟樣品細(xì)菌載量逐步下降至103CFU/g，細(xì)菌陽性率逐步下降至50%（圖1-B）?？瞻讓?duì)照組均無細(xì)菌檢出。

2.2 Sm24/Rif12/Ssq 疫苗二免和三免后定殖檢測(cè)

Sm24/Rif12/Ssq 疫苗首免后保護(hù)時(shí)間有限[5]，往往需要進(jìn)行加強(qiáng)免疫。如圖2所示，二免或三免后，泄殖腔拭子陽性率為17%～20%，三免后細(xì)菌載量顯著低于二免（P＜0.05），且均顯著低于首免后3～5 d（圖1-A）。空白對(duì)照組均無細(xì)菌檢出。

圖2 Sm24/Rif12/Ssq 疫苗二免和三免后4 d泄殖腔拭子qPCR 檢測(cè)結(jié)果（柱形圖上標(biāo)表示陽性率/%）

2.3 Sm24/Rif12/Ssq 疫苗免疫后抗體檢測(cè)

對(duì)免疫后血清采用平板凝集試驗(yàn)初檢，發(fā)現(xiàn)均未出現(xiàn)明顯的凝集現(xiàn)象，即平板凝集抗體均為陰性。采用D 群沙門菌ELSIA 試劑盒檢測(cè)血清的結(jié)果（圖3）顯示，平均抗體滴度隨日齡上升而逐步升高，至三免后60 d 達(dá)到峰值，且同時(shí)間點(diǎn)平均抗體滴度超過抗體陽性閾值（圖3-A），單個(gè)樣品最高抗體滴度為4 562；首免后30 d 抗體陽性率為0，二免后30 d 抗體陽性率為10.7%，三免后30、60、100 d 的抗體陽性率分別為30.0%、57.0%、61.0%（圖3-B）?？瞻讓?duì)照組均無細(xì)菌抗體檢出。

圖3 Sm24/Rif12/Ssq 疫苗免疫后ELISA 抗體變化規(guī)律

3 討論

研究[3]顯示，Sm24/Rif12/Ssq 疫苗株可在1日齡免疫的SPF 雛雞泄殖腔排毒12 d。與之相似，另有研究[5]顯示，Sm24/Rif12/Ssq 疫苗株在1日齡免疫的羅曼褐雛雞泄殖腔排毒10 d，在7 或16周齡免疫的雞泄殖腔排毒5 d。但是，以上研究均基于泄殖腔拭子細(xì)菌培養(yǎng)方法，而沙門菌判定可能受泄殖腔雜菌干擾，且不能定量。本實(shí)驗(yàn)室分別采用BGA 瓊脂平板培養(yǎng)法和qPCR 法檢測(cè)免疫后8 d雛雞泄殖腔的疫苗株載量，結(jié)果顯示疫苗株陽性率分別為30%和80%（數(shù)據(jù)未發(fā)表），說明平板分離法檢測(cè)污染樣品的敏感性較低。因此本研究選用qPCR 方法判定非臟器樣本疫苗株載量。

Sm24/Rif12/Ssq 疫苗經(jīng)口免疫，途經(jīng)口腔、盲腸和泄殖腔，并在其中增殖和擴(kuò)散。與之對(duì)應(yīng)，首免后1～7 d，咽拭子、泄殖腔拭子和盲腸樣品中均有細(xì)菌檢出，說明疫苗株可在口腔、泄殖腔和盲腸存活7 d 以上；在每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，泄殖腔拭子細(xì)菌載量和穩(wěn)定性均高于咽拭子和盲腸樣品，細(xì)菌陽性率均在90%以上，加之泄殖腔拭子易于采集且對(duì)動(dòng)物刺激較小，因此泄殖腔適于作為疫苗定殖或排毒檢測(cè)的靶位。首次免疫后1 d，疫苗株即可進(jìn)入雛雞肝臟，隨后疫苗株載量持續(xù)下降，檢出陽性率僅為50%～90%，而腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株在雛雞體內(nèi)載量于攻毒后5 d 達(dá)到峰值，隨后下降，且檢出陽性率為100%[10]。這些差異可能是Sm24/Rif12/Ssq 疫苗株有別于野毒株的重要表現(xiàn)：①疫苗株在雛雞體內(nèi)增殖能力有限，可快速被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除，導(dǎo)致其在雛雞臟器載量持續(xù)性下降；②疫苗株經(jīng)口免疫，侵襲進(jìn)入肝的細(xì)菌數(shù)量有限，導(dǎo)致部分雛雞肝臟無可檢測(cè)數(shù)量的細(xì)菌。

與首免后疫苗排毒規(guī)律不同，二免和三免后疫苗排毒量（細(xì)菌載量）和排毒率均顯著低于首免。與之類似，雛雞在0日齡首免后3 d 的疫苗排毒量和排毒率均高于7日齡首免（數(shù)據(jù)未發(fā)表），這可能與以下原因相關(guān)：①0日齡首免時(shí)，雛雞消化道尚未形成多樣性菌群結(jié)構(gòu)，梭菌科或腸桿菌科細(xì)菌占主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)[11]，可能利于腸炎沙門菌疫苗株定殖和增殖，而高日齡免疫時(shí)，雞消化道已形成多樣性菌群結(jié)構(gòu)，乳桿菌和腸球菌成為優(yōu)勢(shì)菌群，拮抗疫苗株定殖。②經(jīng)過首免后，雛雞消化道形成了針對(duì)腸炎沙門菌的黏膜免疫，可以抑制疫苗株的二免和三免后定殖。

雞白痢平板凝集試驗(yàn)以全菌體作為診斷抗原，易受抗原試劑批次質(zhì)量、血清質(zhì)量和雞群其他細(xì)菌感染等因素干擾，特異性和敏感性欠佳，且其結(jié)果判定主要依靠肉眼，受主觀影響較大；但其成本低，適于大群普篩。ELISA 方法以純化的蛋白作為包被抗原，依靠酶標(biāo)儀判別結(jié)果，其特異性和敏感性良好，但成本較高，較適于重點(diǎn)樣品確診。本研究選擇以上兩種方法同時(shí)檢測(cè)免疫后血清，發(fā)現(xiàn)凝集抗體均呈陰性，推測(cè)原因一方面可能由于腸炎沙門菌抗體與雞白痢沙門菌診斷抗原并不完全配型，降低了平板凝集試驗(yàn)的敏感性；另一方面可能由于疫苗在體內(nèi)存在時(shí)間較短，未能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平抗體。但是加強(qiáng)免疫之后，血清中可檢測(cè)到低水平抗體，并隨免疫次數(shù)增加而升高，說明疫苗可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，抗體陽性率可作為疫苗免疫效果的評(píng)判指標(biāo)。