蘇華彬，劉蒙達，南文龍，孫明軍，焉 鑫，毛迎雪，4，曲 瑤，4，孫淑芳，李桂梅，樊曉旭

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部反芻動物重大疫病防控重點實驗室（東部），山東青島 266032；4.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東泰安 271000）

免疫層析技術(shù)是20世紀末發(fā)展起來的一種檢測方法，其結(jié)合了免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)，具有操作簡單、反應(yīng)快速等特點，已被用于臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等多個重要領(lǐng)域[1]。傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)以膠體金為標記物，通過條帶顯色對目標物進行定性檢測或半定量分析，其雖然簡單快速，但靈敏度較差，難以做到準確定量[1]。熒光免疫層析技術(shù)作為一項新型免疫學(xué)檢測技術(shù)，既保留了傳統(tǒng)膠體金試紙條的檢測速度快、價格便宜、操作簡單、攜帶方便等優(yōu)點，又通過熒光技術(shù)提高了檢測的靈敏度[2]。熒光免疫層析技術(shù)以熒光微球為標記物。熒光微球是一種亮度適中、吸光度高、穩(wěn)定性好的示蹤標記物[3]，可用于各種生物分析物的檢測[4]，檢測抗原時不受外界因素影響，光學(xué)穩(wěn)定性好[5]。微球與抗體或抗原的結(jié)合不影響后續(xù)的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)。在檢測過程中，熒光免疫層析技術(shù)受到的環(huán)境因素影響和樣品中的溶劑影響較小，檢測熒光微球信號連續(xù)且穩(wěn)定[5]。本文從熒光免疫層析技術(shù)的原理以及在病原微生物快速檢測中的應(yīng)用方面作綜述，以期為后續(xù)相關(guān)研究提供參考。

1 技術(shù)原理

1.1 熒光微球制備原理

根據(jù)制備方法不同，可將熒光微球分為三類：第一類是將熒光材料包封于微球內(nèi)，第二類是將熒光材料修飾在微球表面，第三類是在原位合成微球過程中嵌入熒光材料。

1.1.1 熒光材料包封于微球內(nèi) 納米顆粒被封裝在微球核中或其內(nèi)壁。該方法是基于溶脹原理，將熒光納米顆粒分散在有機溶脹溶劑中[6]。溶劑通過孔的滲透導(dǎo)致微球溶脹，使納米顆粒擴散進入溶脹的微球內(nèi)部；在通過極性溶劑進行溶劑交換時，微球收縮將納米顆粒包封在內(nèi)部[4]。該方法制造熒光微球的過程較為簡單，成本較低，但無法在滲透過程中人為控制納米顆粒，可能導(dǎo)致因丟失顆粒而引起熒光強度降低[4]。另外，納米顆粒封裝后存在泄漏的可能，會造成檢測失準[4]。

1.1.2 熒光材料修飾于微球表面 納米顆粒在微球表面逐層修飾，其中單層或多層帶電熒光納米顆粒與帶相反電荷的聚電解質(zhì)交替沉積。用聚電解質(zhì)交替沉積形成的聚合物層修飾熒光微球，使熒光微球表面具備捕獲探針的能力[7]。該方法靈敏度高、穩(wěn)定性強，但制造工藝復(fù)雜[7]。在制造過程中，每一個納米粒子和聚電解質(zhì)沉積步驟的洗滌過程費時費力，并且修飾后的納米粒子由于水溶性差而熒光強度降低[7]。用該方法制作的微球性能較佳，對試驗有較高要求時可選該方法。

1.1.3 原位合成微球過程中嵌入熒光材料 原位合成微球嵌入熒光材料的過程中，根據(jù)對納米粒子的修飾與否，可分為兩種方法：聚合法和乳化-溶劑蒸發(fā)法。在聚合方法中，用可聚合的配體對納米粒子進行表面修飾，并與微球前體混合形成乳液液滴[8]。該液滴通過自由基或光聚合方式進行聚合，聚合后從溶液中沉淀出難溶的納米顆粒微球，然后收集并使用[8]。與聚合方法相比，乳化-溶劑蒸發(fā)法不需要對納米粒子進行化學(xué)修飾，聚合物前體可直接與納米粒子在含有表面活性劑的溶液中混合[9]。在攪拌或超聲波分散混合物時，混勻后的溶液形成乳狀液滴[9]。當溶劑蒸發(fā)時，凝固的微球產(chǎn)生，此時微球內(nèi)已嵌入納米顆粒[9]。量子點嵌入的亞微米級熒光珠浸泡于水溶劑中時，可保留熒光長達數(shù)月[9]。以上兩種方法通過改變前體濃度和混合速度，可以調(diào)節(jié)常規(guī)聚合和乳化方法制備的熒光微球粒徑[9]。然而，用該方法得到的微球多呈分散形式，影響后續(xù)生物標志的測定效率和可靠性[9]。需要制作不同粒徑大小微球時可以選該方法。

1.2 免疫層析技術(shù)檢測原理

將特異性抗原或抗體及二抗與制備好的熒光微球混合后，將混合液分別固定在硝酸纖維素膜（NC 膜）上，在NC 膜上制成質(zhì)控線（C 線）和檢測線（T 線）[10]。步驟1，加樣孔中滴加樣品：將樣品溶液滴加到加樣孔中，通過毛細管虹吸作用，使樣品溶液從加樣孔流向另一端[10]。步驟2，抗原與標記抗體形成免疫復(fù)合物：在檢測過程中，樣品首先與免疫標記物相互作用，之后反應(yīng)溶液流向NC 膜；陽性樣品會與NC 膜上T 線包被的抗原或者抗體特異性結(jié)合，形成特異性結(jié)合物，而后結(jié)合物會被T 線固定；陰性樣品則不會發(fā)生特異性結(jié)合[10]。步驟3，復(fù)合物經(jīng)NC 膜與捕獲抗體發(fā)生反應(yīng)：無論樣品為陽性還是陰性，反應(yīng)溶液會因毛細管作用流經(jīng)C 線而與C 線包被的二抗發(fā)生特異性結(jié)合；在紫外光照射下，若C 線和T 線均出現(xiàn)條帶，則檢測結(jié)果為陽性；如果只有C 線出現(xiàn)條帶，則檢測結(jié)果為陰性；如果只有T 線有條帶，則檢測結(jié)果無效[11]。熒光免疫層析檢測原理見圖1。同時也可將試紙條放入相應(yīng)儀器進行定量分析[12]。

圖1 熒光免疫層析檢測原理[11]

2 檢測應(yīng)用

以PubMed（NLM） 數(shù)據(jù)庫為例， 以“Fluorescence immunochromatography diagnosis”進行檢索，規(guī)定時間為2018—2023年，檢索到應(yīng)用熒光免疫層析技術(shù)檢測病原微生物相關(guān)文獻共43 篇，研究病原涉及病毒、細菌、寄生蟲等，其中病毒26 篇、細菌12 篇、寄生蟲5 篇。本文從中挑選最具代表性的研究文獻進行簡述，以說明熒光微球檢測技術(shù)在病原檢測領(lǐng)域的巨大潛力。

2.1 病毒檢測

Cameron 等[13]建立了一種基于熒光微球的新型冠狀病毒檢測方法，其檢測3 個主要抗原——刺突蛋白、刺突ACE2 受體結(jié)合域蛋白和核衣殼蛋白。根據(jù)核衣殼蛋白比刺突蛋白更保守的特性，Li等[14]以新型冠狀病毒核衣殼蛋白為抗原建立了熒光免疫層析檢測方法，其C 線包被的核衣殼蛋白能與特異性抗體結(jié)合，之后被T 線包被的葡萄球菌蛋白A 捕獲并顯示熒光；通過對偶聯(lián)和檢測條件進行優(yōu)化，確定檢測限為97.65 ng/mL，IgG 質(zhì)量濃度為48.84 ng/mL，同時對其他種類冠狀病毒和呼吸道相關(guān)病毒（n= 5）顯示了良好的特異性。Mao 等[8]以熒光微球為載體，研制了新型冠狀病毒核衣殼蛋白檢測試紙條，其靈敏度非常高，檢測限可達0.01 ng/mL，在大規(guī)模人群篩查中具有較大的應(yīng)用前景[8]。Zhang 等[15]基于逆轉(zhuǎn)錄和等溫擴增方法檢測新型冠狀病毒刺突蛋白編碼基因片段，將特異性探針結(jié)合CRISPR/Cas13a 反應(yīng)，使用熒光微球免疫層析條讀取擴增結(jié)果，可在1 h 內(nèi)完成檢測。Wang 等[16]建立了一種應(yīng)用快速熒光微球免疫層析試紙條定量檢測禽白血病病毒的方法，其將禽白血病病毒核衣殼蛋白特異性單克隆抗體偶聯(lián)標記熒光微球，制備用于樣本檢測的T 線，顯示最低檢出限為1 ng/mL。Ji 等[17]將兩種偽狂犬病病毒重組蛋白（GE 和GB）偶聯(lián)到磁性微球上，建立了兩種單熒光微球免疫分析方法。與ELISA 相比，GE 蛋白熒光微球免疫層析試紙條的特異性和敏感性符合率分別為99.26%和92.3%，GB 蛋白熒光微球免疫層析試紙條的分別為95.74%和96.3%，2 種方法結(jié)合可快速、靈敏、特異性檢測偽狂犬病病毒。

2.2 細菌檢測

Chen 等[18]通過引入磁珠純化、生物素-鏈霉親和素體系和熒光微球技術(shù)，建立了一種快速、敏感性強、特異性好的福氏志賀菌熒光微球檢測方法，其最低檢出限為2 ng/mL，與熒光定量PCR 的檢出限大致相同。Kong 等[19]建立了一種基于熒光微球的，快速、準確、簡便、靈敏的動物布魯氏菌感染抗體檢測方法，其將熒光微球與布魯氏菌Omp22外膜蛋白共價偶聯(lián)，將外膜蛋白Omp28 和Omp22的單克隆抗體分別噴涂到NC膜上作為T線和C線，通過檢測線與對照線的熒光信號比值確定陰陽性臨界閾值為0.049 2，檢出限達1.05 ng/mL。Liu 等[23]研制了一種基于熒光微球的簡單、快速的手持側(cè)向流免疫層析檢測系統(tǒng)，其靈敏度為0.03 ng/mL，可用于降鈣素原檢測，為非典型細菌性腦膜炎的腦脊液檢查與病毒性腦炎的鑒別提供了指示參考。

2.3 寄生蟲檢測

Tachibana 等[25]證明溶組織內(nèi)半乳糖胺抑制凝集素是阿米巴病血清診斷的有效抗原，使用熒光微球包被半乳糖胺抑制凝集素于標記物墊，用半乳糖胺抑制凝集素包被T 線，形成自夾心熒光微球試紙條，使用手持式讀取器測量熒光強度，其半乳糖胺抑制凝集素特異性抗體的最小量為100 pg，血清樣本工作量為20 μL，反應(yīng)總耗時為30 min。Xu等[26]為對家畜旋毛蟲進行特異性、定量和現(xiàn)場篩查，采用競爭夾心方式建立了基于熒光微球的免疫層析分析方法，其具有良好的線性范圍，檢測限為189.92 ng/mL，檢出率為100%，高于市售ELISA試劑盒（90%），在不同感染劑量模型中檢測的血清學(xué)陽性率（100%）均一致。

3 前景展望

熒光免疫層析方法操作簡單、耗時短，無需昂貴的設(shè)備及相關(guān)的專業(yè)培訓(xùn)，在檢測靈敏度和特異性上與ELISA 和PCR 大致相同，且不用擔(dān)心氣溶膠污染問題。該方法配合熒光讀數(shù)儀在條件有限的實驗室和野外可以進行定性與半定量分析。但是熒光免疫層析基于免疫分析的原理，依賴于特異性抗體的高效結(jié)合來識別或捕獲相應(yīng)的分析物，而在復(fù)雜的實際樣品中，某些血清蛋白會引起與抗體蛋白的交叉反應(yīng)，導(dǎo)致其靈敏度和特異性降低。因此，有必要開發(fā)分子印跡聚合物、分子配體或適配體等來替代傳統(tǒng)的捕獲探針。近些年，熒光微球讀數(shù)儀更加輕巧且攜帶方便，可以對熒光微球免疫層析試紙條進行定性與半定量分析，希望隨著技術(shù)發(fā)展可以解決無法準確定量的問題，使其在條件有限的實驗室和野外也可以進行準確分析。

熒光免疫層析技術(shù)除了可用于疾病早期的病原檢測，還可用于癌癥篩查以及藥物殘留、有害物質(zhì)殘留等檢測，目前已有成熟的商品試劑盒，如豬瘟抗體定量檢測試劑盒、三聚氰胺定量檢測試劑盒、呋喃妥因代謝物定量檢測試劑盒等。相信未來隨著新興交叉融合技術(shù)的發(fā)展，熒光免疫層析技術(shù)將在更多領(lǐng)域發(fā)揮更大作用。