凡婷婷，張佳琦，劉會(huì)君，王鳳敏，馬宇航，吳宇偉，胡恒康，黃有軍，李 巖，王克濤，黃堅(jiān)欽，張啟香

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省森林芳香植物康養(yǎng)功能研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

核桃Juglansregia為胡桃科Juglandaceae 胡桃屬Juglans植物[1]，其種仁含油量高，有“木本油料之王”的稱號(hào)[2]。同時(shí)，核桃木材堅(jiān)實(shí)，是良好的硬木材料。作為重要的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種，核桃大多種植于土壤貧瘠的山坡溝坎，不與糧爭(zhēng)地[3]。然而，核桃樹(shù)體高大，與其他果樹(shù)相比對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素需求量較高，大量元素與核桃產(chǎn)量和品質(zhì)形成緊密相關(guān)[4]，因此，提高核桃樹(shù)體對(duì)礦質(zhì)元素的吸收能力對(duì)于提高核桃產(chǎn)量和品質(zhì)至關(guān)重要[5]。研究表明：在核桃樹(shù)各器官中種仁的氮素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，核桃樹(shù)吸收累積的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素中氮素被商品核桃(種仁、硬殼)攜走的比例也最高，葉片次之[6]。可見(jiàn)，氮素可能是提高核桃產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)元素。然而，過(guò)量施用氮肥會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題，因此，提高氮素利用效率是提高核桃產(chǎn)量與品質(zhì)的重中之重[7]。

土壤中氮素主要分為無(wú)機(jī)氮和有機(jī)氮兩大類，植物根系能夠吸收利用的主要是無(wú)機(jī)氮，主要以硝態(tài)氮和銨態(tài)氮形式存在[8-9]。植物根系對(duì)無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)途徑可分為2 種，即高親和力(HATs)和低親和力(LATs)的氮轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[10]，HATs 在外部銨態(tài)氮、硝態(tài)氮濃度低于 0.5 mmol·L-1時(shí)介導(dǎo)吸收大部分的無(wú)機(jī)氮，而 LATs 則是在、濃度高于 0.5 或 1.0 mmol·L-1時(shí)介導(dǎo)吸收無(wú)機(jī)氮[10]。植物對(duì)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的吸收主要由銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)。土壤中同時(shí)含有植物可吸收利用的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮時(shí)，由于植物吸收硝態(tài)氮需要先將其還原成銨態(tài)氮后才能進(jìn)行同化利用，消耗的能量更多，所以植物對(duì)銨態(tài)氮表現(xiàn)出明顯的偏好性，而且當(dāng)植物受鹽脅迫及活性氧的傷害時(shí)，銨態(tài)氮具有緩解作用，因此，介導(dǎo)植物對(duì)銨態(tài)氮吸收的銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物氮同化中起著重要作用[11]。銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因主要有兩大類族，分為AMT1 和AMT2。在已知的銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中大部分 AMT1 家族的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于高親和轉(zhuǎn)運(yùn)體[12]，如擬南芥Arabidopsisthaliana中有6 個(gè)編碼銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被鑒定，包括5 個(gè)AMT1 家族基因，1 個(gè)AMT2 家族基因。AMT1 家族基因中，AtAMT1.1 和AtAMT1.3 對(duì)擬南芥根系銨態(tài)氮吸收的貢獻(xiàn)率最高，為30%，AtAMT1.2、AtAMT1.5 對(duì)擬南芥根系高親和銨態(tài)氮吸收的貢獻(xiàn)率略低于AtAMT1.1 和AtAMT1.3[13]，AtAMT1.4 在花粉中特異性表達(dá)[14]，在水稻Oryzasativa銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族中AMT1 家族有基因3 個(gè)，其中OsAMT1.1 和OsAMT1.2 為高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體[15]；而 AMT2 家族以低親和為主，在擬南芥AMT2 家族基因中AtAMT2.1 在低親和范圍內(nèi)適度促進(jìn)擬南芥根系對(duì)銨態(tài)氮吸收，主要在銨從根部到地上部運(yùn)輸中發(fā)揮作用[16]。AMT2 型蛋白通常在植物的不同組織中包括根、芽和葉中都有表達(dá)，如AtAMT2.1 基因在擬南芥各器官中均有表達(dá)，主要表達(dá)在擬南芥的維管束及上皮層[17]，在擬南芥中AtAMT2.1 與AtAMT1s 之間還存在協(xié)同作用。此外，毛果楊PopulustrichocarpaPtAMT2.1 主要在葉片中，PtAMT2.2 在葉柄中高表達(dá)。除此之外，玉米Zeamays[18]、番茄Lycopersiconesculentum[19]、歐洲油菜Brassicanapus[20]等高等作物均鑒別出了AMT 基因，但到目前為止，研究大多集中于高親和的銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AMT1 基因家族，對(duì)低親和的銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AMT2 基因家族的研究較少。因此，闡明AMT2 的生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制，對(duì)于提高核桃自身的氮效率和提高肥料利用效率都具有重要意義。

本研究以核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系為供試材料，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)及生理檢測(cè)的方法鑒定JrAMT2 基因在核桃植株體內(nèi)的表達(dá)模式，進(jìn)一步對(duì)核桃JrAMT2 基因進(jìn)行生物學(xué)功能分析，為核桃優(yōu)良品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自浙江農(nóng)林大學(xué)省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的核桃野生型(WT)以及課題組2019 年獲得的核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)陽(yáng)性植株[21]，其中JrAMT2 基因構(gòu)建于PCMBIA1300 植物表達(dá)載體，載體抗性為卡那霉素(kanmycin，Kan)，利用根癌農(nóng)桿菌AgrobacteriumtumefaciensGV3103 菌株介導(dǎo)將構(gòu)建好的35S::JrAMT2::GFP 過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到核桃野生型體細(xì)胞胚中，植物篩選標(biāo)記為潮霉素(hygromycin，Hyg)。本研究所用核桃組培苗為野生型體胚和JrAMT2 過(guò)表達(dá)陽(yáng)性體胚經(jīng)脫水萌發(fā)獲得，溫室苗則由上述組培苗經(jīng)生根、煉苗、馴化獲得。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息分析運(yùn)用 SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)網(wǎng)站在線分析JrAMT2 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，運(yùn)用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線軟件對(duì)JrAMT2 蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)，通過(guò) GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)軟件在線分析JrAMT2 基因結(jié)構(gòu)。

1.2.2 植株的培養(yǎng) 同一JrAMT2 過(guò)表達(dá)陽(yáng)性體胚萌出的植株為1 個(gè)株系，選取3 個(gè)核桃JrAMT2 陽(yáng)性株系，命名為JrAMT2-1、JrAMT2-2、JrAMT2-3，每個(gè)株系繼代培養(yǎng)至50 株以上，培養(yǎng)條件：溫度為25 ℃，濕度為 75%～80%，光照強(qiáng)度為2～15 klx，光照周期為16 h 光照8 h 黑暗，培養(yǎng)基為Driver&Kunivuki&McGranahan (DKW)培養(yǎng)基。

采用2 步生根法獲得核桃馴化植株，選取陽(yáng)性體胚萌發(fā)后經(jīng)4 次繼代培養(yǎng)的核桃組培苗作為實(shí)驗(yàn)材料。第1 步進(jìn)行根誘導(dǎo)，5～8 cm 長(zhǎng)的光生芽，轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有10 mg·L-1吲哚丁酸鉀(K-IBA)的DKW 固體培養(yǎng)基，在黑暗中培養(yǎng)7 d，誘導(dǎo)根原基的發(fā)生；第2 步，不定根誘導(dǎo)結(jié)束后將其轉(zhuǎn)移到粗蛭石∶DKW 培養(yǎng)基比例(體積比)為3∶2 的固體培養(yǎng)基中，溫度為25 ℃，濕度為75%～80%，光照強(qiáng)度為2～15 klx，光照周期為16 h 光照8 h 黑暗，培養(yǎng)時(shí)間為21～28 d，形成不定根，獲得核桃不同株系生根植株[22]。

核桃苗不定根形成后取出用清水沖洗，多菌靈浸泡，移栽到泥炭∶蛭石∶珍珠巖比例(體積比)為2∶1∶1 的混合土中，將移栽馴化成活后獲得的核桃再生植株在溫度為 25 ℃，濕度為 75%～80%，光照強(qiáng)度為2～15 klx，光照周期為16 h 光照8 h 黑暗的條件下培養(yǎng)[23]，獲得核桃不同株系溫室植株。

1.2.3 核桃JrAMT2 基因陽(yáng)性鑒定 選用陽(yáng)性體胚萌發(fā)后經(jīng)4 次繼代培養(yǎng)的核桃組培苗進(jìn)行綠色熒光蛋白(GFP) 檢測(cè)、PCR 及RT-qPCR 驗(yàn)證，引物見(jiàn)表1。從再生植株頂芽開(kāi)始向下截取 1.5 cm，培養(yǎng)14 d后觀察植株表型，每個(gè)株系均5 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。選取植株頂芽、葉片、莖段混樣提取DNA 及RNA。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火溫度 30 s，68 ℃延伸 2 min，共 32 個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸 7 min，PCR 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%瓊脂糖凝膠電泳。使用 The iQ5 Real-Time PCR Detection System 儀器進(jìn)行RT-qPCR，測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株中JrAMT2 的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s；60 ℃ 15 s。通過(guò) 2-ΔΔCt方法計(jì)算定量結(jié)果[24]。

表1 引物Table 1 Primers

取核桃野生型及核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系組培苗的根、莖、小葉，根縱切、莖橫切臨時(shí)切片分別放置于體視熒光顯微鏡(Carl Zeiss Stereo D13covery V12，Axio Cam MRc system)在明場(chǎng)和藍(lán)光(488 nm)激發(fā)條件下利用 ZEN lite 成像軟件連續(xù)拍照[25-26]。

1.2.4 生長(zhǎng)參數(shù)、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮測(cè)定 分別選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的核桃野生型與3 個(gè)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系組培苗，從頂尖向下剪取1.5 cm 莖段，含2～4 片復(fù)葉，培養(yǎng)14 d，每個(gè)株系均5 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，測(cè)量株高及節(jié)間數(shù)。選取長(zhǎng)勢(shì)相同的核桃野生型及JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株采用2 步生根法馴化，移栽后用直尺測(cè)量統(tǒng)計(jì)不同株系生長(zhǎng)0、20、40 d 的株高、節(jié)間長(zhǎng)、葉片長(zhǎng)度及葉片寬度。

分別選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的核桃野生型與3 個(gè)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系組培苗，培養(yǎng)14 d，采用2 步生根法獲得核桃生根植株，植株分為地上部分及地下部分2 個(gè)部分，清洗植株，分別測(cè)定地上部分及地下部分鮮質(zhì)量，于105 ℃下殺青，80 ℃烘干至恒量，稱取干質(zhì)量。使用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的植物銨態(tài)氮(ZATD-1-G)和植物硝態(tài)氮(ZXTD-1-G)試劑盒測(cè)定地上部分及地下部分銨態(tài)氮和硝態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每個(gè)株系均5 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 植株葉綠體觀察、葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定 分別選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的核桃野生型與3 個(gè)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系組培苗，取頂尖向下第2 節(jié)間處復(fù)葉。將該葉片置于0.35 mol·L-1氯化鈉中研磨破碎至絮狀，取懸液于高倍光學(xué)顯微鏡下觀察，找到視野中單個(gè)完整的葉肉細(xì)胞，觀察細(xì)胞中的葉綠體, 使用image J 軟件計(jì)算葉綠體表面積與單層細(xì)胞表面積比率。每個(gè)株系均5 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

采用丙酮浸取法測(cè)定葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。分別取0.1 g 核桃野生型與3 個(gè)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系組培苗長(zhǎng)勢(shì)一致的葉片，剪碎，置于15 mL 離心管中，加入10 mL 體積分?jǐn)?shù) 80%丙酮溶液，于室溫黑暗處浸提，直至管內(nèi)材料褪色變白，以80%丙酮溶液為對(duì)照，測(cè)定663 和646 nm 處吸光值，每個(gè)株系均5 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。wt=[(wa+8wb)×Vt×(mFW×1 000)-1]，葉綠素 a 質(zhì)量分?jǐn)?shù)(wa) =20.3×D(646)，葉綠素 b 質(zhì)量分?jǐn)?shù)(Cb)=8.04×D(663)。其中：wt為葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg·g-1)，Vt為提取液總體積(mL)，mFW為葉片鮮質(zhì)量(g)，D(646)和D(663)分別為646 和663 nm 處的吸光度。

葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定使用M-PEA(multi-function plant efficiency analyser)多功能植物效率分析儀(英國(guó)Hansatech 公司)測(cè)定。選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的核桃野生型與3 個(gè)核桃JrAMT2過(guò)表達(dá)株系溫室苗由上向下第3 片葉片暗處理30 min，在飽和脈沖光(5 000 μmol·m-2·s-1) 下進(jìn)行快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線(OJIP 曲線) 的測(cè)定和繪制。參照SCHANSKE 等[27]的方法分析葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)參數(shù)(JIP-test)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 26 軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比較(鄧肯法)，顯著性水平為0.05。使用GraphPad Prism 7.0 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃JrAMT2 基因生物信息學(xué)分析

核桃JrAMT2 基因的全長(zhǎng)為 1 464 bp，起始密碼子為 ATG，終止密碼子為 TGA。經(jīng)過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)在線序列比對(duì)顯示：該基因的序列編碼的氨基酸序列屬于 Ammonium Transporter Family，編碼487 個(gè)氨基酸(圖1)，蛋白分子量為52.458 kD，預(yù)測(cè)分子式為C2433H3715N601O646S23，含有7 418 個(gè)原子，理論等電點(diǎn)為7.11，不穩(wěn)定指數(shù)為35.61，脂溶指數(shù)為101.56，親水性平均值為0.472。該段蛋白質(zhì)中包含20 種常見(jiàn)氨基酸：亮氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)到11.7%，其次分別為甘氨酸11.1%，丙氨酸10.9%，纈氨酸8.6%，半胱氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，僅為1.0%。JrAMT2 蛋白中分別含有29 個(gè)酸性氨基酸殘基(Asp+Glu)和29 個(gè)堿性氨基酸殘基(Arg+Lys) (表2)。

圖1 JrAMT2 基因氨基酸序列Figure 1 Amino acid sequence of JrAMT2 gene

表2 JrAMT2 基因氨基酸組成Table 2 Composition of JrAMT2 amino acids

對(duì)核桃JrAMT2 蛋白跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)結(jié)果表明：該蛋白N 端在膜外，C 端存在膜內(nèi)，共含有11 個(gè)跨膜螺旋，跨膜螺旋區(qū)段分別位于24～46、59～81、129～151、158～180、195～214、227～244、254～276、288～310、314～333、346～368 和398～420，推測(cè)JrAMT2 屬于跨膜蛋白，并在N 端存在信號(hào)肽(圖2A)。

圖2 核桃JrAMT2 基因生物信息學(xué)分析Figure 2 Bioinformatics analysis of JrAMT2 gene in J.regia

對(duì)JrAMT2 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：JrAMT2 的氨基酸組成中有4 種構(gòu)象，其中 α- 螺旋有201 個(gè)氨基酸，占比 43.12%；延伸鏈有 93 個(gè)氨基酸，占比19.10%；β- 轉(zhuǎn)角有 30 個(gè)氨基酸，占比6.16%；無(wú)規(guī)則卷曲有154 個(gè)氨基酸，占比 31.62%。JrAMT2 銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要由 α- 螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成(圖2B)。

對(duì)JrAMT2 基因結(jié)構(gòu)的分析顯示：JrAMT2 基因由4 個(gè)外顯子，3 個(gè)內(nèi)含子組成。與擬南芥AtAMT2 基因相比，擬南芥基因結(jié)構(gòu)多了1 個(gè)外顯子和1 個(gè)內(nèi)含子，與山核桃Caryacathayensis CcAMT2 基因[28]、栓皮櫟QuercussuberQsAMT2 基因[29]相比，外顯子和內(nèi)含子數(shù)量相同，同源性較高(圖2C)。

2.2 核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株陽(yáng)性驗(yàn)證

在成功構(gòu)建35S::JrAMT2::GFP 的過(guò)表達(dá)載體并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化核桃體胚后，對(duì)同一無(wú)性系JrAMT2 體胚經(jīng)脫水萌發(fā)獲得的再生植株進(jìn)行陽(yáng)性鑒定。利用PCR 技術(shù)，以核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株3 個(gè)株系(JrAMT2-1、JrAMT2-2 和JrAMT2-3) DNA 為模板，進(jìn)行外源GFP 基因(729 bp)的PCR 驗(yàn)證，檢測(cè)到大小約為 750 bp 的電泳條帶，與GFP 基因大小符合(圖3A)；進(jìn)行目的基因JrAMT2 加外源GFP 基因全長(zhǎng)(2 193 bp)的PCR 驗(yàn)證，檢測(cè)到大小為2 000 bp 的電泳條帶，與目的基因大小符合(圖3B)；以核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株3 個(gè)株系的cDNA 為模板，利用實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)對(duì)JrAMT2 基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株3 個(gè)株系JrAMT2 基因相對(duì)表達(dá)量分別為野生型的10.58、12.80 和14.94 倍，顯著上調(diào)(圖3C)，表明核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株中JrAMT2 基因穩(wěn)定表達(dá)。

圖3 PCR 和RT-qPCR 對(duì)核桃組培苗的JrAMT2 基因的檢測(cè)Figure 3 Detection of JrAMT2 gene in J.regia tissue culture seedlings by PCR and qRT-PCR

對(duì)獲得的過(guò)表達(dá)株系進(jìn)行GFP 熒光陽(yáng)性鑒定，分別將核桃過(guò)表達(dá)及野生型幼苗(圖4A)的小葉、莖、根置于熒光體視顯微鏡下在波長(zhǎng)為488 nm 藍(lán)光激發(fā)下拍攝。結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)植株的小葉、莖、根表面呈現(xiàn)均勻的綠色熒光，其中腋芽處熒光更明亮(圖4B1～6)，野生型核桃幼苗的小葉、莖、根在熒光下拍攝無(wú)綠色熒光激發(fā)(圖4B7～12)，說(shuō)明JrAMT2 蛋白在腋芽處積累。為進(jìn)一步研究JrAMT2 基因在核桃幼苗中的表達(dá)，對(duì)過(guò)表達(dá)株系及野生型組培苗的莖段進(jìn)行橫切，根進(jìn)行縱切后，進(jìn)行GFP 熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示：核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株莖段橫切中呈現(xiàn)均勻的綠色熒光，其中在維管組織中熒光更明亮，野生型植株莖段橫切面無(wú)綠色熒面光(圖4B1～12)；核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株根段縱切面中呈現(xiàn)均勻的綠色熒光，且在維管組織中熒光更明亮，野生型植株根段縱切面無(wú)綠色熒光(圖4C1～8)。表明JrAMT2 基因在核桃幼苗的根和莖中均可穩(wěn)定表達(dá)，其中JrAMT2 蛋白在根和莖的維管束組織中積累。

圖4 銨態(tài)氮轉(zhuǎn)蛋白基因JrAMT2 在核桃苗中穩(wěn)定表達(dá)Figure 4 Stable expression of ammonium nitrogen transfer protein gene JrAMT2 in J.regia

2.3 核桃JrAMT2 基因的生物學(xué)功能分析

2.3.1 核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株生長(zhǎng)表型分析 為了進(jìn)一步研究核桃JrAMT2 基因的生物學(xué)功能，將3 個(gè)JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株與野生型核桃植株培養(yǎng)14 d。結(jié)果表明：與野生型相比，核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株均生長(zhǎng)旺盛，株高顯著增加，節(jié)間顯著增長(zhǎng)(P＜0.05，圖5A)。3 個(gè)JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系株高分別為3.87、4.23 和4.12 cm，節(jié)間長(zhǎng)分別為0.33、0.35 和0.34 cm，野生型植株株高為3.30 cm，節(jié)間長(zhǎng)為0.28 cm，與野生型相比，3 個(gè)JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系株高分別增加了17.0%、28.0%和29.0% (圖5B)，節(jié)間長(zhǎng)分別增加了19.0%、25.0%和24.0% (圖5C)。綜上所述，JrAMT2 過(guò)表達(dá)對(duì)核桃幼苗的生長(zhǎng)有顯著提高作用。

圖5 核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)離體培養(yǎng)植株表型分析Figure 5 Phenotypic analysis of J.regia JrAMT2 overexpression plant in vitro culture

對(duì)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株進(jìn)一步馴化培養(yǎng)，成功獲得核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)溫室苗。對(duì)其生長(zhǎng)表型進(jìn)行分析(圖6A)，定植后培養(yǎng)40 d，核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)溫室苗的株高、節(jié)間長(zhǎng)、葉片長(zhǎng)度、葉片寬度增加顯著高于野生型(P＜0.05)。培養(yǎng)至第20 天時(shí)，與野生型相比，核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)溫室苗3 個(gè)株系株高分別增加21.9%、26.0%和24.6% (圖6B)，節(jié)間長(zhǎng)分別增加41.2%、27.7%和26.3% (圖6C)，葉片長(zhǎng)度分別增加18.7%、16%和30.7% (圖6D)，葉片寬度分別增加41.3%、48.2%和55.1% (圖6E)；培養(yǎng)至第40 天時(shí)，與野生型相比，JrAMT2 過(guò)表達(dá)溫室苗3 個(gè)株系株高分別增加53.6%、68.2%和62.1%，節(jié)間長(zhǎng)分別增加37.2%、50.3%和44.8%，葉片長(zhǎng)度分別增加了27.8%、34.1%和49.3%，葉片寬度分別增加24.3%、19.5%和29.2%。綜上所述，核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)溫室苗與野生型相比，株高、節(jié)間長(zhǎng)、葉片大小均顯著增加，進(jìn)一步證明JrAMT2 基因過(guò)表達(dá)加快了核桃的生長(zhǎng)速度。

圖6 核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)陽(yáng)性溫室苗性狀分析Figure 6 Character analysis of J.regia JrAMT2 overexpression positive greenhouse seedlings

2.3.2 核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株對(duì)氮素吸收分析 為探究JrAMT2 基因在核桃中是否存在差異表達(dá)，將核桃野生型及核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株進(jìn)行2 步生根，獲得核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)生根植株，將其分為地上部分與地下部分。與野生型相比，核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)生根植株地下部分不定根生長(zhǎng)旺盛(圖7A)。對(duì)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株地上部分及地下部分差異分析，分別提取3 個(gè)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系生根植株地上部分及地下部分RNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)，分析地上部分及地下部分JrAMT2 基因表達(dá)的差異。結(jié)果表明：3 個(gè)JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系地上部分JrAMT2 基因表達(dá)量分別是野生型的11.94、12.70 和15.06 倍，地下部分JrAMT2 基因表達(dá)量分別是野生型的19.07、23.34 和24.00 倍(圖7B)。對(duì)核桃野生型及3 個(gè)JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系地上部分及地下部分進(jìn)行干質(zhì)量和鮮質(zhì)量測(cè)定。結(jié)果表明：3 個(gè)JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系地上部分鮮質(zhì)量和干質(zhì)量顯著高于野生型(P＜0.05)，與野生型相比，鮮質(zhì)量分別增加23.45%、33.67%和56.26%，干質(zhì)量分別增加23.45%、43.89%和56.26%；3 個(gè)JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系地下部分干質(zhì)量和鮮質(zhì)量顯著高于野生型(P＜0.05)，與野生型相比，鮮質(zhì)量分別增加222.65%、199.24%和344.38%，干質(zhì)量分別增加222.65%、199.24%和354.33%(圖7C)。

圖7 核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株氮素吸收分析Figure 7 Character analysis of the regenerated plants with expression of JrAMT2 in J.regia

基于核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株表型變化，本研究進(jìn)一步測(cè)定核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株對(duì)硝態(tài)氮及銨態(tài)氮吸收。結(jié)果表明：與野生型相比，核桃3 個(gè)JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系地上部分及地下部分銨態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加(P＜0.05)，地上部分分別增加59.1%、32.3%和55.1%，地下部分別增加68.1%、61.9%和114.1% (圖7D)；核桃3 個(gè)JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系地上部分硝態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低(P＜0.05)，地下部分硝態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加(P＜0.05)，地上部分分別降低10.1%、7.1%和13.6%，地下部分別增加63.5%、75.7%和70.3% (圖7E)。綜上所述，JrAMT2 基因主要作用于核桃地下部分，且JrAMT2 基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)植株地下部分對(duì)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的吸收，并介導(dǎo)了銨態(tài)氮從地下部到地上部的運(yùn)輸。

2.3.3 核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及葉綠素?zé)晒馓匦苑治?對(duì)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株葉色與葉片細(xì)胞葉綠體進(jìn)行觀察。核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株葉色與野生型相比顏色較深(圖8A)，在顯微鏡下觀察3 個(gè)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株株系及野生型葉綠體特征發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系擴(kuò)張的柵欄葉肉細(xì)胞中的葉綠體更致密(圖8B)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：對(duì)3 個(gè)陽(yáng)性株系進(jìn)行總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定，3 個(gè)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于野生型(P＜0.05)，野生型總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.53 mg·g-1，核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)陽(yáng)性植株3 個(gè)株系總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.64、4.69 和6.10 mg·g-1，與野生型相比分別增加了32.6%、34.0%和74.3% (圖8C)；JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系葉綠體表面積在單層細(xì)胞表面積的占比顯著高于野生型(P＜0.05)，野生型葉綠體表面積與單層細(xì)胞表面積的比率為0.56，3 個(gè)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系葉綠體表面積與單層細(xì)胞表面積的比值分別為0.67、0.68 和0.69，與野生型相比分別增加了19.41%、21.18%和22.94% (圖8D)。綜上所述，JrAMT2 基因過(guò)表達(dá)提高了葉綠體表面積與單層細(xì)胞表面積的比率及核桃葉肉細(xì)胞內(nèi)葉綠素的積累。

圖8 核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株葉綠體及葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析Figure 8 Analysis of chloroplast and chlorophyll content in J.regia with JrAMT2 overexpression

對(duì)3 個(gè)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系進(jìn)行快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)定。結(jié)果顯示：與野生型相比，3 個(gè)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系的O (Fo點(diǎn))相、K 相降低，J 點(diǎn)、I 點(diǎn)、P (Fm)及J～P 點(diǎn)振幅均提高，OJIP 曲線較陡，表明JrAMT2 基因一定程度上提高了葉片的活性(圖9A)。與野生型相比，3 個(gè)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系暗適應(yīng)后的最大熒光強(qiáng)度(Fm)、最大量子產(chǎn)額(Fv/Fm)均提高，F(xiàn)m分別提高了47.1%、45.9%、50.2%，F(xiàn)v/Fm分別提高了15.6%、13.4%、14.7%，表明JrAMT2 基因一定程度上提高了光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的光化學(xué)效率(圖9B)。計(jì)算歸一化處理的OJIP 曲線(Vt)[Vt=(Ft-Fo/(Fm-Fo)，F(xiàn)t為任意時(shí)刻t的熒光值]，并計(jì)算相對(duì)熒光差異ΔVt[ΔVt=Vt處理-Vt對(duì)照，用ΔK、ΔJ值分別顯示在300 μs 和20 ms處的ΔVt值，表示放氧復(fù)活體的活性(OEC)]。結(jié)果顯示：與野生型相比，3 個(gè)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系ΔK、ΔJ值下降且＜0 (圖9C)，表明JrAMT2 基因一定程度上提升了核桃葉片PSⅡ供體側(cè)及受體側(cè)電子傳遞效率及放氧復(fù)活體的活性。

圖9 銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白JrAMT2 基因表達(dá)對(duì)核桃葉綠素?zé)晒獾挠绊慒igure 9 Effect of ammonium nitrogen transporter JrAMT2 gene on chlorophyll fluorescence of J.regia

用JIP-test 參數(shù)對(duì)OJIP 曲線進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示：核桃3 個(gè)JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系在t=0 時(shí)的最大光化學(xué)效率(φPo)、反應(yīng)中心捕獲的光能用于下游電子傳遞的量子產(chǎn)量(ΨEo)、吸收的能量用于電子傳遞的量子產(chǎn)量(φEo)上升，分別上升了14.62%、44.59%、65.80%；在J 點(diǎn)的相對(duì)可變熒光強(qiáng)度(VJ)、最小熒光強(qiáng)度與最大熒光強(qiáng)度比值(Fo/Fm)、反應(yīng)中心關(guān)閉凈速率(dV/dto)下降，分別下降了31.03%、35.29%、49.34% (圖9D)，表明JrAMT2 基因一定程度上提高了PS 反應(yīng)中心的量子比率及產(chǎn)額；對(duì)單位PS 反應(yīng)中心比活性參數(shù)分析，結(jié)果顯示：與野生型相比，3 個(gè)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系在t=0 時(shí)的單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量(ETo/RC)、在t=0 時(shí)的單位反應(yīng)中心傳遞到電子鏈末端的能量(REo/RC)無(wú)明顯變化，在t=0 時(shí)單位反應(yīng)中心吸收的能量(ABS/RC)、在t=0 時(shí)單位反應(yīng)中心耗散的能量(DIo/RC)、在t=0 時(shí)單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA 的能量(TRo/RC)顯著下降，分別為36.43%、58.67%、27.22%，表明JrAMT2 基因一定程度提高了核桃葉片反應(yīng)中心活性和用于電子傳遞的能量份額，增強(qiáng)了電子傳遞能力(圖9E)；對(duì)單位受光截面比活性參數(shù)分析，結(jié)果顯示：與野生型相比，3 個(gè)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)株系在t=tFM(暗適應(yīng)后達(dá)到最大熒光強(qiáng)度時(shí)間點(diǎn))時(shí)的單位受光截面耗散的能量(DIo/CSm)無(wú)明顯變化，在t=tFM時(shí)單位受光截面吸收的能量(ABS/CSm)、在t=tFM時(shí)單位受光截面捕獲的用于還原QA 的能量(TRo/CSm)、在t=tFM時(shí)單位受光截面捕獲的用于電子傳遞的能量(ETo/CSm)、在t=tFM時(shí)單位受光截面?zhèn)鬟f到電子鏈末端的能量(REo/CSm)上升，分別上升了 47.79%、69.39%、145.10%、303.62%(圖9F)，表明JrAMT2 基因一定程度提高核桃葉片單位受光截面的電子傳遞的份額及電子傳遞效率。綜上所述，JrAMT2 基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)核桃的光合作用。

3 討論

氮素作為植物生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的營(yíng)養(yǎng)元素，是核酸、蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、植物激素等的重要組成部分[30]。自然界中可供利用的氮素資源有限，作物高產(chǎn)就需要化肥的投入。中國(guó)的化肥投入總量逐漸升高，但化肥利用率很低，給自然環(huán)境帶來(lái)極大的負(fù)擔(dān)[31-32]，因此合理使用化肥，提高作物對(duì)氮素的吸收效率是促進(jìn)農(nóng)業(yè)生態(tài)化發(fā)展的重要途徑。銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AMTs 是廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物中用于運(yùn)輸?shù)妮d體蛋白，從分子層面提高植物對(duì)氮素的利用具有重要意義。前人研究發(fā)現(xiàn)：在擬南芥中，氮饑餓能誘導(dǎo)AtAMT1.1、AtAMT2.1 基因上調(diào)表達(dá)，并且AtAMT2 基因的表達(dá)水平隨著氮饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)而增加[33-34]。在充足或高氮條件下，觀察到擬南芥中AtAMT2.1 及水稻根中OsAMT1.2 基因表達(dá)水平仍上調(diào)[35-36]，其中氮素形態(tài)對(duì)AMT 基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控也取決于AMT 基因個(gè)體和植物物種。

本研究對(duì)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株進(jìn)行初步的功能驗(yàn)證，對(duì)JrAMT2 基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析表明：JrAMT2 蛋白中含有29 個(gè)酸性氨基酸殘基(Asp+Glu)和29 個(gè)堿性氨基酸殘基(Arg+Lys)。該蛋白N 端在膜外，C 端存在膜內(nèi)，共含有11 個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域，與李暢[36]預(yù)測(cè)的OsAMT2.1 蛋白結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)相同，且與夏金澤等[37]研究的木薯ManihotesculentaMeAMT2.6 基因的蛋白結(jié)構(gòu)相似。AMT2 型蛋白通常在植物的各種組織中表達(dá)，包括根、芽和葉。前人研究發(fā)現(xiàn)：杜梨PyrusbetulifoliaPbAMT2 基因在所有器官中均有表達(dá)，但在根部表達(dá)最高[38]。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)：AtAMT2.1 基因主要在維管組織中表達(dá)，在芽中的表達(dá)高于根[15]。本研究對(duì)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株進(jìn)行綠色熒光觀察發(fā)現(xiàn)：JrAMT2 蛋白在核桃苗整株均有表達(dá)，且在芽及根莖的維管束中熒光更明亮，說(shuō)明與擬南芥相同，核桃JrAMT2 蛋白在所有器官中表達(dá)，且主要在維管組織中表達(dá)。

在植物生長(zhǎng)發(fā)育重要階段充足的氮素營(yíng)養(yǎng)供給可以促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育，增加產(chǎn)量，對(duì)植物外施氮素能增加植株株高及葉面積[39]。本研究對(duì)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株生長(zhǎng)性狀分析發(fā)現(xiàn)：JrAMT2 基因在核桃中過(guò)表達(dá)對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育有調(diào)控作用，主要表現(xiàn)在過(guò)表達(dá)植株株高、節(jié)間長(zhǎng)顯著增加。對(duì)過(guò)表達(dá)植株生根馴化結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)植株生物量顯著增加，根系發(fā)達(dá)。對(duì)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株移栽馴化，定植后植株生長(zhǎng)速率顯著高于野生型，主要表現(xiàn)在節(jié)間伸長(zhǎng)快，葉面積增加。AMT2 是具有銨吸收功能的銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，且在維管組織表達(dá)，暗示著該基因可能參與銨向木質(zhì)部的裝載，介導(dǎo)銨在植物中的長(zhǎng)距離運(yùn)輸。研究發(fā)現(xiàn)：擬南芥AtAMT2.1 除了對(duì)根吸收氮素有一定貢獻(xiàn)外，主要作用于從根部到莖部的運(yùn)輸[40]。本研究對(duì)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株地上部分和地下部分基因表達(dá)測(cè)定發(fā)現(xiàn)：植株地下部分JrAMT2 基因表達(dá)量顯著高于地上部分，且植株地下部分生物量的增加顯著高于地下部分，說(shuō)明核桃JrAMT2 基因主要在地下部分表達(dá)。對(duì)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株對(duì)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮吸收測(cè)定結(jié)果表明：核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株地上部分僅對(duì)銨態(tài)氮的吸收顯著上調(diào)，地下部分對(duì)銨態(tài)氮與硝態(tài)氮的吸收均顯著上調(diào)，說(shuō)明JrAMT2 基因促進(jìn)植株對(duì)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的吸收，并介導(dǎo)了銨態(tài)氮從地下部分到地上部分的運(yùn)輸。氮素營(yíng)養(yǎng)還會(huì)通過(guò)影響葉綠素合成和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化來(lái)參與光能的利用和調(diào)控[41]。有研究表明：水稻OsAMT2.1 基因敲除株系的光合特性與野生型相比出現(xiàn)下降趨勢(shì)，同樣說(shuō)明了AMT2 基因?qū)χ参锕夂献饔糜姓{(diào)控作用[36]。本研究對(duì)核桃JrAMT2 過(guò)表達(dá)植株葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化的測(cè)定結(jié)果顯示：JrAMT2 基因顯著提高了核桃的葉綠體表面積與單層細(xì)胞表面積比率、葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及葉綠素?zé)晒鈪?shù)中葉片放氧復(fù)活體活性、量子產(chǎn)額、電子傳遞效率。

4 結(jié)論

JrAMT2 作為銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)基因，促進(jìn)核桃對(duì)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的吸收，且介導(dǎo)銨態(tài)氮從根部到莖部的運(yùn)輸，對(duì)核桃生長(zhǎng)發(fā)育、光合作用等有積極作用，對(duì)研究核桃高效利用氮素及良種的篩選有重要意義。