洪森榮，張牧彤，徐子林，張欽榮，羅雨欣，田文慧，王心雨

（1.上饒師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334001；2.上饒農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院，江西 上饒 334001；3.上饒師范學(xué)院 上饒市藥食同源植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 上饒 334001；4.上饒師范學(xué)院 上饒市薯芋類作物種質(zhì)保存與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 上饒 334001）

葉綠體是高等植物細(xì)胞內(nèi)一種重要的與光合作用和物質(zhì)代謝相關(guān)的細(xì)胞器，葉綠體基因組是一套具有母系遺傳特征的獨(dú)立基因組，是高等植物細(xì)胞質(zhì)基因組的組成成分之一[5]。與核基因組相比，葉綠體基因組全長(zhǎng)序列短、易測(cè)序獲得、基因直系同源、基因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、保守性較高、進(jìn)化速率適中，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物系統(tǒng)發(fā)育分析、物種分類鑒定及分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)等研究中，在物種起源、進(jìn)化、演變及比較基因組學(xué)等研究領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越大的作用[6]。密碼子是核酸和蛋白質(zhì)之間遺傳信息傳遞的橋梁[7]，mRNA 上的遺傳信息以tRNA 三重密碼子傳遞。氨基酸一般對(duì)應(yīng)≥1 的密碼子[8]，這些密碼子稱為同義密碼子[9]。在自然選擇或突變偏好的情況下，基因傾向于使用≥1 的同義密碼子，即同義密碼子使用偏好性[10-12]。目前，關(guān)于茄屬的葉綠體基因組研究已有報(bào)道[13-19]，而針對(duì)‘懷玉山’高山馬鈴薯的研究大多集中在基因克隆[20]、轉(zhuǎn)錄組分析[3]、遺傳多樣性[4]、脫毒快繁[2]、DNA 甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)分析[21]等方面，對(duì)‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體全基因組及其密碼子使用偏好性方面的研究還未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序和組裝，分析基于葉綠體基因組的‘懷玉山’高山馬鈴薯系統(tǒng)進(jìn)化、結(jié)構(gòu)解析和密碼子偏好性等，為‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組研究和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，也為進(jìn)一步研究‘懷玉山’高山馬鈴薯遺傳背景、種質(zhì)資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

由上饒市薯芋類作物種質(zhì)保存與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供的‘懷玉山’高山馬鈴薯試管苗。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取和測(cè)序 選取‘懷玉山’高山馬鈴薯(MLS)試管苗葉片組織，利用植物基因組DNA 提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取‘懷玉山’高山馬鈴薯試管苗DNA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的完整性，NanoDrop 2000 分光光度計(jì)(Thermo Scientific 公司)檢測(cè) DNA 濃度和純度，用超聲波將DNA 片段化，然后對(duì)片段化的DNA 進(jìn)行片段純化、末端修復(fù)、3′端加A、連接測(cè)序接頭，再用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增形成測(cè)序文庫(kù)。建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用BGISEQ-500 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 葉綠體全基因組的組裝與注釋 通過(guò)SOAPnuk 1.3.0 對(duì)raw data (測(cè)序下機(jī)的原始數(shù)據(jù))進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾，去除其中的接頭序列及低質(zhì)量reads (高通量測(cè)序中一個(gè)反應(yīng)獲得的測(cè)序序列)，獲得高質(zhì)量的clean data (對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾后并剔除了低質(zhì)量數(shù)據(jù)的剩余數(shù)據(jù))。采用Noveplastys 軟件組裝葉綠體基因組核心模塊，以起始組裝序列為起點(diǎn)開(kāi)始組裝葉綠體contigs (很多reads 根據(jù)序列拼接在一起拼出的片段)，如果contigs 未環(huán)化，則利用CAP 3 軟件連接多個(gè)contigs 為完整葉綠體基因組，并手動(dòng)調(diào)整環(huán)狀葉綠體基因組起始位置。使用GeSeq、tRNAscan-SE 對(duì)葉綠體基因組進(jìn)行注釋，再經(jīng)過(guò)手工校正后得到最終的基因注釋結(jié)果。將注釋完成的‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組序列提交至美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)，獲得登錄號(hào)：OP589401。使用OGDRAW 繪制葉綠體基因組圖譜。

1.2.3 葉綠體基因組特征分析 通過(guò)JSHYCloud 在線工具集分析并統(tǒng)計(jì)葉綠體基因組、大單拷貝區(qū)(LSC)、小單拷貝區(qū)(SSC)和反向重復(fù)區(qū)(IR)的鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶所占的比例(GC 比例)；使用MISA 軟件進(jìn)行簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)分析，單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的最小重復(fù)值分別設(shè)置為10、6、5、5、5、5；利用REPuter 軟件進(jìn)行長(zhǎng)重復(fù)序列(longrepeat)分析，查找正向重復(fù)(F)、反向重復(fù)(R)、互補(bǔ)重復(fù)(C)、回文重復(fù)(P)等4 種重復(fù)類型；通過(guò)Pasteur Galaxy 在線工具集中的CodonW 模塊分析密碼子使用情況，設(shè)置輸出結(jié)果為有效密碼子數(shù)(ENC)和相對(duì)同義密碼子使用頻率(RSCU)，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。將‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組序列上傳至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI) 進(jìn)行BLASTn 比對(duì)，選擇highly similar sequence (megablast)比較相似性在95 %以上的序列，檢索獲得‘懷玉山’高山馬鈴薯的近緣種。利用Gview、VISTA tools、IRscope 和DNADnaSP 6.0 軟件繪制‘懷玉山’高山馬鈴薯及其10 個(gè)近緣種(S.cochoaeNC_062512、多毛番茄S.habrochaitesNC_026879、潘那利番茄S.pennelliiNC_035742、S.bukasoviiMT120867、S.bolivienseNC_062870、S.trisectumNC_062469、S.salamancaeNC_062480、S.clivorumNC_062513、S.mortoniiNC_062426、S.insanumMW384851)的變異圈圖、mVIST 結(jié)構(gòu)變異圖、IR 結(jié)構(gòu)變異圖，計(jì)算‘懷玉山’高山馬鈴薯及其10 個(gè)近緣種的基因組核酸多樣性(Pi)，參數(shù)設(shè)置100 bp 滑窗，25 bp 的步長(zhǎng)，并進(jìn)行中性繪圖分析(GC3-GC12 分析)、ENC-plot 分析、PR2-bias-plot 分析和最優(yōu)密碼子分析；對(duì)‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因的ENC 進(jìn)行排序，分別選取兩端基因各5 個(gè)，構(gòu)建高表達(dá)基因庫(kù)(ENC 小)和低表達(dá)基因庫(kù)(ENC 大)，并計(jì)算兩者的RSCU 差值(ΔRSCU)。篩選ΔRSCU≥0.08 的高表達(dá)密碼子，且將RSCU＞1.00 的高頻率密碼子定義為‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子；最后利用mafft 7.0 和fasttree 2.1.10 軟件分別對(duì)‘懷玉山’高山馬鈴薯和18 個(gè)近緣種以及煙草屬Nicotiana2 個(gè)外類群物種進(jìn)行序列比對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組序列特征分析

經(jīng)過(guò)測(cè)序組裝的完整的葉綠體基因組長(zhǎng)度為155 296 bp，圖1 顯示：‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組呈典型的四分體結(jié)構(gòu)，包含1 個(gè)LSC、1 個(gè)SSC 和2 個(gè)將LSC 與SSC 分隔開(kāi)的IR (IRa 和IRb)?；蚪M的總GC 比例為37.88%，A、T、C、G 比例分別為30.65%、31.47%、19.24%、18.65%。LSC、SSC 和IR 的長(zhǎng)度分別為85 737、18 373、25 593 bp。LSC 的GC 比例為36.01%，A、T、C、G 比例分別為31.29%、32.70%、18.40%、17.61%；SSC 的GC 比例為32.09%，A、T、C、G 比例分別為33.78%、34.14%、16.69%、15.40%；IRb 的GC 比例為43.10%，A、T、C、G 比例分別為28.57%、28.33%、20.72%、22.39%；IRa 的GC 比例為43.10%，A、T、C、G 比例分別為28.33%、28.57%、22.39%、20.72%。表明‘懷玉山’高山馬鈴薯IR 的GC 比例最大，LSC 次之，SSC 最少；葉綠體基因組總GC 比例顯著低于AT 比例；葉綠體基因組各堿基比例從大到小依次為T(mén)、A、C、G。

圖1 ‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組圖譜Figure 1 Chloroplast genome map of S.tuberosum var.cormosus ‘Huaiyushan’

2.2 葉綠體基因類型分析

葉綠體基因組共注釋到光合作用基因、自我復(fù)制基因、其他基因和未知功能基因4 類，包括87 個(gè)編碼區(qū)(CDS)基因、37 個(gè)tRNA 基因、8 個(gè)rRNA 基因、1 個(gè)假基因，共133 個(gè)基因。對(duì)有多個(gè)外顯子的葉綠體基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，由2 個(gè)外顯子構(gòu)成的基因有21 個(gè)，包括13 個(gè)CDS 基因和8 個(gè)tRNA 基因；由 3 個(gè)外顯子構(gòu)成的基因有4 個(gè)，為clpP1、ycf3、rps12 (2 個(gè))基因。LSC 的基因數(shù)量最多(81 個(gè))，其中CDS 基因59 個(gè)、tRNA 基因22 個(gè)；SSC 的基因數(shù)量為11 個(gè)，其中CDS 基因10 個(gè)、tRNA 基因1 個(gè)；IR 的基因數(shù)量為17 個(gè)，其中CDS 基因6 個(gè)、rRNA 基因4 個(gè)、tRNA 基因7 個(gè)；SSC 與IRb 邊界(JSB)的基因數(shù)量為2 個(gè)(ndhF和ycf1)；LSC 與IRb 邊界(JLB)的基因數(shù)量為1 個(gè)(rps19)；SSC 與IRa 邊界(JSA)的基因數(shù)量為2 個(gè)(ycf1)；LSC 與IRa 邊界(JLA)的基因數(shù)量為0。rps12 有2 個(gè)拷貝，每個(gè)拷貝具有3 個(gè)外顯子，且2 個(gè)拷貝共享第1 個(gè)外顯子，第1 個(gè)外顯子位于LSC，另外2 個(gè)外顯子位于IR (表1)。

表1 ‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因功能分類Table 1 Chloroplast gene functional classification of S.tuberosum var.cormosus ‘Huaiyushan’

2.3 葉綠體基因組重復(fù)序列分析

葉綠體基因組中共檢測(cè)到38 個(gè)SSR 位點(diǎn)，其中，單堿基重復(fù)有36 個(gè)，雙堿基重復(fù)有2 個(gè)。其中，重復(fù)單元為A/T，重復(fù)頻率為10 的SSR 位點(diǎn)數(shù)量最多(18 個(gè))，重復(fù)頻率為11 的SSR 位點(diǎn)數(shù)量次之(11 個(gè))；重復(fù)單元為AT/AT、重復(fù)頻率為6 的SSR 位點(diǎn)數(shù)量為2 個(gè)。

四川大學(xué)陳劍等[11]從醬香型酒糟中篩選得到1株耐酸產(chǎn)酯細(xì)菌ZP-28，此株細(xì)菌具有顯著耐高溫耐酸特性，且酯化力較高，將其應(yīng)用在麩曲中具有明顯改善麩曲品質(zhì)的作用。本課題在此基礎(chǔ)上以該菌株為研究對(duì)象，采用分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，并利用活菌計(jì)數(shù)法和分光光度法兩種不同的方法測(cè)定其生長(zhǎng)曲線，采用單因素實(shí)驗(yàn)考察了溫度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量等培養(yǎng)條件對(duì)酯化力的影響，并在此基礎(chǔ)上采用正交法對(duì)上述發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)改進(jìn)制曲工藝，提高白酒酯香提供了一定的理論依據(jù)。

2.4 葉綠體基因組長(zhǎng)重復(fù)序列分析

葉綠體基因組共鑒定到32 個(gè)長(zhǎng)重復(fù)序列，包括16 個(gè)正向重復(fù)(15 個(gè)30～39 bp，1 個(gè)40～49 bp)，16 個(gè)回文重復(fù) (13 個(gè)30～39 bp，2 個(gè)40～49 bp，1 個(gè)50～59 bp)，無(wú)反向重復(fù)和互補(bǔ)重復(fù)。

2.5 葉綠體基因組反向重復(fù)區(qū)邊界結(jié)構(gòu)差異分析

‘懷玉山’高山馬鈴薯及其10 個(gè)近緣種葉綠體基因組結(jié)構(gòu)從LSC 中間呈線性展開(kāi)，均由1 個(gè)LSC、1 個(gè)SSC 和2 個(gè)IR (IRa 和IRb) 4 部分組成?！畱延裆健呱今R鈴薯及其10 個(gè)近緣種rpl22、rps19、rpl2、ycf1、ndhF、trnH和psbA位置基本一致，但收縮和擴(kuò)張的長(zhǎng)度存在一些差異(圖2)。

圖2 ‘懷玉山’高山馬鈴薯及其10 個(gè)近緣種葉綠體基因組大單拷貝區(qū)、小單拷貝區(qū)和反向重復(fù)區(qū)邊界位置的比較Figure 2 Comparison on the boundary locations of large single copy region, small single copy region and inverted repeat region in chloroplast genomes of S.tuberosum var.cormosus ‘Huaiyushan’ and its 10 related species

2.6 葉綠體基因組比對(duì)分析

‘懷玉山’高山馬鈴薯及其10 個(gè)近緣種葉綠體基因組核苷酸多樣性的變化范圍為0～0.139 27，高變區(qū)主要分布在LSC 和SSC。LSC 的trnL-UAA-trnF-GAA、cemA、rps12-exon1-clpP1、clpP1 基因變異率最高；SSC 的rpl32-trnL-UAG、ycf1 基因變異率最高。

2.7 葉綠體基因組密碼子使用偏性分析

2.7.1 同義密碼子的偏性分析 葉綠體基因組87 個(gè)CDS 基因密碼子3 個(gè)位置GC 比例的平均值為38.38%，GC1、GC2、GC3 分別為45.98%、39.55%、29.60%，這說(shuō)明GC 在密碼子3 個(gè)位點(diǎn)上的分布存在顯著差異，只有GC2 與平均GC 大致接近(圖3)。ENC 是密碼子偏性分析的重要指標(biāo)，通常將35 作為區(qū)分值來(lái)評(píng)估密碼子偏倚的強(qiáng)度。葉綠體基因組87 個(gè)CDS 基因的平均ENC 為47.29，ENC＞45 的基因有60 個(gè)，ENC＞35 的基因有83 個(gè)，有4 個(gè)基因的ENC＜35，這表明葉綠體基因組的密碼子偏性較弱。通過(guò)SPSS 20.0 進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明：密碼子總GC 比例(GCall)與GC1、GC2 在0.01 水平上均存在極顯著的正相關(guān)，GCall 與GC3 在0.05 水平上顯著相關(guān)；GC1 與GC2 在0.05 水平上存在顯著正相關(guān)，但兩者均與GC3 不相關(guān)。這表明葉綠體基因組密碼子前2 位的堿基組成相似，而與第3 位不相似。ENC 與GC1、GC2、GC3 均不相關(guān)，說(shuō)明密碼子上第1 位、第2 位和第3 位的堿基組成對(duì)ENC 沒(méi)有顯著影響。葉綠體基因組 87 個(gè)CDS 基因序列共有31 個(gè)RSCU＞1 的密碼子。在這31 個(gè)密碼子中，除AUG、UUG 外，其余都以A、U 結(jié)尾，表明A、U 堿基在密碼子最后位點(diǎn)上出現(xiàn)的頻率最高。‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組密碼子偏好以A、U 結(jié)尾(表2)。

表2 ‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組同義密碼子的使用頻率Table 2 Relative synonymous codon usage (RSCU) of chloroplast genome of S.tuberosum var.cormosus ‘Huaiyushan’

圖3 ‘懷玉山’高山馬鈴薯及其10 個(gè)近緣種葉綠體基因組密碼子組成成分分析Figure 3 Composition analysis of chloroplast genome codons of S.tuberosum var.cormosus ‘Huaiyushan’ and its 10 related species

2.7.2 GC3-GC12 分析 分析發(fā)現(xiàn)：‘懷玉山’高山馬鈴薯及其10 個(gè)近緣種植物葉綠體基因的GC3 比例分布為0.142 9～0.443 2，GC12 比例分布為0.285 7～0.658 5，兩者大多沿對(duì)角線上方分布。兩者的相關(guān)系數(shù)(r)為0.110 1 (R2=0.012 1)，相關(guān)不顯著(P＞0.05)，回歸斜率為0.117 5，說(shuō)明GC12 與GC3 不相關(guān)(圖4A)。表明‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組密碼子使用偏性很大程度上受自然選擇的影響，而受突變壓力的影響小。

圖4 ‘懷玉山’高山馬鈴薯及其10 個(gè)近緣種葉綠體基因組密碼子GC3-GC12 分析(A)、ENC-plot 分析(B)和PR2-plot 分析(C)Figure 4 GC3-GC12 analysis (A), ENC-plot analysis (B) and PR2-plot analysis (C) of chloroplast genome codons of S.tuberosum var.cormosus‘Huaiyushan’ and its 10 related species

2.7.3 ENC-plot 分析 分析表明：分布在期望曲線上或曲線附近的基因較少，分布在期望曲線下方且遠(yuǎn)離曲線的基因較多，說(shuō)明大部分基因的實(shí)際ENC (ENCobs)與理論ENC (ENCexp)存在差異。為了解實(shí)際ENC 和理論ENC 的差異度，計(jì)算了‘懷玉山’高山馬鈴薯ENC 比值頻數(shù)，即(ENCexp-ENCobs)/ENCexp。結(jié)果表明：‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組基因中，有16.47%(14 個(gè))的基因分布在0～0.1 區(qū)間，分布于期望曲線上或曲線附近，即ENCobs 接近于ENCexp 值，有83.53%的基因分布在0～0.1 區(qū)間外，遠(yuǎn)離期望曲線分布，即ENCexp 和ENCobs 相差較大，表明自然選擇是影響‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組密碼子使用偏性的主要因素，而突變壓力的作用較小(圖4B)。

2.7.4 PR2-plot 分析 分析表明： A3/AU3 軸、G3/GC3 軸均以0.5 為界限，發(fā)現(xiàn)4 個(gè)平面內(nèi)基因分布不均衡。從G3/GC3 軸看，多數(shù)基因位于上方(＞0.5)，少數(shù)基因位于下方(＜0.5)；從A3/AU3 軸看，多數(shù)基因位于左側(cè)(＜0.5)，少數(shù)基因位于右側(cè)(＞0.5)。這表明4 種堿基在同義密碼子第3 位上存在C＞G、T＞A 現(xiàn)象(圖4C)。當(dāng)密碼子使用存在偏性完全受突變壓力影響時(shí)，C 和G 以及A 和T 同義密碼子在第3 位上的分布應(yīng)相等。因此，‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組密碼子使用偏性主要受自然選擇等因素影響。

2.7.5 最優(yōu)密碼子確定 RSCU 分析可知：同時(shí)滿足RSCU＞1 和ΔRSCU≥0.08 的密碼子共10 個(gè)，即CGU、AAA、CUU、GUU、GGA、GUA、GGU、UCA、GCU、CCU，這些密碼子都以A、U 結(jié)尾，被確定為‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子(表3)。

表3 ‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因最優(yōu)密碼子篩選Table 3 Optimal codon screening of chloroplast genome of S.tuberosum var.cormosus ‘Huaiyushan’

2.8 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于‘懷玉山’高山馬鈴薯和18 個(gè)近緣種以及煙草屬2 個(gè)外類群物種葉綠體基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析可知：茄屬聚為一大類，煙草屬聚為另一大類。在茄屬中，MLS 與S.tuberosumNC_008096(‘Ddeiree’)聚為一小分支。說(shuō)明‘懷玉山’高山馬鈴薯與S.tuberosum‘Ddeiree’親緣關(guān)系較近，兩者同源(圖5)。

圖5 基于葉綠體基因組的‘懷玉山’高山馬鈴薯及其18 個(gè)近緣種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 5 Phylogenetic tree of S.tuberosum var.cormosus ‘Huaiyushan’ and its 18 related species based on chloroplast genome

3 討論與結(jié)論

葉綠體基因組結(jié)構(gòu)保守、獨(dú)立母系遺傳，是被子植物基因組的重要組成部分，廣泛用于被子植物的生長(zhǎng)發(fā)育、類群分析和進(jìn)化分析[22]。被子植物葉綠體基因組大小一般為120～180 kb，IR 大小一般為20～30 kb[23-24]。在本研究中，‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組長(zhǎng)度和IR 長(zhǎng)度分別為155 296 和25 593 bp，與S.tuberosum‘Shepody’[16]葉綠體基因組長(zhǎng)度和IR 長(zhǎng)度一致，與其他馬鈴薯品種[13-15,17-18]相比，葉綠體基因組長(zhǎng)度和IR 長(zhǎng)度不超過(guò)500 bp，說(shuō)明馬鈴薯各個(gè)品種的葉綠體基因組較為保守。

葉綠體的SSR 不僅與核基因組SSR 一樣，具有高多態(tài)性、多等位性、共顯性[25]，也具有單親遺傳模式，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、相對(duì)保守[26]，因此，葉綠體的SSR 有較好的種間、種內(nèi)遺傳變異區(qū)分能力，已成為區(qū)分物種的重要分子標(biāo)記而被廣泛應(yīng)用[27]。關(guān)惜今等[13]研究表明：S.fernandezianum與其野生近緣種(S.phureja、S.palustre、S.etuberosum)葉綠體基因組中共檢測(cè)到36、36、42、40 個(gè)SSR，SSR 類型比較單一，只有單核苷酸和二核苷酸等2 種類型，單核苷酸為A和T等2 種類型，二核苷酸包括TA 和AT 等2 種類型，其數(shù)目比較少。本研究結(jié)果與此一致。在本研究中，在‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組中共檢測(cè)到38 個(gè)SSR 位點(diǎn)，其中，單堿基重復(fù)有36 個(gè)，雙堿基重復(fù)有2 個(gè)，較少的SSR 位點(diǎn)存在表明‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組可能不易發(fā)生重排。

IR 和單拷貝區(qū)(SC)邊界的膨脹和收縮被認(rèn)為是被子植物葉綠體全基因組大小變化的主要機(jī)制[28]，同一屬不同品種葉綠體基因組IR/SC 邊界位置變化也不同[29]。關(guān)惜今等[13]研究表明：S.fernandezianum與其野生近緣種(S.phureja、S.palustre、S.etuberosum)葉綠體基因組rps19 基因均橫跨JLB，S.phureja的ndhF基因橫跨JSB，S.fernandezianum、S.palustre、S.etuberosum的ndhF基因均右移，分布在SSC，S.fernandezianum、S.phureja、S.palustre、S.etuberosum的ycf1 基因總長(zhǎng)度為5 664 bp，均橫跨SSC 和IRa 區(qū)域。在本研究中，對(duì)‘懷玉山’高山馬鈴薯及其10 個(gè)近緣種葉綠體基因組 IR/SC 邊界區(qū)域的分析結(jié)果表明：這些葉綠體基因組的IR 都存在擴(kuò)張或收縮的現(xiàn)象?！畱延裆健呱今R鈴薯的rps19 基因橫跨 JLB，橫跨 JLB 的左邊和右邊長(zhǎng)度分別為209 和69 bp，在JSA，‘懷玉山’高山馬鈴薯ycf1 基因?yàn)? 663 bp，左邊和右邊長(zhǎng)度分別為4 541 和1 122 bp。

許多植物存在密碼子偏好性(CUB)，即某一或幾種特定密碼子頻率超過(guò)其他同義密碼子。密碼子偏好性可用來(lái)評(píng)估基因組中蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS)的密碼子使用情況[30]。植物密碼子偏好性是物種不斷適應(yīng)外界環(huán)境進(jìn)化所導(dǎo)致的結(jié)果，生物獲得特定的密碼子使用模式以適應(yīng)起源、進(jìn)化、自然選擇和突變壓力等多種因素[31]。影響不同物種中密碼子偏好性差異的因素主要有堿基突變、基因表達(dá)水平、自然選擇等，自然選擇和突變壓力被認(rèn)為是2 個(gè)最重要的因素[32-34]。密碼子第3 個(gè)堿基的同義突變不能改變氨基酸的類型，但被認(rèn)為是決定氨基酸類型的重要特征，因此GC3 經(jīng)常被用作密碼子偏向的重要指標(biāo)[35-36]。本研究發(fā)現(xiàn)‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組的平均GC 比例為38.38%，GC3 為29.60%，更傾向于使用A/T 密碼子。RSCU 分析結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)?！畱延裆健呱今R鈴薯葉綠體基因組中存在A/T 密碼子使用偏向，這與大多數(shù)高等植物的模式一致[37]。‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組平均ENC 為47.29，ENC＞35 的基因有83 個(gè)，有4 個(gè)基因的ENC＜35，表明‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組的密碼子偏性較弱。當(dāng)密碼子的使用受到自然選擇的影響時(shí)，GC3 值往往分布在一個(gè)較小的范圍內(nèi)，GC12 和GC3 之間沒(méi)有顯著的相關(guān)性[38]。密碼子偏好性可以通過(guò)調(diào)節(jié)基因翻譯的準(zhǔn)確性和效率影響基因表達(dá)，基因表達(dá)水平越高，密碼子偏好性越強(qiáng)[39-40]。通過(guò)建立的高低基因表達(dá)庫(kù)，本研究挖掘到‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組10 個(gè)最優(yōu)密碼子，即CGU、AAA、CUU、GUU、GGA、GUA、GGU、UCA、GCU、CCU，說(shuō)明‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組密碼子更偏好于以A/U 結(jié)尾。篩選到的最優(yōu)密碼子可以用于設(shè)計(jì)葉綠體基因表達(dá)載體，以提高葉綠體基因組中基因的表達(dá)水平，也可以利用已知密碼子的使用偏好來(lái)推測(cè)和預(yù)測(cè)未知基因的表達(dá)和功能，可為今后從遺傳水平上進(jìn)行‘懷玉山’高山馬鈴薯育種改良提供參考。

含有足夠信息位點(diǎn)的葉綠體基因組已被證明可有效判斷系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，甚至是在較低的分類學(xué)水平下植物之間也有較強(qiáng)的分類學(xué)意義，為物種間系統(tǒng)發(fā)育的研究提供了新的思路[41]。在本研究中，在茄屬中‘懷玉山’高山馬鈴薯與S.tuberosum‘Desiree’單獨(dú)聚為一分支。說(shuō)明‘懷玉山’高山馬鈴薯與S.tuberosum‘Desiree’親緣關(guān)系較近，表明兩者同源，推測(cè)‘懷玉山’高山馬鈴薯可能是S.tuberosum‘Desiree’從美國(guó)引種的。

綜上所述，本研究測(cè)序組裝了‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組全序列，分析了其編碼蛋白基因的密碼子使用特點(diǎn)，從高表達(dá)優(yōu)越密碼子和高頻密碼子中選出兩者共有的密碼子，最終篩選得到了10 個(gè)葉綠體蛋白編碼基因的最優(yōu)密碼子?！畱延裆健呱今R鈴薯密碼子的偏好性受到突變、選擇及其他多方面因素的共同影響，但自然選擇的影響更大，這為用基因工程手段改造外源基因密碼子，提高其在‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體中的表達(dá)量提供了參考，也為在分子水平上研究茄科茄屬植物的系統(tǒng)進(jìn)化提供參考。