馬疏言，鄭月萍,2，鄭志富,2

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 油料作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用研究所，浙江 杭州 311300）

磷脂酸(phosphatidic acid，PA)是一種常見(jiàn)的細(xì)胞甘油磷脂，也是最簡(jiǎn)單的膜脂之一[1]。幾乎所有生物體內(nèi)都會(huì)產(chǎn)生PA，包括酵母[2]、動(dòng)物[3]和植物[4]等。在植物中PA 的合成主要包括2 種方式：第1 種是從頭合成途徑，3-磷酸甘油先后在3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶和溶血磷脂酸脂?；D(zhuǎn)移酶的作用下發(fā)生連續(xù)2 步?；磻?yīng)生成PA，這也是PA 合成的主要途徑[5]；第2 種是磷脂的降解途徑，磷脂降解又可分為2 種，一種是磷脂酶D 通過(guò)水解某些結(jié)構(gòu)磷脂直接生成PA[6-9]，另一種是磷脂酶C 通過(guò)水解磷脂酰肌醇生成二脂酰甘油[10]，繼而經(jīng)二脂酰甘油激酶磷酸化生成PA[11]。PA 作為一種結(jié)構(gòu)膜脂，磷酸基團(tuán)頭部能夠以“靜電/氫鍵開(kāi)關(guān)模型”的方式與蛋白質(zhì)結(jié)合[12]。在該模型中，PA 結(jié)合蛋白中帶正電荷的堿性氨基酸殘基[13-17]，可以吸引磷脂雙分子層上的負(fù)電荷，并通過(guò)靜電作用影響膜環(huán)境，繼而與PA 頭部的磷酸基團(tuán)形成氫鍵，產(chǎn)生一個(gè)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。PA 這種攜帶負(fù)電荷并且在生理?xiàng)l件下呈圓錐體的獨(dú)特分子構(gòu)型[18]，使得PA 結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域能夠特異性的與其結(jié)合，保證了生物膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和功能的發(fā)揮。除了作為膜脂的一個(gè)結(jié)構(gòu)成分以及甘油脂合成的前體物質(zhì)，PA 還是一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)分子，在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。正常條件下，行使信號(hào)功能的PA 含量甚微；在植物應(yīng)答各種生物與非生物脅迫過(guò)程中PA 水平則會(huì)迅速升高，但這種積累往往是短暫的。這說(shuō)明生物體擁有一套嚴(yán)格控制信號(hào)分子PA 含量的機(jī)制，這對(duì)調(diào)節(jié)PA 信號(hào)傳遞強(qiáng)度、維持細(xì)胞物質(zhì)與能量代謝的動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要[19-22]。

盡管PA 擁有多種功能，但目前對(duì)于細(xì)胞內(nèi)PA 含量的動(dòng)態(tài)變化仍知之甚少，這主要受PA 檢測(cè)手段的限制。過(guò)去主要采用諸如薄層層析、高效液相色譜和放射性同位素標(biāo)記等理化手段對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定[23]。近年來(lái)，質(zhì)譜分析技術(shù)的應(yīng)用使得對(duì)包括PA 在內(nèi)的各種脂質(zhì)的測(cè)定更準(zhǔn)確和高效[24-25]。然而，這些理化手段都只能對(duì)組織器官中PA 總量與種類進(jìn)行定量或定性分析，無(wú)法捕捉細(xì)胞內(nèi)PA 的動(dòng)態(tài)與瞬時(shí)變化信息。通常認(rèn)為，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的PA 含量相對(duì)較高，這有助于促進(jìn)磷脂和三酰甘油的合成[26-27]；而質(zhì)膜和細(xì)胞器中行使信號(hào)功能的PA 含量甚微。顯然，采用理化測(cè)定會(huì)掩蓋胞內(nèi)PA 的真實(shí)變化。因此，亟需開(kāi)發(fā)一種能可視化分析細(xì)胞內(nèi)PA 的工具。

大量研究表明：生物體中PA 結(jié)合蛋白種類繁多，這些蛋白中的PA 結(jié)合域(phosphatidic acid binding domains，PABD)結(jié)構(gòu)亦存在差異。其中一些PABD 因與PA 結(jié)合專一性強(qiáng)，被用來(lái)開(kāi)發(fā)多種PA 探針[28-33]。酵母蛋白Spo20p 中的PA 結(jié)合域已被證實(shí)具有極強(qiáng)的專一性[33]，只結(jié)合PA 而不結(jié)合其他磷脂。目前基于這一PABD 所開(kāi)發(fā)的PA 探針在醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，但在植物中的應(yīng)用卻有限[34]。因此，本研究旨在構(gòu)建基于Spo20p 中的PABD 的植物PA 熒光探針，為剖析植物早期應(yīng)答逆境脅迫的細(xì)胞分子機(jī)制提供新工具。

1 材料與方法

1.1 植株培養(yǎng)

1.1.1 土壤基質(zhì)的培養(yǎng) 將擬南芥Arabidopsisthaliana種子置于含有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，4 ℃冰箱內(nèi)避光放置3 d 后將其點(diǎn)播在濕潤(rùn)的土壤基質(zhì)上(V營(yíng)養(yǎng)土∶V蛭石∶V珍珠巖=3∶1∶1)。將播種后的盆栽用透明塑料蓋覆蓋，置于24～25 ℃室溫、50%～60%濕度、14 h 光照/10 h 黑暗的植物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d 后揭去塑料蓋間苗。

1.1.2 培養(yǎng)基的培養(yǎng) 將擬南芥種子進(jìn)行消毒，加入適量滅菌過(guò)的蒸餾水，在4 ℃冰箱內(nèi)避光放置3 d，點(diǎn)播在1/2 MS 培養(yǎng)基上，置于植物培養(yǎng)間中培養(yǎng)。

1.2 PA 熒光探針的構(gòu)建

1.2.1 pSY06-GFP-PABD載體的構(gòu)建 酵母蛋白Spo20p 中存在一個(gè)高度專一的PA 結(jié)構(gòu)域(PABD)，該P(yáng)ABD 由40 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，只結(jié)合PA 而不結(jié)合其他磷脂[33-34]，因此，本研究選擇該P(yáng)ABD 與熒光蛋白融合，構(gòu)建PA 熒光探針。根據(jù)PAPD 核苷酸序列[33]設(shè)計(jì)引物(表1)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得與該P(yáng)ABD 相對(duì)應(yīng)的DNA 片段；同時(shí)PCR 擴(kuò)增獲得GFP基因編碼區(qū)序列。隨后，利用無(wú)縫克隆試劑盒(生工)，將GFP和PABD片段克隆至植物表達(dá)載體pSY06 的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)KpnI 和PstI 之間，獲得重組質(zhì)粒pSY06-GFP-PABD。PABD連接至GFP基因編碼區(qū)的3′端，構(gòu)成GFP-PABD融合基因，該融合基因的表達(dá)由組成型啟動(dòng)子UBQ10 驅(qū)動(dòng)。重組質(zhì)粒中的插入片段經(jīng)菌落PCR、KpnI 和PstI 雙酶切以及測(cè)序驗(yàn)證正確后，采用熱激法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌AgrobacteriumtumefaciensGV3101，用于后續(xù)擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化。

表1 相關(guān)引物序列Table 1 Sequence of related primers

1.2.2 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化、篩選及鑒定 以哥倫比亞野生型擬南芥(WT)為植物材料，利用農(nóng)桿菌花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥。將獲得的T1代擬南芥種子進(jìn)行表面消毒，均勻鋪在含有草銨膦(10 mg·L-1)和特美汀(50 mg·L-1)的1/2 MS 篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。將具有除草劑抗性的陽(yáng)性苗移栽到土壤中繼續(xù)培養(yǎng)，3 周后提取葉片DNA 并設(shè)計(jì)引物(表1)進(jìn)行PCR 鑒定，對(duì)T2和T3代轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行除草劑抗性的遺傳分析，最終篩選得到純合單插入位點(diǎn)轉(zhuǎn)基因株系。

1.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥中目的基因表達(dá)量分析

以在1/2 MS 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7 d 的轉(zhuǎn)基因擬南芥根系作為測(cè)定材料，使用高純度RNA 提取試劑盒(全式金)提取RNA 并對(duì)其進(jìn)行純度檢測(cè)和濃度測(cè)定。取等量RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(翌圣)進(jìn)行單鏈cDNA 的合成。選擇擬南芥肌動(dòng)蛋白基因Actin為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)引物(表1)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)，并對(duì)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.4 PA 熒光探針轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型觀察

將野生型和轉(zhuǎn)基因株系種子點(diǎn)播在1/2 MS 方形培養(yǎng)基上，豎直培養(yǎng)6 d 后，挑選長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的幼苗(每個(gè)基因型，20 株)，分別轉(zhuǎn)移至含有0 和50 mmol·L-1NaCl 的1/2 MS 固體培養(yǎng)基中繼續(xù)豎直培養(yǎng)，7 d 后觀察表型。

1.5 PA 熒光探針靈敏度分析

將在1/2 MS 方形培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)6 d 的幼苗分別浸泡在含有0、2 和10 μmol·L-1PA 的1/2 MS 液體培養(yǎng)基中，依次處理5、10、15 和20 min 后，利用熒光顯微鏡(ZEISS，Axio Imager 2)對(duì)擬南芥根尖分生區(qū)PA 的分布進(jìn)行觀察并拍照。

1.6 鹽堿脅迫下根尖PA 的檢測(cè)

將含PA 熒光探針的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系種子點(diǎn)播在1/2 MS 方形培養(yǎng)基上，豎直培養(yǎng)6 d，選擇均勻一致的幼苗分別浸泡在含有100 mmol·L-1NaCl、10 mmol·L-1NaHCO3和兼含兩者的1/2 MS 液體培養(yǎng)基中，處理5、10 和15 min 后用熒光顯微鏡觀察根尖分生區(qū)PA 的分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 PA 熒光探針的設(shè)計(jì)及其轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得

如圖1 所示：該載體以pSY06 為骨架，由35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)植物選擇標(biāo)記基因——草銨膦抗性基因(bar)的表達(dá)，而GFP-PABD融合基因的表達(dá)則由UBQ10 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。

圖1 pSY06-GFP-PABD 載體圖Figure 1 Vector diagram of pSY06-GFP-PABD

采用農(nóng)桿菌花序侵染法將GFP-PABD融合基因轉(zhuǎn)入擬南芥，獲得T1代轉(zhuǎn)基因種子。對(duì)T1代幼苗進(jìn)行草銨膦(10 mg·L-1)抗性篩選與PCR 鑒定，獲得56 個(gè)含融合基因的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系。隨后，對(duì)相應(yīng)株系的T2代幼苗(每個(gè)株系約300 株)繼續(xù)進(jìn)行草銨膦除草劑抗性篩選?？ǚ綔y(cè)驗(yàn)顯示：符合3(陽(yáng)性苗數(shù))∶1(陰性苗數(shù))分離規(guī)律的株系共8 個(gè)，這些株系為含單插入位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因株系。再對(duì)T2代各個(gè)株系不同植株的自交后代(T3代)進(jìn)行除草劑抗性篩選，最終獲得7 個(gè)純合、單插入位點(diǎn)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，分別為8-1、11-1、13-12、25-5、42-4、48-1 和53-1。

2.2 不同轉(zhuǎn)基因株系PA 熒光探針表達(dá)量的分析

為了明確不同轉(zhuǎn)基因株系PA 熒光探針表達(dá)量的差異，對(duì)上述7 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了目的基因的表達(dá)量測(cè)定。RT-qPCR 結(jié)果(圖2)顯示：當(dāng)將轉(zhuǎn)基因株系8-1 中融合基因的相對(duì)表達(dá)量設(shè)為參考值“1”，其余6 個(gè)株系(11-1、13-12、25-5、42-4、48-1 和53-1)的相對(duì)表達(dá)量分別為1.74、15.91、0.72、1.06、1.69 和1.52。株系13-12 的PA 探針的表達(dá)量最高，是其他株系的9～22 倍，為PA 探針高表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系；相應(yīng)地，將株系48-1 作為PA 探針低表達(dá)材料。

圖2 不同轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中GFP-PABD 融合基因的相對(duì)表達(dá)量Figure 2 Relative expression level of the GFP-PABD fusion gene in transgenic A.thaliana lines

2.3 PA 熒光探針對(duì)擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育的影響

為了明確PA 熒光探針的表達(dá)是否會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響，比較分析了野生型擬南芥和不同轉(zhuǎn)基因株系在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育周期的表型差異。土培生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)顯示：野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的葉片生長(zhǎng)無(wú)明顯差異，高表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系(13-12)與低表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系(48-1)之間亦無(wú)可見(jiàn)表型差異(圖3A)。另外，在含有0 和50 mmol·L-1NaCl 的1/2 MS 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，野生型與不同轉(zhuǎn)基因株系之間也未表現(xiàn)出生長(zhǎng)速率的差異(圖3B)。這些結(jié)果說(shuō)明：在一定范圍內(nèi)PA 熒光探針的表達(dá)不會(huì)影響擬南芥的正常生長(zhǎng)發(fā)育，這一特性有助于合理解釋特定條件下胞內(nèi)PA 變化對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生的影響。

圖3 野生型擬南芥與3 個(gè)PA 熒光探針轉(zhuǎn)基因株系的表型比較Figure 3 Phenotypic comparison between wild type and three transgenic lines of A.thaliana bearing PA fluorescent probe

2.4 熒光探針監(jiān)測(cè)PA 的靈敏度

隨著熒光探針表達(dá)量的增加，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度也會(huì)增強(qiáng)，這會(huì)導(dǎo)致PA 檢測(cè)的信噪比下降；相反，熒光探針表達(dá)量過(guò)低則會(huì)影響PA 檢測(cè)的靈敏度。為了獲得檢測(cè)靈敏度和信噪比都較高的PA 熒光探針，用不同濃度的外源PA 處理熒光探針表達(dá)量存在差異的轉(zhuǎn)基因株系，進(jìn)而在熒光顯微鏡下觀察根尖PA 的積累情況。結(jié)果(圖4～6)顯示：野生型擬南芥在有、無(wú)外源PA 處理下，根尖細(xì)胞自發(fā)熒光的強(qiáng)度無(wú)明顯差別。另外，在不同濃度外源PA 處理下，熒光探針低表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系(48-1)的根尖分生區(qū)的PA 含量變化未能被捕捉到。相反，對(duì)于熒光探針高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系(13-12)，2 和10 μmol·L-1PA 分別處理10 和5 min 后，其根尖分生區(qū)細(xì)胞的胞內(nèi)或質(zhì)膜上的PA 積累清晰可見(jiàn)(圖5)。當(dāng)外源PA 濃度低時(shí)，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞中PA 積累減少(圖5)，這很可能是因?yàn)樽鳛楦视椭铣汕绑w物質(zhì)的PA 已被轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。而當(dāng)外源PA 濃度升至10 μmol·L-1時(shí)，處理10、20 min 后依然可見(jiàn)細(xì)胞中的PA 呈點(diǎn)狀分布(圖6)。這些結(jié)果說(shuō)明：熒光探針表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)基因株系(13-12)可被用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞中PA 含量的變化。

圖4 無(wú)外源PA 處理下PA 探針在野生型和2 個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系根尖中熒光強(qiáng)度的差異分析Figure 4 Analysis of discrepancy in fluorescent intensity of PA probe between wild type and two transgenic lines of A.thaliana

圖5 外源PA(2 μmol·L-1)處理下PA 熒光探針對(duì)PA 監(jiān)測(cè)靈敏度的分析Figure 5 Sensitivity analysis of PA fluorescent probe monitoring PA under treatment with 2 μmol·L-1 exogenous PA

圖6 外源PA (10 μmol·L-1)處理下PA 熒光探針對(duì)PA 監(jiān)測(cè)靈敏度的分析Figure 6 Sensitivity analysis of PA fluorescent probe monitoring PA under treatment with 10 μmol·L-1 exogenous PA

2.5 熒光探針檢測(cè)鹽堿脅迫下擬南芥根尖PA 的含量變化

為了進(jìn)一步驗(yàn)證 PA 熒光探針的實(shí)用性，利用熒光探針表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)基因株系(13-12)檢測(cè)鹽堿脅迫條件下根尖細(xì)胞中PA 含量的變化。結(jié)果顯示：鹽、堿單獨(dú)或混合處理轉(zhuǎn)基因株系，5 min 后即可在根尖分生區(qū)細(xì)胞中觀察到PA 的點(diǎn)狀分布(圖7)。因此推斷，本研究構(gòu)建的PA 熒光探針可用于監(jiān)測(cè)逆境條件下植物細(xì)胞中PA 含量的變化。另外，鹽堿脅迫可快速誘導(dǎo)PA 積累這一現(xiàn)象表明在植物早期逆境響應(yīng)中PA 發(fā)揮某種重要作用。

圖7 單獨(dú)或混合鹽堿脅迫下PA 在轉(zhuǎn)基因擬南芥根尖分生組織中的分布Figure 7 Distribution of PA in the root tip meristem of a transgenic A.thaliana line bearing PA sensor under saline and alkaline stresses, alone or in combination

3 討論

已知PA 在植物生長(zhǎng)發(fā)育與逆境響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但由于缺乏PA 的可視化分析工具，對(duì)細(xì)胞中PA 含量動(dòng)態(tài)變化的了解十分有限。這一方面限制了PA 作用機(jī)制的研究，另一方面給評(píng)估基因工程手段操控植物細(xì)胞PA 含量變化所產(chǎn)生的實(shí)際應(yīng)用效果帶來(lái)困難。因此，本研究將酵母蛋白Spo20p 中對(duì)PA 高度專一的結(jié)合域與熒光蛋白融合，成功構(gòu)建了可對(duì)細(xì)胞內(nèi)PA 進(jìn)行可視化檢測(cè)的熒光探針。

為了使熒光探針適用于監(jiān)測(cè)整個(gè)生長(zhǎng)周期不同組織細(xì)胞中的PA 水平，選擇組成型表達(dá)啟動(dòng)子UBQ10 驅(qū)動(dòng)GFP-PABD融合基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)：植物細(xì)胞中PA 的檢測(cè)靈敏度與PA 熒光探針的表達(dá)量密切相關(guān)，表達(dá)量較高的熒光探針可有效檢測(cè)到外源PA 處理帶來(lái)的胞內(nèi)PA 水平的變化，而表達(dá)量較低的探針檢測(cè)效果則相反。如13-12 株系中PA 熒光探針的表達(dá)量高于其他株系，該株系經(jīng)2 μmol·L-1外源PA 處理10 min，其根尖細(xì)胞中PA 的點(diǎn)狀分布即可被觀察到，這也說(shuō)明外源PA 能夠被擬南芥根尖快速吸收，繼而與PA 熒光探針結(jié)合。鑒于已有研究中常用濃度高于10 μmol·L-1的外源PA 檢測(cè)PA 探針的靈敏度[35]，本研究中構(gòu)建的熒光探針可有效監(jiān)測(cè)到2 μmol·L-1外源PA 處理所帶來(lái)的細(xì)胞內(nèi)PA 含量的變化，推測(cè)基于13-12 轉(zhuǎn)基因株系的PA 熒光探針具有較高的PA 檢測(cè)靈敏度。

需要指出的是，PA 熒光探針使用過(guò)程中，樣品處理時(shí)間的延長(zhǎng)和觀察光源的增強(qiáng)均會(huì)使植物細(xì)胞造成某種損傷，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生自發(fā)熒光，從而降低PA 檢測(cè)的信噪比。因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需盡量縮短植物樣本的制片時(shí)間及熒光觀察的時(shí)間，以提高觀察結(jié)果的真實(shí)性。

鹽堿地中鹽和堿是2 種共存但不同的非生物脅迫，共同影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。利用本研究構(gòu)建的PA 熒光探針發(fā)現(xiàn)：鹽脅迫處理5 min 就會(huì)造成PA 在細(xì)胞中的積累，這與已有的研究結(jié)果一致[22,36]。同時(shí)，堿脅迫和鹽堿混合脅迫也會(huì)快速誘導(dǎo)PA 的積累。因此，為了全面了解植物早期逆境響應(yīng)機(jī)制，有必要監(jiān)測(cè)早期細(xì)胞中PA 含量的動(dòng)態(tài)變化。本研究開(kāi)發(fā)的PA 熒光探針為這些方面的研究提供了重要技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了一種基于酵母蛋白Spo20p 中PA 結(jié)合域的熒光探針，可有效監(jiān)測(cè)植物細(xì)胞中PA 含量變化。應(yīng)用該探針發(fā)現(xiàn)鹽堿脅迫可快速誘導(dǎo)擬南芥根尖細(xì)胞質(zhì)膜上和胞內(nèi)PA 的積累，這一結(jié)果表明PA 在植物對(duì)鹽堿脅迫早期應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用。