鄭棚汭，董春燕，陳之光,，徐 言，葛 紅，楊樹(shù)華，趙 鑫，寇亞平，朱晉宇，賈瑞冬，武榮花

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.青州市亞泰農(nóng)業(yè)科技有限公司，山東 青州 262501；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜花卉研究所 蔬菜生物育種全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部花卉生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (北方)，北京 100081）

指甲蘭屬Aerides是蘭科Orchidaceae 重要的觀賞植物及藥用植物，屬下有30 種，主要分布在印度、斯里蘭卡、尼泊爾、不丹、緬甸、越南、老撾、泰國(guó)、馬來(lái)西亞、菲律賓、印度尼西亞、巴布新幾內(nèi)亞，及中國(guó)南方亞熱帶區(qū)域[1]。中國(guó)共有多花指甲蘭A.rosea、香花指甲蘭A.odorata、小藍(lán)指甲蘭A.orthocentra、扇唇指甲蘭A.flabellate和指甲蘭A.flacata等5 種。指甲蘭屬為單軸分枝類(lèi)蘭花，與蝴蝶蘭屬Phalaenopsis、萬(wàn)代蘭屬Vanda、鉆喙蘭屬Rhynchostylis等關(guān)系較近，都屬于樹(shù)蘭亞科Epidendroideae 萬(wàn)代蘭族Vandeae 指甲蘭亞族Aeridinae，屬間雜交親和，可培育新品種[2]。據(jù)英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)蘭科登陸機(jī)構(gòu)(RHS)記載，蝴蝶蘭屬與指甲蘭屬的遠(yuǎn)緣雜交種已有20 余個(gè)。

多花指甲蘭原生境花期為5—7 月，果期為8 月至次年5 月，產(chǎn)于中國(guó)廣西、貴州、云南，在不丹、印度、緬甸、老撾和越南也有分布，生于海拔320～1 530 m 的山地林緣或山坡疏生的常綠闊葉林樹(shù)干上。被《中國(guó)物種紅色名錄》記為極危(CR)；被《中國(guó)生物多樣性紅色名錄：高等植物卷》記為瀕危(EN)。花色粉嫩、花量大、花型奇特、花香馥郁，是觀賞價(jià)值極高的蘭花，也可與蝴蝶蘭進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，培育有香味的蝴蝶蘭。

目前，對(duì)于多花指甲蘭的研究較少，主要在組織培養(yǎng)、非共生萌發(fā)技術(shù)[3]、功能性成分分析[4]等方面。王清蕓等[5]對(duì)其花粉活力和柱頭可授性研究發(fā)現(xiàn)：開(kāi)花6 d 時(shí)的花粉活力最強(qiáng)，盛花期柱頭可授性最高，但對(duì)其開(kāi)花進(jìn)程及繁育系統(tǒng)未進(jìn)行系統(tǒng)研究。開(kāi)展花部特征和繁育系統(tǒng)研究，不僅可以深入研究花朵的結(jié)構(gòu)、傳粉方式和媒介種類(lèi)，還能夠了解植物的生態(tài)適應(yīng)機(jī)制，為雜交育種工作提供依據(jù)。以往蘭科植物繁育系統(tǒng)研究[6-13]為本研究提供了參考。觀察多花指甲蘭開(kāi)花進(jìn)程，并進(jìn)行繁育系統(tǒng)研究，可為該物種種質(zhì)資源的保護(hù)提供有力保障，也為實(shí)現(xiàn)多花指甲蘭的人工繁殖和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，及遠(yuǎn)緣雜交育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與樣地

多花指甲蘭種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所溫室，該溫室春秋季常開(kāi)天窗；夏季開(kāi)風(fēng)機(jī)，水簾降溫；冬季有暖氣供暖。室溫保持在26～30 ℃，相對(duì)濕度為65%～70%。取200 株生長(zhǎng)狀況良好、無(wú)病蟲(chóng)害的5 年生多花指甲蘭進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 研究方法

1.2.1 花器官特征和開(kāi)花進(jìn)程觀測(cè) 隨機(jī)選取盛花期全天開(kāi)放的植株10 株，測(cè)量株高、花序長(zhǎng)、中萼片、側(cè)萼片、花瓣、唇瓣、花序、花朵數(shù)及葉片數(shù)。按照DAFNI[14]的標(biāo)準(zhǔn)，選取10 株植株進(jìn)行開(kāi)花進(jìn)程觀察，觀察記錄群體水平(群體內(nèi)第1 朵花至最后1 朵花開(kāi)放的日期)、單株水平(單株上第1 朵花開(kāi)放至最后1 朵花凋謝的日期)、單花水平的開(kāi)花進(jìn)程(單朵花花瓣從兩側(cè)打開(kāi)至花朵枯黃脫落的日期)。

1.2.2 電鏡掃描和花粉活力測(cè)定 選取初花期和末花期的花粉團(tuán)，經(jīng)配置的FAA 固定液(100 mL FAA 中含體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇89 mL、冰乙酸6 mL、甲醛5 mL)處理24 h 后，用乙醇溶液按梯度(體積分?jǐn)?shù)分別為70%、80%、90%、95%、100%)脫水15 min，放入加有干燥劑的1.5 mL 離心管中，用CO2臨界點(diǎn)干燥儀(Leica CPD 300)干燥5 h，用雙面膠將干燥后的植物樣品粘在金屬臺(tái)上，待觀察部位朝上。離子濺射儀(Hitachi E-1010)對(duì)金屬臺(tái)噴金、鍍膜。在掃描電子顯微鏡(Hitachi S-4800)下觀察和測(cè)量花粉團(tuán)的表面紋飾、花粉外形態(tài)，并拍照。

篩選測(cè)定多花指甲蘭花粉活力最適宜的方法：①醋酸洋紅染色法。于每日9:00—10:00 采集多花指甲蘭各生長(zhǎng)階段的新鮮花粉，將花粉置于載玻片上，用解剖針將花粉團(tuán)輕輕搗碎，滴入1～2 滴的醋酸洋紅染液后輕輕將其均勻分散開(kāi)，蓋上蓋玻片，每次制片3 張。靜置10～15 min后，于倒置顯微鏡(Olympus BX53)下觀察，選取6 個(gè)不同視野進(jìn)行拍照?；ǚ刍盍?qiáng)的花粉會(huì)被染成紅色，較淡的顏色被視為活力較弱。②氯化三苯四氮唑(質(zhì)量濃度為1%的TTC)染色法。參照邊子星[15]的方法：將新鮮的花粉置于2 mL 的試管中，用解剖針將其輕輕搗碎，后滴入1 滴質(zhì)量濃度為1%的TTC 染色液，黑暗培養(yǎng)24 h。搖晃試管，使得花粉分散均勻，用移液槍吸取含有花粉的TTC 染液，置于載玻片上，用解剖針輕輕將花粉細(xì)胞均勻分散開(kāi)，制片3 張。放至倒置顯微鏡(Olympus BX53)下進(jìn)行觀察并拍照，選取6 個(gè)不同的視野。以花粉細(xì)胞被染成紅色為活力較強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)，白色為活力較弱標(biāo)準(zhǔn)。③花粉離體萌發(fā)法。參照歐陽(yáng)英等[16]的方法：以質(zhì)量濃度為5.000%蔗糖+質(zhì)量濃度為0.050%硼酸+質(zhì)量濃度為0.001%氯化鈣+體積分?jǐn)?shù)為5.000%椰汁為液體培養(yǎng)基。將花粉用解剖針取下置于雙面凹載玻片上并散開(kāi)，用滴管吸取上述培養(yǎng)液滴入含花粉的凹面里，后將載玻片放于墊有3～5 張濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，蓋上蓋子置于組培室(室內(nèi)溫度25 ℃，相對(duì)濕度80%以上)培養(yǎng)48 h 后統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)數(shù)。以花粉管長(zhǎng)度超過(guò)花粉直徑的2 倍記為萌發(fā)。每階段取3 份樣，制片后隨機(jī)選取3 個(gè)視野統(tǒng)計(jì)萌發(fā)數(shù)，重復(fù)3 次。花粉萌發(fā)率=萌發(fā)的花粉數(shù)/視野內(nèi)總花粉數(shù)×100%。

1.2.3 柱頭可授性測(cè)定 采用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法[V(質(zhì)量濃度為1%聯(lián)苯胺)∶V(體積分?jǐn)?shù)為3%過(guò)氧化氫)∶V(水)=4∶11∶22]測(cè)定各階段柱頭的可授性。用體視顯微鏡(Olympus SZ)觀察并拍照。柱頭周?chē)磻?yīng)液伴有大量的氣泡產(chǎn)生表示柱頭具有可授性，氣泡越多表示可授性越強(qiáng)。

1.2.4 花粉組織化學(xué) 隨機(jī)采取多花指甲蘭成熟的花粉團(tuán)，將其放置載玻片上碾碎，滴入碘-碘化鉀浸染15 min，放置在倒置顯微鏡(Olympus BX53)下觀察，花粉若經(jīng)碘-碘化鉀處理后顯示紅色說(shuō)明花粉有脂質(zhì)存在，處理后若呈藍(lán)色或黑色則說(shuō)明花粉有淀粉存在。

1.2.5 雜交指數(shù)(OCI)估算 根據(jù)DAFNI[14]的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算OCI 值?；ǘ渲睆剑? mm 記為0；1～2 mm 記為1；2～6 mm 記為2；＞6 mm 則記為3?；ㄋ幣c柱頭的空間位置在同一高度記為0，空間分離記為1。花藥開(kāi)裂時(shí)間和柱頭可授粉期同步或雌蕊先熟記為0，雄蕊先熟記為1。三者之和為OCI。繁育系統(tǒng)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：OCI=0，為閉花受精；OCI=1，為專(zhuān)性自交；OCI=3，為自交親和，有時(shí)需要傳粉者；OCI≥4，為部分自交親和，異交，需要傳粉者。

1.2.6 人工控制授粉 隨機(jī)選取初花Ⅱ期花朵進(jìn)行人工控制授粉試驗(yàn)，設(shè)置6 個(gè)處理(不去雄不套袋不授粉、不去雄套袋不授粉、去雄不授粉、人工自花授粉、人工同株異花授粉、人工異株授粉)，檢測(cè)多花指甲蘭傳粉方式。每個(gè)處理重復(fù)3 次，共計(jì)20～30 朵花。授粉30 d 后統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)率。結(jié)實(shí)率＝結(jié)實(shí)數(shù)/授粉數(shù)×100%。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 利用Excel 2016 進(jìn)行表格繪制，SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、標(biāo)準(zhǔn)誤計(jì)算及顯著性分析(單因素方差分析、鄧肯法)，Photoshop 2021 進(jìn)行圖片制作。

2 結(jié)果和分析

2.1 花器官特征

由圖1 可見(jiàn)：多花指甲蘭有1～4 個(gè)花梗，其總狀花序長(zhǎng)10～30 cm，花序形態(tài)似“狐尾”。莖粗壯，長(zhǎng)約5～20 cm，花序葉腋生，花序軸較長(zhǎng)，密生數(shù)十至近百朵花；花由1 個(gè)中萼片、2 個(gè)側(cè)萼片、2 個(gè)花瓣和1 個(gè)唇瓣組成。子房棒狀帶縱棱，花梗和子房白色帶淡紫色暈；中萼片和側(cè)萼片呈卵圓形，花瓣披針形，花瓣與中萼片有粉紫色斑點(diǎn)。唇瓣上密布紫紅色斑點(diǎn)，邊緣稍具不整齊的鋸齒。表1 為多花指甲蘭株高、最大葉長(zhǎng)寬、花序長(zhǎng)、中萼片和側(cè)萼片的長(zhǎng)寬、花瓣長(zhǎng)寬及唇瓣的橫縱徑等花部表型性狀。

表1 多花指甲蘭表型性狀Table 1 Phenotype of the A.rosea

圖1 多花指甲蘭的花器官特征Figure 1 Floral syndrome of A.rosea

通過(guò)電子掃描顯微鏡觀察(圖2)可見(jiàn)：多花指甲蘭在開(kāi)花1～2 d 花粉團(tuán)比末花期花粉團(tuán)更加飽滿(圖2A 和B)。花粉團(tuán)表面不平整，有極多凸起，由數(shù)萬(wàn)個(gè)花粉細(xì)胞緊密聚集而形成(圖2C)，花粉粒類(lèi)球形(圖2D)，直徑約200 μm。

圖2 多花指甲蘭花粉電鏡掃描Figure 2 Floral syndrome of A.rosea

2.2 開(kāi)花進(jìn)程

溫室內(nèi)，多花指甲蘭在5 月底零星開(kāi)放，群體花期為5—7 月，單花花期7～10 d，單株花期15 d?？偁罨ㄐ颍ㄐ虻幕ǘ鋸南轮辽祥_(kāi)放，花序上第1 朵花開(kāi)放至整個(gè)花序的花全部開(kāi)放約需10 d。按DAFNI[14]的標(biāo)準(zhǔn)將多花指甲蘭的發(fā)育分為7 個(gè)階段(圖3)。①花蕾Ⅰ期(開(kāi)花前4～5 d)?；ɡ傥撮_(kāi)放，呈不規(guī)則橢圓形，中萼片和唇瓣緊閉，可見(jiàn)距。②花蕾Ⅱ期(開(kāi)花前1～3 d)?；ɡ匍_(kāi)始開(kāi)放，中萼片和唇瓣開(kāi)始分離，有紫色的花瓣露出。③初花Ⅰ期(開(kāi)花1～2 d)。花蕾開(kāi)始開(kāi)放，唇瓣與花瓣分離，橫徑距離1.5 cm，柱頭有黏液分泌。④初花Ⅱ期(開(kāi)花3～4 d)?；ɡ俅蟛糠珠_(kāi)放，萼片微微卷曲，唇瓣向下豎起，花瓣和唇瓣縱徑距離大于3.0 cm，能明顯看到合蕊柱，柱頭黏液量分泌達(dá)到最高。⑤盛花期(開(kāi)花5～6 d)?；ǘ渫耆_(kāi)放，花瓣完全打開(kāi)，花粉團(tuán)由鵝黃變成深黃。⑥末花期(開(kāi)花7～8 d)?；ǘ淇菸?，萼片卷曲，唇瓣凹陷，萼片和唇瓣的顏色變褐色。⑦凋謝期(開(kāi)花9～10 d)。花朵完全失去水分，整體呈現(xiàn)褐色，花粉團(tuán)變硬，花朵枯萎。

圖3 不同發(fā)育階段的多花指甲蘭Figure 3 Different development stages of A.rosea

2.3 花粉活力與柱頭可授性

由圖4 可知：相對(duì)于醋酸洋紅染色法，TTC 染色法可明顯區(qū)分有活性花粉，且TTC 染色法所測(cè)得的結(jié)果略高于醋酸洋紅染液測(cè)定的活力，花粉離體萌發(fā)法不能準(zhǔn)確測(cè)定多花指甲蘭花粉活力，其花粉管雜亂無(wú)章不易查數(shù)。因此選用TTC 染色法測(cè)定多花指甲蘭各時(shí)期花粉活力，由表2 可以看出在盛花期花粉活力最高，可達(dá)74.57%，其次為初花Ⅱ期。

表2 花粉活力與柱頭可授性檢測(cè)Table 2 Test of pollen viability and stigma acceptability

圖4 不同方法測(cè)定花粉活力Figure 4 Pollen viability determined by different methods

在對(duì)柱頭可授性進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)(圖5)：在初花Ⅱ期和盛花期時(shí)柱頭周?chē)写罅康臍馀莓a(chǎn)生，說(shuō)明此階段的可授性最強(qiáng)。故對(duì)多花指甲蘭進(jìn)行人工授粉時(shí)，應(yīng)選擇初花Ⅱ期或盛花期，盛花期授粉效率最高。授粉時(shí)，先將花粉用鑷子取出，此時(shí)花粉團(tuán)具有很強(qiáng)的黏性，易黏在柱頭腔內(nèi)，授粉成功后，通常在1 周后即可看到子房開(kāi)始膨大。

圖5 不同時(shí)期柱頭可授性Figure 5 Stigma accessibility test

2.4 花粉組織學(xué)

經(jīng)碘-碘化鉀對(duì)多花指甲蘭的花粉進(jìn)行染色后，在顯微鏡下可看到花粉會(huì)被染成紅色(圖6)，表明多花指甲蘭花粉中淀粉較少，脂質(zhì)較多。以往研究表明[17]：蘭科植物的花粉含有脂類(lèi)，一般以花蜜和油類(lèi)較多[18]，而淀粉并不是經(jīng)常存在，這與系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)。有推斷，脂質(zhì)花粉營(yíng)養(yǎng)豐富，更容易吸引昆蟲(chóng)進(jìn)行傳粉，而淀粉花粉有利于風(fēng)媒傳粉。

圖6 碘-碘化鉀花粉組織染色Figure 6 Staining of iodide-potassium iodide pollen tissue

2.5 雜交指數(shù)(OCI)

多花指甲蘭花朵直徑為2.5～3.6 cm，大于6 mm，分值為3；花粉成熟時(shí)聚成典型花粉團(tuán)位于柱頭上方，兩者存在一定距離，無(wú)法接觸，且花粉與柱頭腔間的蕊喙發(fā)育，阻止自交授粉發(fā)生，分值為1；花粉和柱頭同步成熟，分值為0。多花指甲蘭的OCI 為4，其繁育系統(tǒng)以異交為主，部分自交親和，需要傳粉者。

2.6 人工控制授粉

成功授粉后的花朵，5 d 后可見(jiàn)柱頭微微膨大，花瓣、唇瓣與萼片開(kāi)始枯萎脫落；10 d 左右子房膨大。授粉未成功的花朵在開(kāi)花7 d 左右花瓣開(kāi)始枯黃，萎縮，約10 d 后連同子房一起脫落。授粉成功的花朵比未授粉的花朵先枯萎。授粉30 d 后統(tǒng)計(jì)果莢結(jié)實(shí)情況(表3)可知：多花指甲蘭無(wú)論是否去雄、套袋，不進(jìn)行人工授粉的結(jié)實(shí)率均為0，而人工自花授粉、人工同株異花授粉、人工異株授粉的結(jié)實(shí)率分別為85.71%、88.00%、84.00%，無(wú)顯著差異。這表明多花指甲蘭需要借助傳粉媒介進(jìn)行傳粉，不存在自然自花授粉和無(wú)融合生殖現(xiàn)象。

表3 不同處理下結(jié)實(shí)率Table 3 Percentage of fertile fruit in different pollination treatments

3 討論

多花指甲蘭有2 枚側(cè)萼片、1 枚中萼片、2 枚花瓣和1 枚唇瓣，具有較高的觀賞價(jià)值，是蝴蝶蘭屬不可多得的香花遠(yuǎn)緣雜交親本。多花指甲蘭的花期在5—7 月，總狀花序，開(kāi)花時(shí)有香味，花自下而上循序開(kāi)放，但時(shí)間差別不大。單株有1～4 個(gè)花梗，數(shù)十朵花。單朵花自然狀態(tài)下花期為7～10 d，整株花期約15 d。而王清蕓等[5]對(duì)種植于云南省的多花指甲蘭觀察，發(fā)現(xiàn)其整株花期僅有10 d，說(shuō)明溫室栽培條件相比于露地條件，更適合多花指甲蘭生長(zhǎng)，可延長(zhǎng)其花期。

花粉活力是決定授粉成功與否的關(guān)鍵，花粉活力的高低及柱頭可授性的強(qiáng)弱與花朵開(kāi)放時(shí)間有關(guān)。多花指甲蘭的花粉為四分體結(jié)構(gòu)，花粉進(jìn)行離體萌發(fā)培養(yǎng)時(shí)，花粉團(tuán)在培養(yǎng)液中自然散開(kāi)，四合花粉粒均保持完整的膜結(jié)構(gòu)，能夠萌發(fā)，但經(jīng)過(guò)物理碾壓，花粉粒的膜結(jié)構(gòu)易遭到破壞，對(duì)花粉粒的萌發(fā)造成一定的影響，從而加大記數(shù)時(shí)的誤差，所以當(dāng)嘗試用花粉萌發(fā)法測(cè)定花粉活性，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果活性偏低，因此本研究并未采用花粉離體萌發(fā)法測(cè)定數(shù)據(jù)。本研究也比較了TTC 和醋酸洋紅2 種染色液對(duì)多花指甲蘭有活力花粉的染色狀況。結(jié)果表明：2 種染色液測(cè)定的花粉活力均隨著花朵開(kāi)放時(shí)間延長(zhǎng)，呈先上升后下降的趨勢(shì)，與其他蘭花結(jié)果一致[12,19]。但是TTC 所測(cè)花粉活力略高于醋酸洋紅，可見(jiàn)在溫室條件下栽培的多花指甲蘭更適合用TTC 染色法測(cè)定花粉活力。采用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法是檢測(cè)柱頭可授性較為簡(jiǎn)單常用的方法[20-22]，多花指甲蘭同樣適用此方法。開(kāi)花時(shí)間的長(zhǎng)短影響著柱頭可授性的強(qiáng)弱，多花指甲蘭在初花Ⅱ期和盛花期可授性達(dá)到最高強(qiáng)度，之后又逐步降低。多花指甲蘭花粉與柱頭同熟，在初花Ⅱ期和盛花期花粉活力與柱頭的可授性都較強(qiáng)，因此，此時(shí)期開(kāi)展授粉工作成功率最高。

植物的繁育系統(tǒng)是判斷其種群能否延續(xù)的重要體系標(biāo)準(zhǔn)，通常是指對(duì)直接影響后代遺傳組成的所有有性特征進(jìn)行研究，人工授粉是最基本的研究方法。在對(duì)多花指甲蘭進(jìn)行人工控制授粉試驗(yàn)中，不去雄且不套袋、不去雄且套袋以及去雄不授粉的結(jié)實(shí)率均為0，但是人工自花授粉、人工同株異花授粉及人工異株授粉后，都有80%以上結(jié)實(shí)率。這些結(jié)果皆表明多花指甲蘭有高度的自交和異交的能力。根據(jù)DANFI[14]的標(biāo)準(zhǔn)所得出的雜交指數(shù)也表明：多花指甲蘭為自交和異交的混合交配模式，需要特定的傳粉者。根據(jù)花粉組織化學(xué)染色結(jié)果表明：多花指甲蘭花粉脂質(zhì)含量較多，初步判斷為蟲(chóng)媒傳粉，但仍需后期野外驗(yàn)證。基于多花指甲蘭繁育系統(tǒng)研究的結(jié)果，本研究在初花Ⅱ期和盛花期進(jìn)行人工授粉，已經(jīng)獲得大量種苗。今后將在自然條件下對(duì)其進(jìn)行人工授粉，提高繁殖效率，從而最大限度地保護(hù)多花指甲蘭的種質(zhì)資源。

4 結(jié)論

多花指甲蘭為總狀花序，單花花期7～10 d，群體花期為5 月初至7 月底，開(kāi)放時(shí)有香味。雌雄同株，且同步成熟，在盛花期(開(kāi)花5～6 d)花粉活力與柱頭可授性均達(dá)到最強(qiáng)，花粉活力高達(dá)74.57%。多花指甲蘭花粉為近圓形四合花粉，主要由脂質(zhì)組成。OCI 為4，多花指甲蘭不存在無(wú)融合生殖現(xiàn)象，繁育系統(tǒng)是需要傳粉者傳粉的自交和異交混合交配模式。