?？≥x，李 琦，毛福超，錢 滿，賈艷艷，丁 軻，張春杰，程相朝，廖成水

（1.河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 功能微生物與畜禽健康實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽 471023；2.河南科技大學(xué) 洛陽市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽 471023；3.河南科技大學(xué) 動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽 471023）

單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌Listeriamonocytogenes是一種重要食源性人畜共患致病菌[1]，侵入機(jī)體后可穿過腸道屏障，經(jīng)淋巴和血液循環(huán)進(jìn)入肝臟和脾臟，隨后到達(dá)大腦和胎盤[2]，引起敗血癥、腦膜炎以及早產(chǎn)或流產(chǎn)等癥狀[3]。單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌廣泛存在于牛奶、蔬菜和動(dòng)物性食品等供應(yīng)鏈中，由其引發(fā)的食物中毒病例逐年增多，雖然人類感染單核細(xì)胞增生李斯特氏菌發(fā)病率相對較低，但一旦感染死亡率可達(dá)30%～70%，占食源性病原菌感染死亡的半數(shù)以上[4]。單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌分泌的胞外蛋白在細(xì)菌感染宿主中發(fā)揮著重要作用。細(xì)菌存在多種分泌系統(tǒng)將效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，其中雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(twinagininetranslocation，Tat)是運(yùn)輸完全折疊蛋白質(zhì)的一種分泌系統(tǒng)[5]。

雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)D (twinagininetranslocation D，TatD)是一種高度保守蛋白，廣泛存在于微生物中，可作為一種重要的毒力因子參與修復(fù)DNA、降解胞外誘捕網(wǎng)和誘發(fā)細(xì)胞程序性凋亡[6]。伊氏錐蟲Trypanosomaevansi和路氏錐蟲Trypanosomalewisi可分泌TatD 蛋白，降解巨噬細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)以對抗宿主的固有免疫反應(yīng)[7]。毛福超[8]研究發(fā)現(xiàn)：單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌TatD 重組蛋白具有核酸酶活性，同時(shí)通過重組自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)的等位基因交換技術(shù)獲得了tatD基因缺失菌株(LM10403sΔtatD)，但關(guān)于單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌tatD基因?qū)?dòng)物的毒力和腸道菌群影響仍不清楚。因此，本研究以小鼠Musmusculus為試驗(yàn)動(dòng)物，將LM10403sΔtatD口服感染小鼠，觀察tatD基因缺失后的單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌對小鼠毒力和腸道菌群多樣性的影響，為進(jìn)一步探究tatD基因在單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌與宿主互作中的具體作用以及減毒疫苗研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌親本菌株(LM10403s)、缺失菌株(LM10403sΔtatD)和互補(bǔ)菌株(LM10403sCΔtatD)存于洛陽市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，6 周齡雌鼠購自鄭州中原動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。瓊脂購自生工生物工程(上海)股份有限公司?？敲顾刭徸越鹂寺?北京)生物技術(shù)有限公司。腦心膜浸出液(BHI)肉湯購自青島海博生物技術(shù)有限公司。糞便基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；TksGflex DNA Polymerase 購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；DNA 凝膠快速純化試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 菌株的復(fù)蘇與培養(yǎng)

將單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌LM10403s 和LM10403sΔtatD接種于BHI 固體培養(yǎng)基上復(fù)蘇，將LM10403sCΔtatD接種于含卡那霉素的BHI 固體培養(yǎng)基上復(fù)蘇，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h。挑取LM10403s 和LM10403sΔtatD單個(gè)菌落接種于BHI 肉湯中，挑取LM10403sCΔtatD單個(gè)菌落接種于含卡那霉素的BHI 肉湯中，37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)備用。

1.3 菌株對小鼠的毒力測定

用無菌生理鹽水將新鮮培養(yǎng)的LM10403s、LM10403sΔtatD和LM10403sCΔtatD洗滌后進(jìn)行連續(xù)10 倍稀釋，選取5 個(gè)稀釋度的細(xì)菌分別給予小鼠口服灌胃，每個(gè)稀釋度10 只小鼠，每只100 μL，灌胃前12 h 禁食禁水，接種2 h 后正常飼喂。以給予生理鹽水的小鼠作為對照，持續(xù)觀察各處理組小鼠癥狀直至無小鼠死亡。將死亡小鼠的肝臟無菌接種到BHI 固體培養(yǎng)基上，用單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增鑒定。采用Bliss 法得到菌株對小鼠的半數(shù)致死量(LD50)。

1.4 缺失菌株的免疫保護(hù)率測定

用無菌生理鹽水將新鮮培養(yǎng)的LM10403sΔtatD洗滌后調(diào)整細(xì)菌濃度，以1.00×105CFU 的劑量給予小鼠口服灌胃，灌胃前12 h 禁食禁水，接種2 h 后正常飼喂。于首次免疫7 d 后按相同劑量進(jìn)行第2 次免疫，第2 次免疫7 d 后以給予1.00×1010CFU 的劑量對小鼠進(jìn)行親本菌株的攻毒。隨后持續(xù)觀察直至連續(xù)7 d 無小鼠死亡，記錄各處理組小鼠癥狀及死亡情況。以未免疫強(qiáng)毒攻毒組和健康組為對照評價(jià)tatD基因缺失菌株的免疫保護(hù)效果。

1.5 菌株對小鼠腸道菌群的影響

1.5.1 動(dòng)物分組與處理 將40 只6 周齡昆明雌鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機(jī)平分為磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、LM10403s、LM10403sΔtatD和LM10403sCΔtatD處理組。分別灌胃200 μL 含1.00×106CFU 的菌液，對照組小鼠灌胃200 μL 無菌PBS，灌胃前12 h 斷食，并口服體積分?jǐn)?shù)為10%的Na2HCO3中和胃酸。灌胃24 h 后采用頸椎脫臼剖殺小鼠，立即收集腸道內(nèi)容物。

1.5.2 小鼠腸道微生物基因組DNA 提取與高通量測序 利用糞便基因組試劑盒提取基因組DNA，采用質(zhì)量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000 測定DNA 濃度。以基因組DNA 為模板，針對細(xì)菌V3～V4 作為目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。引物：343F (5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′)和798R (5′-AGGGT ATCTAATCCT-3′)。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，磁珠法純化PCR 產(chǎn)物。送往上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司利用Illumina Hiseq 2500 (PE250)系統(tǒng)進(jìn)行高通量測序。

1.5.3 生物信息學(xué)分析 高通量測序得到的4 組小鼠原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識(shí)別，分析轉(zhuǎn)化為原始雙端序列。利用Trimmomatic (v 0.35)、FLASH (v 1.2.11)、split_libraries (v 1.8.0)和UCHIME (v 2.4.2)等軟件對原始序列進(jìn)行質(zhì)控，得到優(yōu)質(zhì)序列。使用Vsearch (v 2.4.2)軟件按照97%的相似度進(jìn)行操作分類單元(OTU)分類[9]，并進(jìn)行Alpha 和Beta 多樣性分析以及菌群構(gòu)成分析。比較4 個(gè)處理組小鼠腸道菌群在門和屬水平的分布差異。采用PICRUSt 軟件結(jié)合京都基因及基因組百科全書(KEGG)分析各組小鼠腸道菌群信號(hào)通路富集情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism (v 8.0.1)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 缺失菌株對小鼠毒力的影響

從表1 可見：小鼠經(jīng)口服接種不同稀釋含量的LM10403s、LM10403sΔtatD和LM10403sCΔtatD后，各組均有小鼠死亡，而無菌生理鹽水對照組的小鼠均未發(fā)生死亡。PCR 擴(kuò)增鑒定死亡小鼠肝臟分離的細(xì)菌為單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌。通過Bliss 法計(jì)算得到LM10403sΔtatD口服感染小鼠的LD50為8.11×107CFU，LM10403s 的LD50為1.23×107CFU，LM10403sCΔtatD的LD50為1.94×107CFU。表明單核細(xì)胞增生李斯特氏菌敲除tatD基因后毒力下降。

表1 不同菌株的毒力測定Table 1 Strain virulence determination of bacterial strain

2.2 LM10403sΔtatD 的免疫保護(hù)率

LM10403sΔtatD經(jīng)灌胃第2 次免疫7 d 后，將LM10403s 調(diào)整為1.00×1010CFU 對小鼠進(jìn)行攻毒。結(jié)果顯示：未免疫的LM10403s 攻毒組小鼠于攻毒后全部死亡，無菌生理鹽水對照組小鼠未發(fā)生死亡。而免疫LM10403sΔtatD的接種組共2 只小鼠死亡，死亡時(shí)間分別為攻毒感染后的第6 天和第9 天，其余存活小鼠的精神狀態(tài)良好，免疫保護(hù)率為80%。表明單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌tatD基因缺失菌株能夠?qū)τH本菌株感染小鼠產(chǎn)生較好的免疫效果。

2.3 tatD 基因缺失對單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌感染小鼠腸道微生物OTU 分布的影響

對質(zhì)控得到的優(yōu)質(zhì)序列，按照97%的相似度進(jìn)行OTU 分類，采用維恩圖對4 個(gè)處理組OTU 分布情況進(jìn)行分析。PBS、LM10403s、LM10403sΔtatD和LM10403sCΔtatD4 個(gè)處理獨(dú)有的OTU 分別為1 703、755、1 057 和597 個(gè)，4 組共有1 781 個(gè)OTU。腸道菌群多樣性由高到低依次為PBS、LM10403-sΔtatD、LM10403s、LM10403sCΔtatD處理組(圖1)。表明tatD基因缺失后使得單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌感染小鼠后腸道菌群多樣性增加。

圖1 tatD 基因缺失對單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌感染小鼠腸道微生物的OTUs 維恩圖Figure 1 OTUs venn diagram of tatD gene deletion on intestinal microorganisms of L.monocytogenes infected mice

2.4 tatD 基因缺失對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌感染小鼠腸道微生物Alpha 多樣性的影響

從圖2 可見：4 個(gè)處理樣品的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)差異不顯著。Chao1 和Observed species指數(shù)顯示：PBS 與LM10403sΔtatD處理組差異不顯著，但LM10403s 和LM10403sCΔtatD處理組相比于PBS 處理組顯著下降(P＜0.05)。表明各處理小鼠腸道菌群物種均勻度相差不大，但親本菌株感染小鼠時(shí)腸道菌群豐富度顯著降低。

圖2 tatD 基因缺失對單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌感染小鼠的Alpha 多樣性分析Figure 2 Alpha diversity index analysis of L.monocytogenes infected mice by deletion of the tatD gene

2.5 tatD 基因缺失對單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌感染小鼠腸道微生物Beta 多樣性的影響

Beta 多樣性包括多種分析方法，其中非度量多維尺度分析(NMDS)能更好地反映生態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的非線性結(jié)構(gòu)，相同顏色為相同分組，同一組的樣本距離越近，并與其他組有明顯距離，說明分組效果好。圖3顯示：PBS 與各處理組樣本距離較遠(yuǎn)，LM10403sΔtatD與LM10403s、LM10403sCΔtatD處理組距離相對遠(yuǎn)，LM10403s 和LM10403sCΔtatD處理組樣本的聚集相近。表明LM10403sΔtatD與LM10403s、LM-10403sCΔtatD處理組群落存在差異，但差異不大。

圖3 tatD 基因缺失對單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌感染小鼠的Beta 多樣性分析Figure 3 Beta diversity index analysis of L.monocytogenes infected mice by deletion of the tatD gene

2.6 單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌tatD 缺失對小鼠腸道門水平微生物種群分布的影響

在門水平上，使用平均豐度前50 位的門豐度數(shù)據(jù)繪制熱圖。結(jié)果顯示：優(yōu)勢菌門為厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、梭桿菌門Fusobacteria 和擬桿菌門Bacteroidetes。LM10403sΔtatD處理組的厚壁菌門豐度明顯高于LM10403s 和LM10403sCΔtatD處理組，擬桿菌門明顯低于LM10403s 和LM10403-sCΔtatD處理組(圖4)。表明單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌tatD基因缺失后，厚壁菌門明顯增加，且與PBS 處理組結(jié)果相似。

圖4 單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌tatD 缺失株感染小鼠腸道門水平微生物種群的熱圖分析Figure 4 Heatmap graph of gut microbiota in mice after tatD mutant of L.monocytogenes infection at the phylum level

2.7 單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌tatD 缺失對小鼠腸道屬水平微生物種群分布的影響

在屬水平上，LM10403s、LM10403sΔtatD和LM10403sCΔtatD處理組要由乳桿菌屬Lactobacillus、擬桿菌屬Bacteroides和腸桿菌屬Enterorhabdus組成。LM10403sΔtatD處理組的乳桿菌屬相對豐度明顯高于LM10403s 和LM10403sCΔtatD處理組(圖5)。表明tatD基因缺失使單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌感染的小鼠腸道菌群中乳桿菌屬增加。

2.8 單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌tatD 對小鼠腸道微生物KEGG 的功能預(yù)測

為進(jìn)一步分析tatD基因缺失后小鼠腸道菌群改變引起的信號(hào)通路富集的差異，采用PICRUSt 軟件結(jié)合KEGG，分析4 組小鼠在遺傳信息處理、生物體系統(tǒng)、新陳代謝、疾病、細(xì)胞過程和環(huán)境信息處理信號(hào)通路富集的差異。結(jié)果顯示：LM10403sΔtatD和PBS 處理組6 類生物代謝通路相關(guān)性較低，而LM10403s 處理組具有較高的相關(guān)性(圖6)。表明tatD基因缺失可能在單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌感染小鼠腸道時(shí)，影響其細(xì)胞過程、新陳代謝等方面。

圖6 單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌tatD 缺失株感染小鼠腸道微生物KEGG 通路差異Figure 6 Differences of KEGG pathway in gut microbial in mice after tatD mutant of L.monocytogenes infection

3 討論與結(jié)論

李斯特菌是一種強(qiáng)侵襲性胞內(nèi)菌，可穿透腸道、血腦和胎盤屏障。自單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌基因組公布后，大量毒力相關(guān)基因已被發(fā)掘，并已深入探討其在單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌致病性方面的作用[10]。作為重要的效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，Tat 系統(tǒng)在單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌穿越宿主腸道屏障過程發(fā)揮何種作用仍不清楚。因此，在本研究前期獲得單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌缺失菌株LM10403sΔtatD的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究其口服感染小鼠的毒力，同時(shí)采用高通量測序的方法觀察其對小鼠腸道菌群的影響。

毒力是微生物對宿主造成損害的相對能力，更是微生物得以在宿主體內(nèi)傳播的主要因素之一[11]。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌感染過程中，包括Tat 分泌系統(tǒng)在內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)調(diào)控釋放大量效應(yīng)蛋白[12]。ZHANG 等[13]將化膿隱秘桿菌Trueperellapyogenes菌株tatD基因敲除后，缺失菌株在小鼠脾臟的細(xì)菌載量以及毒力明顯較低。本研究也觀察到了單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌tatD基因缺失后，口服感染小鼠的LD50由1.23×107CFU 降為8.11×107CFU。JHELUM 等[14]也發(fā)現(xiàn)：tatD基因缺失的肺炎鏈球菌Streptococcuspneumoniae在肺、血液和脾臟中負(fù)荷的細(xì)菌較少，并且對肺臟的病理損傷也較小，證實(shí)了tatD基因缺失后肺炎球菌毒性降低。NrfC 和NapG 蛋白屬于鐵硫蛋白，鐵硫蛋白家族中的其他成員在促進(jìn)細(xì)菌代謝中發(fā)揮了重要的作用，并能促進(jìn)細(xì)菌在更嚴(yán)酷的環(huán)境中得以生存[15-16]，這2 個(gè)蛋白在野生型菌株中迅速降解，但MATOS 等[16]將大腸埃希菌EscherichiacoliMC4100 菌株的tatD基因敲除后，發(fā)現(xiàn)NrfC 和NapG 蛋白在tatD基因缺失菌株中高度穩(wěn)定。因此，這也有助于理解tatD基因缺失后，單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌的毒力下降不大，但這種現(xiàn)象還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

尹詩恒等[17]為探究松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus侵染下，松干、松針與根系部位內(nèi)生細(xì)菌菌群的影響，選用高通量測序方法來進(jìn)行研究。本研究同樣采用高通量測序的方法探究單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌tatD基因缺失對小鼠腸道菌群的影響。腸道菌群測序顯示：各處理組小鼠腸道菌群的物種均勻度相差不大，但親本菌株感染小鼠時(shí)腸道菌群的豐富度顯著降低。動(dòng)物腸道中的細(xì)菌門主要有厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門[18]。厚壁菌門是腸道菌群中的一個(gè)優(yōu)勢菌門，且其中包含許多有益菌，例如：芽孢桿菌屬Bacillus、腸球菌屬Enterococcus、乳桿菌屬和乳球菌屬Lactococcus等[19]。在門水平上，LM10403sΔtatD處理組的厚壁菌門豐度明顯高于LM10403s 和LM10403sCΔtatD處理組。乳酸菌是公認(rèn)的安全食品級(jí)微生物，在食物發(fā)酵和益生菌的應(yīng)用中發(fā)揮著重要作用[20]。服用乳酸菌制劑的人群與其他人群相比，具有腸道屏障功能增強(qiáng)、腸道菌群平衡、炎癥消散加快和免疫力增強(qiáng)等特征[21]，表明乳酸菌具有治療腸道功能紊亂、維持腸道菌群平衡和抵御腸道致病菌等多種作用。在門水平上，LM10403sΔtatD組與PBS 處理組的厚壁菌門差異不大。但厚壁菌門包含許多菌屬，進(jìn)一步屬水平分析單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌tatD基因缺失感染對小鼠腸道菌群的影響。LM10403sΔtatD處理乳桿菌屬相對豐度為20%，顯著高于LM10403s 和LM10403sCΔtatD處理組。因此，tatD基因缺失使單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌感染的小鼠腸道菌群中有益菌增加。KEGG 功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)：LM10403sΔtatD和PBS 處理組與6 類生物代謝通路相關(guān)性較低，而LM10403s 處理組與6 類生物代謝通路相關(guān)性較高。因此，tatD基因可能直接或間接參與細(xì)胞過程和環(huán)境信息處理等信號(hào)通路。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌tatD缺失菌株感染小鼠毒力較親本菌株明顯下降，并且有較好的免疫保護(hù)效力。單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌tatD基因缺失感染小鼠后，腸道菌群多樣性高于親本菌株，且有益菌增加。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)tatD基因可能直接或間接參與細(xì)胞過程和環(huán)境信息處理等信號(hào)通路。