岑夢姣 翁鵬程

哮喘是一種高發(fā)病率的慢性病，主要癥狀為氣喘、胸悶等。預(yù)計到2025 年，哮喘患者將達(dá)到4 億人[1]。氣道重塑是慢性哮喘最典型的病變，其特征是上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[2]。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是上皮纖維化的主要介質(zhì)，在哮喘性支氣管組織中上調(diào)，并引發(fā)哮喘氣道上皮損傷和EMT 誘導(dǎo)的氣道纖維化[3]。而TNF-α 的存在會破壞抗炎平衡并加重哮喘進(jìn)展[4]。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 在過敏性哮喘中被持續(xù)激活，抑制NF-κB 可顯著緩解卵清蛋白誘導(dǎo)的哮喘[5]。目前已有許多研究將NF-κB 通路作為哮喘氣道性炎癥的關(guān)鍵治療靶點，如鄭巖等[6]發(fā)現(xiàn)溴結(jié)構(gòu)域蛋白4 可介導(dǎo)NF-κB/RelA 通路調(diào)控EMT 參與哮喘氣道重塑。另外，Huang 等[7]通過氣道平滑肌細(xì)胞證明TGF-β 能夠激活NF-κB p65（p65）及其磷酸化水平，并促進(jìn)細(xì)胞遷移及EMT。根據(jù)以上研究結(jié)果，推測NFκB 在哮喘疾病氣道重塑過程中可能起到關(guān)鍵作用。

雷酚內(nèi)酯是從雷公藤中分離得到的二萜類成分，具有較強(qiáng)的免疫抑制活性。已有研究報道雷酚內(nèi)酯能夠緩解大鼠腎間質(zhì)纖維化并抑制炎癥因子的釋放[8]。這與哮喘疾病的治療機(jī)制不謀而合。因此，本研究利用TGF-β 及TNF-α 聯(lián)合誘導(dǎo)人支氣管肺上皮細(xì)胞氣道重塑模型，觀察雷酚內(nèi)酯的治療效果，同時探討雷酚內(nèi)酯對NF-κB 通路及EMT 的調(diào)控作用，為治療哮喘早期的氣道重塑提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器 人支氣管肺上皮細(xì)胞系Beas-2b 購自浙江如耀生物科技有限公司。10% FBS（批號：10099-141）、DMEM 培養(yǎng)基（批號：12491015）均購自美國Gibco 公司；雷酚內(nèi)酯（5 mg 粉劑裝，Cas 號：74285-86-2，純度：98%，溶解于二甲基亞砜）、TGF-β1試劑盒（批號：H980365）均購自上海麥克林試劑有限公司；TNF-α 試劑盒（批號：SEKH-0047）購自北京索萊寶有限公司；1st Strand cDNA Synthesis Kit gDNA Purge 試劑盒（批號：E042）、SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒（批號：E096）均購自蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒8（cell counting kit-8，CCK-8）（批號：CK04）購自日本Dojindo 公司；兔抗人α-平滑肌肌動蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）（批號：ab124964）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin，批號：ab40772）、波形蛋白（Vimentin，批號：ab92547）、p65（批號：ab32536）、磷酸化p65（phosphorylated- p65，p-p65）（批號：ab76302）、Twist 家族BHLH 轉(zhuǎn)錄因子1（twist family BHLH transcription factor 1，TWIST1）（批號：ab50581）、鋅指E-Box 綁定同源盒1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）（批號：ab203829）、Snail 家族鋅指1（snail family zinc finger 1，SNAI1）（批號：ab180714）、山羊抗兔IgG-HRP 二抗（批號：ab6721）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（批號：ab181602）抗體均購自美國Abcam 生物公司；化學(xué)發(fā)光底物試劑盒（批號：SB-WB001）購自上海圣爾生物；倒置熒光顯微鏡（型號：CKX53）購自日本Olympus 公司；相差顯微鏡（型號：DMIL LED）和熒光正置顯微鏡（型號：DM500）均購自德國Leica 公司；實時熒光定量PCR 儀（型號：7500F）購自美國ABI公司；多功能酶標(biāo)儀（型號：Varioskan LUX）購自美國Thermo 公司；蛋白成像儀（型號：ChemiDoc-It Imaging System）購自美國UVP 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 Beas-2b 細(xì)胞接種于含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別用10 ng/mL TGF-β1和10 ng/mL TNF-α處理Beas-2b 細(xì)胞進(jìn)行模型誘導(dǎo)[9]。

1.3 細(xì)胞活性檢測 采用CCK-8 法。將Beas-2b 細(xì)胞以3 000 細(xì)胞/孔的密度接種到96 孔板中，貼壁24 h后，分別給予終濃度為0、0.5、1、10、20、30、40 μmol/L的雷酚內(nèi)酯處理細(xì)胞，每個濃度5 個復(fù)孔。48 h 后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃避光孵育2 h。使用多功能酶標(biāo)儀測定450 nm 波長處的吸光度（optical density，OD）值。細(xì)胞活性（%）=（OD加藥-OD空白）/（OD零加藥-OD空白）×100%。根據(jù)雷酚內(nèi)酯對Beas-2b 的活性影響，選擇1 和10 μmol/L 雷酚內(nèi)酯作為后續(xù)細(xì)胞實驗的藥物處理濃度。

1.4 細(xì)胞分組 將Beas-2b 細(xì)胞分為對照組、模型組、1 μmol/L 雷酚內(nèi)酯組和10 μmol/L 雷酚內(nèi)酯組4 組。對照組：Beas-2b 細(xì)胞不作任何處理；模型組：Beas-2b 細(xì)胞給予10 ng/mL TGF-β1 聯(lián)合10 ng/mL TNF-α 處理48 h；1 和10 μmol/L 雷酚內(nèi)酯組：Beas-2b 細(xì)胞在模型組基礎(chǔ)上，再分別添加終濃度為1、10 μmol/L 雷酚內(nèi)酯共孵育48 h，然后使用相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.5 細(xì)胞遷移能力檢測 采用細(xì)胞劃痕實驗。將Beas-2b細(xì)胞以1×106個接種在6 cm 培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長滿后，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中按照直線采用200 μL的槍頭進(jìn)行細(xì)胞劃痕，槍頭經(jīng)過的部位細(xì)胞被去除，按照上述實驗分組進(jìn)行細(xì)胞處理。在培養(yǎng)皿蓋上標(biāo)記3 個點，并在0 和48 h后通過相差顯微鏡觀察標(biāo)記部位細(xì)胞遷移距離。

1.6 EMT 相關(guān)蛋白α-SMA、E-cadherin、Vimentin 熒光強(qiáng)度檢測 采用免疫熒光實驗。將Beas-2b 細(xì)胞接種到6 孔板中，完全貼壁后按照實驗分組進(jìn)行處理。用4%多聚甲醛在室溫下固定細(xì)胞15 min。然后，將細(xì)胞在0.5% Triton X-100 中孵育10 min。再用1% BSA 封閉30 min。然后使用兔抗人α-SMA、E-cadherin 及Vimentin抗體在4 ℃下孵育過夜。第2天將細(xì)胞與FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗在黑暗中孵育1 h，再使用0.1 μg/mL DAPI 孵育細(xì)胞10 min。在熒光顯微鏡下拍攝細(xì)胞熒光圖，曝光時長控制在35 ms。通過Image Pro Plus 6.0 軟件對細(xì)胞熒光圖熒光強(qiáng)度進(jìn)行量化統(tǒng)計。

1.7 EMT相關(guān)基因α-SMA、E-cadherin、Vimentin mRNA表達(dá)水平檢測 采用RT-PCR 法。通過Trizol 法提取細(xì)胞總RNA 后，使用1st Strand cDNA Synthesis Kit gDNA Purge 試劑盒將2 μg mRNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-PCR 采用SYBR qPCR SuperMix Plus 試劑盒構(gòu)建體系，并在實時熒光定量PCR 儀運行程序，反應(yīng)條件如下：95 ℃變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，共40 個循環(huán)；72 ℃延伸30 s。以GAPDH 為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。擴(kuò)增引物通過NCBI 在線網(wǎng)站設(shè)計，引物序列見表1。

表1 RT-PCR 引物序列（5'-3'）

1.8 EMT 相關(guān)蛋白α-SMA、E-cadherin、Vimentin 及EMT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子p65、p-p65、TWIST1、ZEB1、SNAI1蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot 法。收集細(xì)胞用PBS 洗滌3 次，然后用含有1%蛋白酶抑制劑混合物的100 μL RIPA 裂解液在冰上裂解30 min。13 000 r/min離心20 min 后，收集上清液，用BCA 檢測試劑盒檢測每個樣品的蛋白質(zhì)濃度。5 μg 變性蛋白質(zhì)在SDSPAGE 凝膠中電泳，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h 后，將膜與一抗α-SMA、E-cadherin、Vimentin、p65、p-p65、TWIST1、ZEB1、SNAI1 及GAPDH 抗體在4 ℃孵育過夜。用TBST 清洗3 次后再與山羊抗兔IgG-HRP 二抗在室溫下孵育1 h。再用TBST 清洗3 次后，使用化學(xué)發(fā)光底物試劑盒和蛋白成像儀對蛋白條帶進(jìn)行顯影和曝光拍攝。使用Image J 軟件計算各個條帶的光密度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件。所有實驗均重復(fù)3 次。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，方差齊時，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey 檢驗；方差不齊時，組間比較采用Welch 方差分析，兩兩比較采用t'檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷酚內(nèi)酯對細(xì)胞活性的影響 與0 μmol/L 雷酚內(nèi)酯組比較，1 和10 μmol/L 雷酚內(nèi)酯處理后，細(xì)胞活性均提高（均P＜0.05），而20 μmol/L 以上濃度雷酚內(nèi)酯處理后，細(xì)胞活性呈現(xiàn)下降趨勢，且在30 和40 μmol/L時候細(xì)胞活性明顯抑制（均P＜0.05），見表2。因此，使用1和10 μmol/L雷酚內(nèi)酯作為后續(xù)實驗主要濃度。

表2 不同濃度雷酚內(nèi)酯對Beas-2b 細(xì)胞活性的影響（%）

2.2 雷酚內(nèi)酯對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 在相差顯微鏡觀察下，對照組細(xì)胞呈典型的上皮樣細(xì)胞形態(tài)，而其他3 組細(xì)胞呈長梭形間充質(zhì)樣細(xì)胞形態(tài)，見圖1。

圖1 雷酚內(nèi)酯處理后4 組細(xì)胞形態(tài)的比較

2.3 雷酚內(nèi)酯對細(xì)胞遷移能力的影響 與對照組的（128±36）μm 比較，模型組細(xì)胞遷移距離（748±65）μm 變長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，1 μmol/L 雷酚內(nèi)酯組和10 μmol/L 雷酚內(nèi)酯組細(xì)胞遷移距離[（388±42）和（366±51）μm]均變短，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見圖2。

圖2 雷酚內(nèi)酯處理后4 組細(xì)胞遷移能力的比較

2.4 雷酚內(nèi)酯對EMT 相關(guān)蛋白熒光強(qiáng)度的影響 與對照組比較，模型組細(xì)胞α-SMA 和Vimentin 蛋白熒光強(qiáng)度均上調(diào)，而E-cadherin 蛋白熒光強(qiáng)度下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。與模型組比較，1 μmol/L雷酚內(nèi)酯組和10 μmol/L 雷酚內(nèi)酯組α-SMA、Vimentin蛋白熒光強(qiáng)度均下調(diào)，而E-cadherin 蛋白熒光強(qiáng)度上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表3 和圖3（插頁）。

圖3 雷酚內(nèi)酯處理后4 組EMT 相關(guān)蛋白的免疫熒光圖

表3 雷酚內(nèi)酯對EMT 相關(guān)蛋白熒光強(qiáng)度的影響

2.5 雷酚內(nèi)酯對EMT 相關(guān)基因表達(dá)水平的影響 與對照組比較，模型組細(xì)胞α-SMA 和Vimentin mRNA 表達(dá)水平均上調(diào)，而E-cadherin mRNA 表達(dá)水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。與模型組比較，1 μmol/L 雷酚內(nèi)酯組和10 μmol/L 雷酚內(nèi)酯組α-SMA和Vimentin mRNA 表達(dá)水平均下調(diào)，而10 μmol/L 雷酚內(nèi)酯組E-cadherin mRNA 表達(dá)水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表4。

表4 雷酚內(nèi)酯對EMT 相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

2.6 雷酚內(nèi)酯對EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 與對照組比較，模型組細(xì)胞α-SMA 和Vimentin 蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，而E-cadherin 蛋白表達(dá)水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。與模型組比較，1 μmol/L雷酚內(nèi)酯組和10 μmol/L 雷酚內(nèi)酯組α-SMA、Vimentin蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，而E-cadherin 蛋白表達(dá)水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表5 和圖4。

圖4 雷酚內(nèi)酯處理后4 組細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

表5 雷酚內(nèi)酯對EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

2.7 雷酚內(nèi)酯對EMT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的影響 與對照組比較，模型組細(xì)胞p-p65、TWIST1、ZEB1、SNAI1 蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。與模型組比較，1 μmol/L雷酚內(nèi)酯組和10 μmol/L雷酚內(nèi)酯組p-p65、TWIST1、ZEB1、SNAI1 蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表6和圖5。

圖5 雷酚內(nèi)酯處理后4 組細(xì)胞EMT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)的電泳圖

表6 雷酚內(nèi)酯對EMT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的影響

3 討論

哮喘是一種常見的氣道炎癥疾病，目前的治療方法多是針對氣道炎癥和惡化，并不針對氣道重塑，導(dǎo)致部分患者的病情仍會繼續(xù)發(fā)展并出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的氣道損傷，引起氣流受限、氣道狹窄和氣道高反應(yīng)[10]。EMT 是一個與組織重塑相關(guān)的復(fù)雜過程，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞喪失細(xì)胞黏附功能和細(xì)胞極性，從而獲得間充質(zhì)樣細(xì)胞遷移和侵襲能力，在此過程中，上皮細(xì)胞的生物標(biāo)志物（如E-cadherin）受到抑制，而間充質(zhì)標(biāo)志物（如Vimentin 和α-SMA）被上調(diào)[11]。有研究表明，氣道重塑在哮喘的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，而EMT 則積極參與哮喘的氣道重塑，抑制EMT 過程可能減緩哮喘患者的氣道重塑[12-14]。據(jù)此，本研究主要針對哮喘患者氣道重塑特征進(jìn)行探索性治療，并通過細(xì)胞層面驗證雷酚內(nèi)酯對氣道上皮細(xì)胞EMT 的抑制作用，從而探究雷酚內(nèi)酯在哮喘治療中的潛在功效。

氣道重塑的典型特征是氣道平滑肌層增厚，氣道上皮下方基質(zhì)沉積，導(dǎo)致上皮下纖維化，整個細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的長梭形間充質(zhì)樣形態(tài)[15]。在本研究中，通過給予氣管上皮細(xì)胞TGF-β 及TNF-α 刺激后，可使得細(xì)胞發(fā)生長梭形變化，這與既往研究結(jié)果一致，提示氣道重塑模型誘導(dǎo)成功。氣道重塑的另一重要表征是細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，在哮喘與肺上皮細(xì)胞EMT 導(dǎo)致的氣道重塑研究中，發(fā)現(xiàn)劃痕實驗中細(xì)胞的遷移距離有所增加，這是因為在EMT 過程中，E-cadherin 的下調(diào)以及Vimentin 上調(diào)，讓細(xì)胞間的黏附性降低，使其獲得了較高的運動能力[16-18]。本研究結(jié)果也證實了這一現(xiàn)象，即Beas-2b 細(xì)胞在TGF-β 和TNF-α 誘導(dǎo)下，EMT進(jìn)程加劇，并獲得較高遷移能力；但在雷酚內(nèi)酯處理后，其遷移能力受到顯著抑制，并且雷酚內(nèi)酯濃度越高，抑制程度越強(qiáng)。進(jìn)一步通過免疫熒光、RT-PCR 及Western blot 驗證EMT 相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，雷酚內(nèi)酯處理后Vimentin 和α-SMA 表達(dá)水平明顯下調(diào)，而E-cadherin表達(dá)水平則有一定程度上調(diào)，這說明雷酚內(nèi)酯可以緩解由TGF-β 及TNF-α 誘導(dǎo)的Beas-2b 的EMT 進(jìn)程，即可能減輕哮喘患者氣道重塑病理癥狀。而雷酚內(nèi)酯對上述蛋白的調(diào)控可能是通過影響其上游的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)實現(xiàn)的，但這仍需要進(jìn)一步的實驗驗證。

NF-κB 是一類重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能調(diào)節(jié)TNF 和多種與哮喘發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切的促炎因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。Ijaz 等[19]發(fā)現(xiàn)NF-κB 是TGF-β 誘導(dǎo)上皮細(xì)胞EMT 的主要介質(zhì)，TGF-β 可通過激活NF-κB，致使絲氨酸276 磷酸化，進(jìn)而介導(dǎo)NF-κB 發(fā)生核易位。在細(xì)胞核中，NF-κB 通過與EMT 核心調(diào)節(jié)因子（包括SNAI1、Twist1 家族和ZEB1）結(jié)合并激活其表達(dá)，直接上調(diào)其基因表達(dá)水平[20]。上述轉(zhuǎn)錄因子被激活時能夠使維持上皮狀態(tài)基因的表達(dá)受到抑制，如E-cadherin基因；同時，隨著α-SMA 和Vimentin 的激活，細(xì)胞則會獲得部分間充質(zhì)表型[21-22]。研究表明，當(dāng)NF-κB 失活時，氣道平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖均會受到抑制，從而抑制氣道重塑和氣道炎癥[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，雷酚內(nèi)酯對NF-κB 的磷酸化水平以及ZEB1、SNAI1 和TWIST1蛋白的表達(dá)水平具有下調(diào)作用，這與Chen 等[24]的結(jié)果類似，他們在利用從雷公藤中提取的另一種化合物雷公藤甲素，治療卵清蛋白致敏小鼠時，發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可降低p65 的磷酸化，抑制氣道內(nèi)壁增厚。因此，筆者推測雷酚內(nèi)酯對TGF-β 聯(lián)合TNF-α 誘導(dǎo)的細(xì)胞EMT 抵抗作用可能是通過抑制NF-κB 來調(diào)控EMT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究證實雷酚內(nèi)酯可防止由TGF-β和TNF-α 引起的EMT 進(jìn)程，但仍存在一些不足之處，例如并未在哮喘動物模型中作進(jìn)一步的驗證；同時，缺少較為合適的NF-κB 激動劑進(jìn)行功能回復(fù)實驗，因此，本課題組在下一步將考慮構(gòu)建過表達(dá)NF-κB細(xì)胞系作進(jìn)一步的機(jī)制探索，以彌補(bǔ)實驗中存在的欠缺。