劉東彥 石曉峰,* 王 信 馬趣環(huán), 沈 薇

（1.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000）

我國松樹有10 個屬120 余種，可供藥用的達(dá)13 種。南方有豐富的馬尾松（Pinus massonianaLamb.）、油松（P.abulacformisCarr.）、華山松（P.armandiFranch.）等，北方有白皮松（Pinus bungeanaZucc.ex Endl.）、雪松[Cedrus deodara( Roxb) G.Don] 、落葉松[Larix gmelinii(Rupr.) Kuzen].、樟子松(P.sylvestrisvar.mongolica Litv.)等，松樹的利用價值很高[1-3]。松針，又稱松葉、松毛，是松屬植物的主要藥用部位。松針的藥用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，稱“松為仙人之食物”，表明松與長壽有關(guān)聯(lián)。藥王孫思邈創(chuàng)立了“服松子法、服松針法、服松脂法”等自然養(yǎng)生方法?！侗静菥V目》中記載“松柏為百木之長”，服之“令人不老、輕身益氣，主風(fēng)濕瘡，生毛發(fā)，安五臟，守中，不饑延年”。梳理古醫(yī)書記載不難發(fā)現(xiàn)，抗氧化、防衰老是松針久經(jīng)實(shí)踐并傳承的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)功效之一。文獻(xiàn)報道松針的提取物[4]及成分（總黃酮[4]、總多酚[5]和多糖[6]）具有較好的抗氧化活性，主要集中在馬尾松[2,7-8]、雪松[9-11]、油松[5,12]、紅松[5,13]、樟子松[4-5]、落葉松[4,14]等。

本文以甘肅產(chǎn)的6 種松樹（蘭州和天水）白皮松、雪松、油松、樟子松、落葉松及華山松為研究對象，收集4～5月份的各品種松針，使用不同濃度的乙醇對其進(jìn)行提取，通過3 種體外抗氧化活性方法（DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力和銅離子還原能力）測試其提取物的抗氧化活性，并采用熵值法綜合評價其抗氧化能力，遴選出抗氧化活性較強(qiáng)的松針資源，以期為進(jìn)一步研究松針抗衰老藥理學(xué)及開發(fā)松針天然抗氧化劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

DPPH·（1,1- 二苯代苦味?；枺篠TBH7099），ABTS·[2,2'-連氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽，批號：SLBV6099]，美國Sigma公司。新亞銅靈（2,9-二甲基-1,10 菲啰啉，批號：20160307），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。沒食子酸對照品（批號：110831-20083，含量＞95%），中國食品藥品檢定研究院。Vc（批號：20210818，含量＞99.8%），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為分析純，水為純凈水。

甘肅產(chǎn)松樹品種[15-16]主要有雪松、油松、華山松、白皮松、樟子松和落葉松。根據(jù)以往研究，選擇在蘭州和天水兩市，同一地點(diǎn)、同一時間采集6 種松樹。蘭州雪松、白皮松、油松、華山松、樟子松及落葉松6 種松樹于2021 年4 月19 日采自甘肅省蘭州市植物園。天水雪松、白皮松、油松、華山松、樟子松及落葉松6 種松樹于2021 年5 月8 號采自甘肅省天水市小隴山林業(yè)研究院。經(jīng)品種鑒定后陰干，分別收集松針，粉碎后過藥典二號篩。樣品信息如表1 所示。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

紫外分光光度儀（UV-1800），日本島津公司。超聲波提取儀（SK3310LHC），上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司。分析天平（AE260），瑞士Mettle公司。高速多功能粉碎機(jī)（CX-100），上海市晟喜制藥機(jī)械有限公司。艾科浦超純水機(jī)（AWL-0501-M），重慶頤樣企業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 供試品溶液制備

分別精密稱取過藥典二號篩的雪松、白皮松、落葉松、樟子松、油松和華山松各1.0 g，置于100 mL的錐形瓶中，并加入不同濃度乙醇（濃度分別為25%、40%、50%、60%、75%、100%）、水40 mL，浸泡20 min，超聲提取60 min，連藥渣定容至50 mL容量瓶中，待用。

1.3.2 DPPH自由基清除率測定[10]

精密量取各待測溶液1 mL，分別置于10 mL比色管中，加入DPPH·溶液3 mL（DPPH·濃度約為0.1 mmol/L），充分振搖，在室溫避光下反應(yīng)30 min，測定517 nm處的吸光度A。以無水乙醇加DPPH·溶液制備空白溶液，于517 nm處測定吸光度A0。按公式：DPPH自由基清除率=（A0-A）÷A0×100%，計算樣品的DPPH自由基清除率。

1.3.3 ABTS自由基清除率測定[10]

精密量取各待測溶液1 mL，分別置于10 mL的比色管中，加入ABTS·溶液3 mL（ABTS·溶液臨用前用無水乙醇稀釋至吸光度為0.60±0.05），充分振搖，在室溫避光下反應(yīng)30 min，測定734 nm處的吸光度A。以無水乙醇加ABTS·溶液制備空白溶液，于734 nm處測定吸光度A0。按公式：ABTS自由基清除率=（A0-A）÷A0×100%，計算樣品的ABTS自由基清除率。

1.3.4 銅離子還原能力法測定[17-18]

精密量取各待測溶液1 mL，分別置于10 mL比色管中，加入1 mL新亞銅靈，再加入氯化銅溶液1 mL，最后加入1 mL乙酸銨溶液即得反應(yīng)液，避光條件下反應(yīng)30 min?？瞻讟油y定。于450 nm波長處測定其吸光度。

精密吸取沒食子酸對照品1.7 mg，用甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，配制濃度為68 μg/mL的對照品溶液備用。分別精密吸取沒食子酸對照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成系列濃度的沒食子酸對照品溶液。以吸光度值為縱坐標(biāo)，沒食子酸濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程y＝0.079 2x-0.006 7（R2＝0.999 6）。結(jié)果顯示，沒食子酸濃度在0.68～13.6 μg/mL時，與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.3.5 乙醇濃度篩選

取不同品種天水產(chǎn)松針的水提取物、25%乙醇提取物、50%乙醇提取物、75%乙醇提取物、無水乙醇提取物、40%乙醇提取物和60%乙醇提取物，將濃度稀釋為400 μg/mL，測定其DPPH自由基清除率；將濃度稀釋為80 μg/mL，測定其ABTS自由基清除率；將濃度稀釋為160 μg/mL，以沒食子酸當(dāng)量（mg/g）評價其銅離子還原能力。

1.3.6 半數(shù)清除濃度（EC50）的測定

取不同品種松針的40%乙醇提取物和50%乙醇提取物，將濃度稀釋成40、80、160、240、320、400 μg/mL的系列溶液，采用相同濃度的Vc作對照，測定其DPPH自由基清除率。將濃度稀釋成8、16、32、48、64、80 μg/mL的系列溶液，采用相同濃度Vc作對照，測定其ABTS自由基清除率。采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件logit回歸分析，計算其DPPH自由基和ABTS自由基半數(shù)清除濃度（EC50）。

1.3.7 熵值法綜合評價抗氧化活性

選用40%乙醇提取物和50%乙醇提取物的DPPH自由基清除率EC50值（A）、ABTS自由基清除率EC50值（B）和銅離子還原能力的沒食子酸當(dāng)量（C）為評價指標(biāo)，其中EC50值越小，表示抗氧化活性越強(qiáng)，定義為負(fù)向指標(biāo)；沒食子酸當(dāng)量值越大，表示銅離子的還原能力越強(qiáng)，其抗氧化活性就越強(qiáng)，定義為正向指標(biāo)。將其數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSSPRO軟件，對所選指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)處理，以計算不同品種松針的抗氧化活性綜合評分。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度篩選結(jié)果分析

首先對濃度為400 μg/mL的不同品種天水產(chǎn)松針的水提取物、25%乙醇提取物、50%乙醇提取物、75%乙醇提取物、無水乙醇提取物的DPPH自由基清除率進(jìn)行計算，結(jié)果如圖1所示。由圖可知，天水產(chǎn)松針中，25%和50%乙醇提取物的DPPH自由基清除活性較強(qiáng)，50%乙醇提取物的DPPH自由基清除活性略大于40%乙醇提取物。同時，對濃度為80 μg/mL松針提取物進(jìn)行ABTS自由基清除活性測定，結(jié)果如圖2所示。由圖可知，天水產(chǎn)松針50%乙醇提取物的ABTS自由基清除活性略大于40%乙醇提取物。由圖3所示不同提取物的銅離子還原能力可以看出，天水雪松松針40%乙醇提取物銅離子還原能力最強(qiáng)。然而，這3種抗氧化性能測試方法的結(jié)果并不一致，無法得出抗氧化活性最優(yōu)的乙醇濃度，因而需進(jìn)一步測定半數(shù)清除濃度（EC50）。

圖1 不同濃度乙醇提取物的DPPH自由基清除活性Fig.1 The DPPH scavenging ability of extracts by different ethanol concentrations

圖2 不同濃度乙醇提取物的ABTS自由基清除活性Fig.2 The ABTS scavenging ability of extracts by different ethanol concentrations

圖3 不同濃度乙醇提取物的銅離子還原能力Fig.3 The CUPRAC ability of extracts by different ethanol concentrations

2.2 半數(shù)清除濃度（EC50）結(jié)果分析

測定系列濃度的不同品種、不同產(chǎn)地松針40%乙醇提取物和50%乙醇提取物的DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率，結(jié)果如圖4和圖5所示。通過SPSS 19.0軟件計算EC50值，結(jié)果見表2。由數(shù)據(jù)可知，天水雪松松針40%乙醇提取物DPPH自由基清除率最強(qiáng)，但其50%乙醇提取物ABTS自由基清除率最強(qiáng)。

圖5 最優(yōu)濃度乙醇提取物的ABTS自由基的清除能力Fig.5 The ABTS scavenging ability of extracts by optimum ethanol concentrations

表2 熵值法數(shù)據(jù)表Tab.2 The data of entropy method

2.3 熵值法分析

熵值法是一種客觀賦權(quán)方法，其根據(jù)各指標(biāo)的變異程度，利用信息熵計算出各指標(biāo)的熵值，再通過熵值對各指標(biāo)權(quán)重進(jìn)行修正，從而得出較為客觀的指標(biāo)權(quán)重。將3 種抗氧化方法測定數(shù)據(jù)按照熵值法的評價指標(biāo)建立數(shù)據(jù)表，如表2 所示。將表2 數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSSPRO軟件，計算得到甘肅產(chǎn)不同品種松針的抗氧化活性綜合評分，結(jié)果如表3 所示。對比可知，雪松松針的抗氧化活性最好，且其40%乙醇提取物抗氧化活性最佳。

表3 熵值法評分結(jié)果Tab.3 The score result of entropy method

3 結(jié)論

體外抗氧化活性的評價方法較多，主要有化學(xué)分析法和細(xì)胞抗氧化活性法[19]，而化學(xué)分析法常被應(yīng)用于天然藥物抗氧化活性的初步研究[20-23]，尤其是自由基清除能力和還原能力的測定。本文結(jié)合課題組對紫斑牡丹花粉[18]和雪松松針[10]抗氧化活性的研究及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，最終選用DPPH、ABTS自由基清除法及銅離子還原能力法測定甘肅產(chǎn)不同品種、不同濃度乙醇的松針提取物的抗氧化活性。鑒于這3種抗氧化方法得出的結(jié)果不一致，因而選用熵值法對數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，得到不同品種、不同產(chǎn)地、不同濃度乙醇的松針提取物的綜合評分。研究結(jié)果顯示，雪松松針的抗氧化活性最好，其40%乙醇提取物的抗氧化活性最佳。這與課題組前期研究[10,24-26]中得到的40%乙醇、55%乙醇分別為雪松松針總黃酮、總多酚的最佳提取溶劑，及HPLC-DPPH法測得純化后雪松松針總黃酮抗氧化活性高于其總多酚的結(jié)果一致。同時也表明，將熵值法用于不同體外抗氧化活性的綜合評價可行。研究結(jié)果可為松針的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。