冷 月，胡 蕓，張 進(jìn)，李博巖*，謝 鋒，3*

（1.貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與健康學(xué)院，環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，貴州 貴陽(yáng) 550009；3.貴州省分析測(cè)試研究院，貴州 貴陽(yáng) 550000）

天然香精香料通常是多種結(jié)構(gòu)相似的化學(xué)物質(zhì)的混合物，具有獨(dú)特的物理化學(xué)和感官反應(yīng)性質(zhì)，是食品、精油、化妝品、煙草等制造領(lǐng)域廣為使用的添加劑［1-2］，其因在豐富產(chǎn)品種類、改善風(fēng)味以及提升品質(zhì)等方面均占據(jù)著重要的地位［3］而被稱為 “液體黃金”。尤其是煙草領(lǐng)域，天然香精香料及其提取物因具有芳香濃郁、口感醇厚、危害性低的特點(diǎn)而成為煙用香精香料的主要來(lái)源［4-5］，對(duì)于增強(qiáng)卷煙香韻特征、改善卷煙吸味、突出品牌風(fēng)格意義非凡。

目前已知的天然香精香料成分有四千多種，其生產(chǎn)已從自然植物資源中分離化學(xué)物質(zhì)逐漸發(fā)展為以化學(xué)合成或生物過(guò)程為重要手段進(jìn)行制備。香精香料物質(zhì)組成復(fù)雜、風(fēng)味各異，且基質(zhì)多變，使其易受原料種類、地域來(lái)源、種植環(huán)境、貯存條件以及加工方法等諸多因素影響［6］，導(dǎo)致香精香料產(chǎn)品的多樣性、易變性、調(diào)配摻假、批次間一致性欠缺等質(zhì)量問(wèn)題［7］。天然或混配的香精香料主要含有酯類、酮類、醇類、酸類、酚類等揮發(fā)性以及半揮發(fā)性物質(zhì)。關(guān)于香精香料的研究較多，也開(kāi)發(fā)有智能輔助調(diào)香系統(tǒng)，可以一定程度上調(diào)整配方、突出特定香氣特點(diǎn)，但因研發(fā)成本高，調(diào)香技術(shù)不成熟，尚未普及。通常，單體香原料可以通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）方法檢測(cè)，但對(duì)于復(fù)雜的香精香料混合物，僅通過(guò)儀器難以準(zhǔn)確定性其混合物。采用標(biāo)準(zhǔn)品與香料數(shù)據(jù)庫(kù)相結(jié)合的指紋圖譜方法可提高混合物的定性可靠性和定量準(zhǔn)確性［8］，但仍存在不同香原料的全組分構(gòu)成和香氣特征信息缺乏的問(wèn)題，使得香精香料配方研究、還原及復(fù)配、不同批次間的有效質(zhì)量控制相當(dāng)困難。

隨著儀器技術(shù)的發(fā)展，新的分析策略被用于香精香料的解析。GC-MS 具有方法穩(wěn)定、使用可靠、定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)，已成為多類風(fēng)味物質(zhì)分析的首選［9-11］；代謝組學(xué)方法具有高通量、廣覆蓋、數(shù)據(jù)整合、模式識(shí)別等優(yōu)點(diǎn)，是眾多復(fù)雜體系研究的強(qiáng)有力工具［12］。兩者結(jié)合已成功用于揮發(fā)性及半揮發(fā)性復(fù)雜體系的感官預(yù)測(cè)、過(guò)程加工以及質(zhì)量控制［13］。本文利用GC-MS 與代謝組學(xué)分析方法，對(duì)4種不同批次的混合香精香料樣品進(jìn)行組分鑒定和品質(zhì)分析，明確樣本的物質(zhì)組成差異性、香氣特征性以及品質(zhì)一致性問(wèn)題，助力混合香精香料的風(fēng)味判斷，為其復(fù)配、調(diào)香及安全生產(chǎn)提供了參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑、儀器與材料

無(wú)水乙醇（≥99.5%，天津富宇精細(xì)化工有限公司）。Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司），Mill-Q超純水凈化系統(tǒng)（美國(guó) Millipore公司），AE100梅特勒分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。某公司生產(chǎn)線上使用的不同批次，且具有不同風(fēng)味特征的4種混合香精香料樣品共93個(gè)，即A樣品26個(gè)、B樣品22個(gè)、C樣品25個(gè)、D樣品20個(gè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GC-MS 檢測(cè)稱取1.000 g 香精香料樣品，無(wú)水乙醇稀釋至2.500 g，搖勻后取溶液用0.45 μm 微孔膜過(guò)濾，采用GC-MS 技術(shù)檢測(cè)其揮發(fā)性成分［8］。色譜條件：色譜柱DB-5MS（60 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f.）；載氣 He；載氣流速1.00 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL；進(jìn)樣口溫度250 °C；分流比15∶1；分流流速15 mL/min。程序升溫：50 °C 保持2 min 后，以8 °C/min 的速度升溫至280 °C，保持25 min。質(zhì)譜條件：全掃描，掃描范圍為33~400 amu；離子源（EI）溫度230 °C；電離電壓70 eV；溶劑延遲4.80 min。

1.2.2 風(fēng)味成分分析對(duì)各樣本的GC-MS 數(shù)據(jù)進(jìn)行譜峰識(shí)別、漂移校正、背景去除等處理，提取各色譜組分的質(zhì)荷比、保留時(shí)間以及峰面積等特征信息。通過(guò)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，鑒定質(zhì)譜相似度大于0.95 的化學(xué)物質(zhì)［9］。去除不是風(fēng)味添加劑的1，2-丙二醇、甘油和尼古?。?1］，計(jì)算各類香氣組分的相對(duì)含量（即各組分的峰面積除以所有物質(zhì)組分峰面積的總和）。利用《食用香料手冊(cè)》［14］、http：//www.flavornet.org、https：//pubchem. ncbi. nlm. nih. gov、http：//www. thegoodscentscompany. com 等數(shù)據(jù)庫(kù)信息確定香精香料樣本中風(fēng)味成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)、名稱和芳香性。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析采用主成分分析（PCA）方法對(duì)校正色譜漂移后的樣本特征圖譜和由峰面積構(gòu)成的峰表數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析，考察樣本類型及批次之間的關(guān)聯(lián)性及差異性；利用單位方差標(biāo)度對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理；通過(guò)偏最小二乘判別分析（PLS-DA）進(jìn)一步識(shí)別具有類別差異的揮發(fā)性物質(zhì)。通過(guò)設(shè)置SIMCA14.1軟件中7倍交叉驗(yàn)證方法和95%置信度建立PCA和PLS-DA評(píng)估模型，采用交叉驗(yàn)證方差分析（CV-ANOVA，p <0.01）和200 次置換檢驗(yàn)進(jìn)行模型驗(yàn)證。借助變量投影重要性分析值（VIP）及p<0.05 顯著性水平篩選關(guān)鍵差異風(fēng)味成分，使用SPSS 27.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述及單因素差異分析，基于https：//bioinformatics.psb.ugent.be/cgi-bin/liste/Venn平臺(tái)繪制韋恩圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品特征組分峰表

圖1 給出了A、B、C、D 4 種香精香料樣品原始GC-MS 特征圖譜的總離子流圖?？梢钥闯觯瑯悠返幕瘜W(xué)組成復(fù)雜，含有幾十種香氣物質(zhì)，除A類與C 類樣本圖譜在整體上具有較高的相似性及一致性外，不同類別樣品間的圖譜差異較大。

圖1 4種樣品的GC-MS特征圖譜的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms（TICs） of GC-MS fingerprints of four samples

基于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析方法［15-17］，對(duì)所有樣本二維GC-MS 數(shù)據(jù)中的組分進(jìn)行色譜峰校正和質(zhì)譜信息特征提取，生成樣品特征組分峰表，并通過(guò)NIST 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，結(jié)果鑒定出93 種化合物。該峰表包含了每個(gè)樣本所鑒定的各組成物質(zhì)的名稱、色譜保留時(shí)間、色譜峰面積、以及相對(duì)含量等，由于表格過(guò)大、內(nèi)容過(guò)多，所以未在文中列出。其中，A 類樣本主要包含49 種物質(zhì)，B類樣本中32 種物質(zhì)，C 類樣本中48 種物質(zhì)，D 類樣本中39 種物質(zhì)。4 類樣本的共有香氣成分可分為8 種。根據(jù)官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)不同，這些化合物分為：酯類、酮類、醇類、酸類、醛類、酚類、胺類及其他類物質(zhì)。4 種香精香料樣本的風(fēng)味物質(zhì)組成及比例不同，致香物質(zhì)的種類和含量均存在一定的差異性，其中酯類化合物的數(shù)量最多（35 種），其次是酮類（16種）、醇類（12種）、酸類（12種）、醛類（9種）、酚類（3種）、胺類（2種）及其他類物質(zhì)（4種），具體信息見(jiàn)表1。C 類和A 類樣品中酯類風(fēng)味物質(zhì)的含量最豐富，分別為64.609%、38.568%。B類樣品中酸類風(fēng)味成分的相對(duì)含量最高（即42.812%）。D 類樣品中含量最多的風(fēng)味成分為酮類（44.763%）。乙酸乙酯、乙酰丙酸乙酯、異戊酸異戊酯、麥芽酚、二丙二醇、乙酸、4-氧代戊酸及5-羥甲基-2-呋喃甲醛8種化合物為4種樣本的共有香氣成分（表2）。

表1 4種樣本中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類及相對(duì)含量（RC）Table 1 Types and relative contents（RC） of volatile flavor compounds in flavor and fragrance samples

表2 4種香精香料樣品中共有成分的相對(duì)含量（RC）及風(fēng)味特征Table 2 Relative content（RC） and flavor characteristics of compositions in common in samples（%）

2.2 風(fēng)味成分分析

香氣物質(zhì)是評(píng)價(jià)香精香料樣本品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，因此對(duì)各樣品中的風(fēng)味成分進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果如表3所示。

表3 FEMA收錄的天然香精香料風(fēng)味特征的成分組群Table 3 Composition groups of flavor profile of natural flavors and fragrances included in FEMA

2.2.1 酯類化合物酯類致香物質(zhì)具有柔和煙氣、改善產(chǎn)品內(nèi)在品質(zhì)的作用以及來(lái)源廣、香型多、價(jià)格適宜的特點(diǎn)，是應(yīng)用最多的煙用香料，在總體香料中的占比≥20%。大部分酯類成分具有果香、花香及酒香等芳香性氣味［18］。不同的酯類香精添加到卷煙中，使其具有不同的香型特征，導(dǎo)致了卷煙氣溶膠中的風(fēng)味差異。在A 類與B 類樣本中共鑒定出14 種酯類物質(zhì)，分別占總含量的38.568%和36.736%。二乙酸甘油酯是A類樣本酯類物質(zhì)中相對(duì)含量最多的物質(zhì)，主要由1，2和1，3-二乙酸酯以及少量的單酯和三酯組成。乙酸乙酯在4 類樣本中均有檢出，在B 類樣品中的含量尤為豐富，該物質(zhì)主要提供白蘭地酒香及葡萄果香。C類與D類樣本中化合物的數(shù)量及相對(duì)含量差異較大。C類樣本中22種酯類致香物質(zhì)占了總體風(fēng)味成分的64.609%，主要是菠蘿果味的己酸烯丙酯、白蘭地酒香的乙酸乙酯以及青草香的異戊酸異戊酯。D 類樣本中13 種酯類化合物僅占總體風(fēng)味物質(zhì)19.067%，主要為具有奶酪香、花香、水果香的乳酸乙酯。

2.2.2 酮類化合物具有不飽和結(jié)構(gòu)的羰基是致香基團(tuán)，羰基化合物具有優(yōu)美的香氣，是煙氣中的主要致香成分。該類香料物質(zhì)主要用于強(qiáng)化香氣風(fēng)格特性，增加煙草甜香，使煙氣和順細(xì)膩。酮類化合物是樣本中的第二大類風(fēng)味物質(zhì)，其種類及相對(duì)含量差異較大。A 類樣品中10種酮類化合物占比為21.940%，C 類樣品中7 種酮類物質(zhì)占比約為17.050%，主要為2-羥基-3，5，5-三甲基環(huán)己-2-烯酮。B類樣品中有5 種酮類化合物，僅占總含量的3.770%。D 類樣本中酮類香料物質(zhì)的相對(duì)含量最為豐富，占總含量的44.763%，主要來(lái)自致香物質(zhì)3-甲基環(huán)戊烷-1，2-二酮及乙基麥芽酚。乙基麥芽酚是γ-吡喃酮的衍生物，具有果香風(fēng)味，是較理想的香料物質(zhì)，而且用量少、功效多、安全性高，可用于提升卷煙煙氣回甜感、凸顯卷煙“甜”與“潤(rùn)”的口感特征，是我國(guó)常用的香味增效劑，在4 類樣品中均檢出麥芽酚。

2.2.3 醇類及酸類化合物類似于酮類，醇類增香物質(zhì)在卷煙中的作用是去除辛辣雜味、減少卷煙的刺激性。A 類樣本中的反式-橙花叔醇具有木質(zhì)香韻。D 類樣品中的苯甲醇較為豐富，可為卷煙提供果香、烤面包香及玫瑰花香。然而，研究指出苯甲醇具有潛在吸入毒性風(fēng)險(xiǎn)［19］，會(huì)引起嚴(yán)重的眼睛刺激或皮膚刺激。甘油、丙二醇等低沸點(diǎn)多元醇在卷煙中既有保潤(rùn)作用，又能促進(jìn)煙氣及香氣物質(zhì)的釋放，該類物質(zhì)具有煙草毒性、成癮性、致癌性等危害或風(fēng)險(xiǎn)。酸類致香物質(zhì)可改善煙氣酸堿度，使煙氣吸味醇和，揮發(fā)性酸性致香物質(zhì)在卷煙吸食過(guò)程中能夠直接沁入煙氣，對(duì)香味影響顯著。B 類香精香料中酸類致香物質(zhì)占總體風(fēng)味成分的42.812%，主要來(lái)自乙酸及4-氧代戊酸，具有酸香及果香風(fēng)味。該物質(zhì)在A、C及D類樣品中均有檢出。

2.2.4 醛類、酚類及胺類化合物醛類物質(zhì)一般具有青草味，可以改善口腔舒適度。A類和D類香料樣本中含有少量苯甲醛，該物質(zhì)提供苦杏仁、焦糖風(fēng)味，可以減弱煙霧刺激，增加吸入量［9］。A類和C類樣本中含有合成香料乙基香蘭素，因其具有濃烈香子蘭氣息，并且香氣清爽、純正、用量少而被廣泛應(yīng)用于煙草調(diào)香，但會(huì)導(dǎo)致主流煙氣中苯系物及酚類物質(zhì)含量增加，危害人體健康。各類樣本中的5-羥甲基-2-呋喃甲醛含量較為豐富，具有洋甘菊花香，該物質(zhì)也存在于蜂蜜的揮發(fā)性成分中。酚類香精香料通常被用于增加煙草的芳香度和深度，提高香味格調(diào)。胺類物質(zhì)可以增加煙草的甜味、果香味以及辛辣味。在B 類樣本中未檢出胺類致香物質(zhì)，酚類物質(zhì)只有2，4-二叔丁基苯酚。A 類、C 類及D類樣本中酚類及胺類物質(zhì)較少，主要是對(duì)甲氧基肉桂酚及2，2，3，3，3-五氟-N-（2-苯基乙基）丙酰胺?？傮w來(lái)說(shuō)，樣品中鑒定出的酚類及胺類的種類及相對(duì)含量均較少，其中大多對(duì)皮膚和眼睛有強(qiáng)烈刺激性，甚至存在神經(jīng)毒素、肝毒素類物質(zhì)，是影響卷煙安全性的重要因素。

作為必要輔料的香精香料，添加到煙絲中直接參與煙支燃燒，其化學(xué)成分的穩(wěn)定性及生物安全性直接關(guān)系到卷煙的感官評(píng)價(jià)和消費(fèi)者的健康安全。美國(guó)食品香料與萃取物制造者協(xié)會(huì)（Flavor and Extract Manufacturers Association，F(xiàn)EMA）基于食品用香料攝入量評(píng)估、代謝及遺傳毒理學(xué)等數(shù)據(jù)研究，明確不同致香物質(zhì)組群的風(fēng)味特征和安全性用途，制作名錄并賦予FEMA 編號(hào)。從卷煙調(diào)香的實(shí)際應(yīng)用樣本中共鑒定的93 種風(fēng)味物質(zhì)，37 種化合物具有FEMA 編號(hào)，表3 概括了這些物質(zhì)的風(fēng)味信息。未在名錄上的56 種化合物，其生物安全性仍不確定，應(yīng)是毒理學(xué)研究以及風(fēng)味安全監(jiān)管機(jī)構(gòu)的關(guān)注重點(diǎn)，需對(duì)其進(jìn)行加香卷煙煙氣體外與吸入毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究等。

2.3 差異物鑒定

2.3.1 基于峰面積的差異物分析應(yīng)用PCA 方法可視化分析不同類型香精香料樣本的風(fēng)味化合物。3個(gè)主成分解釋了峰表數(shù)據(jù)的95.90%的總方差，所得模型中代表擬合優(yōu)度及預(yù)測(cè)能力的R2X和Q2的值分別為0.970和0.962，因此模型較為合理可靠。圖2a給出了該P(yáng)CA模型的得分圖。從圖中可以看出4類樣本的風(fēng)味物質(zhì)存在顯著差異，對(duì)應(yīng)的得分分布明顯不同，而同類型不同批次樣本分布較為接近。該結(jié)果反映了樣本數(shù)據(jù)特征組分的分布共性和差異性。借助PLS-DA 模型進(jìn)一步挖掘樣本組間的特征組分差異。模型中交叉驗(yàn)證參數(shù)R2X 為0.969，R2Y 為0.996，Q2為0.996，CV-ANOVA 和置換檢驗(yàn)結(jié)果均較好，說(shuō)明了PLS-DA模型的可靠性。圖2b所示的香精香料樣品的PLS-DA得分圖與PCA的分析結(jié)果（圖2a）一致。利用PLS-DA模型中衡量每個(gè)變量對(duì)各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度及解釋能力的變異權(quán)重參數(shù)值（VIP）輔助篩選標(biāo)志變量，判別依據(jù)一般認(rèn)為VIP > 1.0表示該變量具有重要作用，VIP值越大說(shuō)明該化合物在樣本間的差異越顯著。根據(jù)VIP > 1.0且p< 0.05的標(biāo)準(zhǔn)，從4類樣本中共篩選出苯乙酮、苯甲酸乙酯、肉桂酸、反式-橙花叔醇、庚酸乙酯、2，4-二叔丁基苯酚、糠醇、3-去氧-D-甘露醛酸、3-呋喃甲酸甲酯、苯乙酸、叔丁基酚、蘋(píng)果酸二乙酯、2-丁基-3-甲基吡嗪、2-羥基丙酸等40種差異性化合物。

圖2 基于峰面積數(shù)據(jù)的香精香料樣品的PCA（a）和PLS-DA（b）分析得分圖Fig.2 PCA（a） and PLS-DA（b） score plots of flavor and fragrance samples based on the peak area data

2.3.2 基于總離子流圖的差異特征分析運(yùn)用多尺度譜峰匹配（MSPA）方法［20］對(duì)各樣本GC-MS數(shù)據(jù)中的漂移色譜峰進(jìn)行保留時(shí)間校準(zhǔn)和譜峰匹配。以A 類和C 類中50 個(gè)樣本（剔除1 個(gè)奇異樣本）為例，圖3L是其在8.867~9.405 min范圍內(nèi)的原始數(shù)據(jù)的總離子流（TIC）圖。可以看出，不同樣本的色譜峰存在明顯的漂移現(xiàn)象。因此，有必要進(jìn)行譜峰漂移校準(zhǔn)和峰匹配。圖3R 展示了經(jīng)過(guò)MSPA 峰匹配處理的總離子流圖，可見(jiàn)峰匹配處理后不同樣本的各譜峰的保留時(shí)間基本一致，有利于更合理準(zhǔn)確地進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

在此基礎(chǔ)上，對(duì)4 類樣本的TIC 數(shù)據(jù)分別進(jìn)行PCA 和PLS-DA 分析，結(jié)果如圖4 所示。其與基于特征組分峰面積數(shù)據(jù)的分析結(jié)果（圖2）一致：在95%的置信區(qū)間內(nèi)不同類樣本區(qū)別明顯，同類型不同批次樣本的得分分布相近。圖5給出了PLS-DA 模型從4 類樣本的TIC 圖譜中篩選出的VIP > 1.0 且p< 0.05的特征變量（標(biāo)記）與使用峰表數(shù)據(jù)建立的PLS-DA 判別模型發(fā)現(xiàn)的差異化合物（標(biāo)記）相比較的結(jié)果。基于TIC 圖譜選擇的特征變量較多且有連續(xù)性，即這些變量對(duì)應(yīng)特定組分的整體色譜流出輪廓，可以區(qū)別樣本的風(fēng)味成分或香味物質(zhì)（表4）。例如，保留時(shí)間（RT）分別為13.162 min 的3-甲基環(huán)戊烷-1，2-二酮、14.042 min的苯乙酮、16.613 min的乙基麥芽酚、17.238 min的苯乙酸和22.733 min的反式-橙花叔醇等。根據(jù)所標(biāo)識(shí)的差異物質(zhì)的譜峰分布、強(qiáng)度變化，可看出VIP 變量與峰表特征成分基本一致，但峰表數(shù)據(jù)更直觀地解釋了樣本差異成分。

表4 4種香精香料樣本的TIC數(shù)據(jù)經(jīng)多尺度譜峰匹配后得到的差異性物質(zhì)Table 4 Differential compounds in the MSPA-aligned TIC data of the flavor and fragrance samples

圖4 香精香料樣本峰匹配后TIC數(shù)據(jù)的PCA（a） 和PLS-DA（b） 分析得分圖Fig.4 PCA（a） and PLS-DA（b） score plots of the aligned TIC data of all the flavor and fragrance samples

圖5 4種香精香料樣本中差異成分與特征變量Fig.5 Differential components and feature variables in flavor and fragrance samples blue curve represented the average TIC profile of GC-MS data of samples，red open circle labelled the feature variables with VIP>1.0 & p<0.05 in the PLS-DA model on the MSPA-aligned TIC chromatograms，and dark green star indicated the differential components given in peak table（藍(lán)色曲線為樣本的GC-MS數(shù)據(jù)的平均TIC圖譜，表示PLS-DA模型中的VIP>1.0且p<0.05的變量，表示峰表數(shù)據(jù)中的特征成分）

2.3.3 韋恩圖分析疊加或交叉4 類樣本的差異物質(zhì)數(shù)據(jù)集繪制韋恩圖（圖6），可直觀地展示不同樣本之間的共有組分與獨(dú)有特征物質(zhì)，是代謝組學(xué)分析中的常用可視化工具。韋恩圖將篩選出的40種差異物質(zhì)按照樣本類型分為A、B、C、D 4 個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域內(nèi)部包含該類樣本集合的元素，重疊部分表示共同元素的集合。圖6 顯示A、B 和D 類樣本分別具有10 種、9 種及8 種特征成分，然而C 類樣本不具有不同于這三類樣本的特征物質(zhì)。結(jié)合表4，得到4 類樣本共有3 種風(fēng)味成分：4-氧代戊酸、5-羥甲基-2-呋喃甲醛、乙酸。各類樣本特有的物質(zhì)可作為樣本識(shí)別的潛在標(biāo)記物，即A 類樣本中2-糠醛二乙縮醛、2-芐氧基-3-甲基-1，4-丁二醇、苯乙酮、苯甲酸乙酯、肉桂酸、反式-橙花叔醇、庚酸乙酯、7-羥基八碳二烯酸等可被認(rèn)為是其標(biāo)記化合物；B 類樣本中2-｛3-甲基丁烯基｝環(huán)己酮、2，4-二叔丁基苯酚、糠醇、3-去氧-D-甘露醛酸、5-氧代四氫呋喃-2-甲酸甲酯、二氫-5-甲基-5-（2-甲基丙基）-2（3H）呋喃、5-乙酰氧基-4-氧代己-2-烯酸甲酯、3-呋喃甲酸甲酯等是區(qū)別該類香精香料的關(guān)鍵；苯乙酸、甲基偶氮氧乙酸甲酯、叔丁基酚、蘋(píng)果酸二乙酯、2-丁基-3-甲基吡嗪、2-羥基丙酸、5-異丙基-2-甲基環(huán)己酸乙酯等化合物有助于D類樣本的鑒定。

圖6 4種混合香精香料樣本中差異物質(zhì)的韋恩圖Fig.6 Venn diagram of differential substances among four classes of flavor and fragrance samples

2.4 品質(zhì)一致性分析

樣本生產(chǎn)的時(shí)序性等客觀因素使得不同批次間存在一定的質(zhì)量差異。為更好地表征樣本批次間的質(zhì)量波動(dòng)情況，對(duì)鑒定出的各類樣本差異物質(zhì)的相對(duì)含量均值（Mean）、標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）以及變異系數(shù)（CV）等進(jìn)行比較分析。通常變異系數(shù)小意味著樣本批次相對(duì)穩(wěn)定、品質(zhì)一致性好，變異系數(shù)大則表示樣本批次間質(zhì)量波動(dòng)大、質(zhì)量控制不足。以A 類樣本為例，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表5 所示?？煽闯龈髋伍g質(zhì)量較為穩(wěn)定的特征物質(zhì)是變異系數(shù)為3.987%的7-氧代雙環(huán)［4.2.1］壬-2，4-二烯-8-酮、4.030%的苯乙酮以及4.054%的苯甲酸乙酯；變異系數(shù)為8.522%的肉桂酸、7.560%的3-脫氧-D-甘露醇內(nèi)酯以及7.222%的乙酸等物質(zhì)的批次間質(zhì)量波動(dòng)性略大。各物質(zhì)的變異系數(shù)基本保持在10%以下，說(shuō)明A 類樣本各批次的特征物質(zhì)的質(zhì)量較為穩(wěn)定，批次效應(yīng)小，品質(zhì)一致性好。此外，通過(guò)該分析可得到各差異物質(zhì)95%置信區(qū)間的相對(duì)含量范圍，如在95%的置信區(qū)間內(nèi)反式-橙花叔醇的相對(duì)含量為0.251%～0.264%，肉桂酸的相對(duì)含量為0.554%～0.597%。這有助于鑒別風(fēng)味類型的同時(shí)監(jiān)控工業(yè)生產(chǎn)質(zhì)量。

表5 A類樣本中特征差異物質(zhì)相對(duì)含量的統(tǒng)計(jì)參數(shù)Table 5 Statistical parameters of the relative content（RC） of characteristic differential substances in flavor and fragrance samples of class A

3 結(jié) 論

本文運(yùn)用GC-MS技術(shù)、代謝組學(xué)方法與風(fēng)味學(xué)手段，評(píng)估不同風(fēng)格特征、不同批次的香精香料樣品的組成成分、品質(zhì)及差異情況。結(jié)果鑒定出93種風(fēng)味化合物，其中酯類物質(zhì)的數(shù)量最多，其次是酮類、醇類及酸類；各致香物質(zhì)在樣本配方組成上差異較大，A 類49 種、B 類32 種、C 類48 種以及D 類39 種；共有揮發(fā)性化合物乙酸乙酯、乙酰丙酸乙酯、異戊酸異戊酯、麥芽酚、二丙二醇、乙酸、4-氧代戊酸及5-羥甲基-2-呋喃甲醛可能是香精香料的重要物質(zhì)組成；不同類樣本的風(fēng)味特征不同，A 型和C型樣品中酯類含量最為豐富，通常用以柔和香氣，提供果香、花香及酒香氣味，B型中相對(duì)含量最高的是提供醇厚酸香特征的酸類物質(zhì)，D 型香料中最多的為加強(qiáng)焦香、鮮果香風(fēng)味的酮類致香物質(zhì)。確定了肉桂酸、反式-橙花叔醇、庚酸乙酯、2，4-二叔丁基苯酚、乙基麥芽酚、糠醇、苯乙酸、叔丁基酚、蘋(píng)果酸二乙酯、乳酸乙酯、2-羥基丙酸等40種關(guān)鍵差異風(fēng)味物質(zhì)以及各類樣本特有的潛在標(biāo)識(shí)成分。該研究有益于促進(jìn)混合香料的風(fēng)味區(qū)分、復(fù)配調(diào)香、品質(zhì)判斷以及質(zhì)量控制。