薛 松，胡加海，董祥寧

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬滁州醫(yī)院/滁州市第一人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)二科，安徽 滁州 239001)

胰腺癌具有臨床表現(xiàn)隱匿、發(fā)展迅速和預(yù)后差的特點，總體發(fā)病率和死亡率逐年上升。2020 年GLOBOCAN 數(shù)據(jù)顯示，全球胰腺癌新發(fā)病例約49.6萬，新增死亡病例約46.6 萬[1]。胰腺癌的早期癥狀不典型，多數(shù)患者確診時已經(jīng)處于晚期，5 年總生存(overall survival，OS)率不足10%。晚期胰腺癌的治療以化療為主，目前國際公認(rèn)的一線化療方案包括：白蛋白結(jié)合型紫杉醇+吉西他濱、奧沙利鉑+伊立替康+5-氟尿嘧啶/亞葉酸[2]。但化療療效有限且耐藥難以避免，胰腺癌的治療亟需新突破。免疫治療在近年來取得了顯著的進(jìn)展，但在晚期胰腺癌領(lǐng)域效果甚微[3]。在靶向治療藥物方面，PARP抑制劑、KRAS抑制劑等取得了一定的效果，但限于突變頻率較低，受益患者較少[4]。因此，尋找新的治療靶點對改善晚期胰腺癌患者的預(yù)后有重要意義。

磷酸甘油酸變位酶(phosphoglycerate mutase family member，PGAM)是糖酵解和糖異生的重要酶，催化3-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為2-磷酸甘油酸[5]。PGAM5是PGAM 家族成員之一，但其催化磷酸組氨酸特征基序的保守性較差，因此缺乏變位酶活性[6]。盡管如此，PGAM5 通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用及其特定的Ser/Thr/His蛋白磷酸酶活性參與線粒體動力學(xué)和凋亡的調(diào)節(jié)[7]。cBioPortal 數(shù)據(jù)庫顯示，PGAM5突變發(fā)生在多種腫瘤中，突變位點主要集中在PGAM 結(jié)構(gòu)域。這些突變可能會改變PGAM5 在線粒體動力學(xué)和程序性細(xì)胞死亡中的作用，并促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。PGAM5已被證實在多種惡性腫瘤中過表達(dá)[8-10]，但目前其在胰腺癌中是否異常表達(dá)尚無報告。本研究旨在明確PGAM5 在胰腺癌組織中的表達(dá)及其與患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析

從UCSC Xena官網(wǎng)(https://xenabrowser.net/datapages/)下載癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)中胰腺癌的RNA-seq 數(shù)據(jù)和基因型組織表達(dá)(Genotype-Tissue Expression，GTEx)中正常組織的RNA-seq 數(shù)據(jù)。納入研究的TCGA 數(shù)據(jù)集包含179 個胰腺癌組織樣本和4個癌旁正常組織樣本；GTEx數(shù)據(jù)集包含167 個正常組織樣本。利用ggplot2 軟件包(V3.3.6)分析PGAM5 mRNA 在胰腺癌組織和正常組織中的表達(dá)差異。

1.2 臨床標(biāo)本收集、PGAM5 蛋白表達(dá)檢測及相關(guān)分析

1.2.1 標(biāo)本收集及患者臨床特征收集了2018 年01月—2020年12月于滁州市第一人民醫(yī)院就診的胰腺癌患者臨床資料86 例(52 例包含腫瘤組織標(biāo)本及其對應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本)。其中男性50 例(58.1%)，女性36 例(41.9%)；年齡＜60 歲53 例(61.6%)，≥60 歲33 例(38.4%)。根據(jù)AJCC 第8 版TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，其中I～I(xiàn)I期28例(32.6%)，III～I(xiàn)V期58例(67.4%)；腫瘤長徑≤4 cm 者28 例(32.6%)，＞4 cm 者58 例(67.4%)；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15 例(17.4%)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移71 例(82.6%)；無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移60 例(69.8%)，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移26 例(30.2%)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查診斷為胰腺癌；②有保存良好的組織標(biāo)本；③有詳細(xì)臨床病理資料和隨訪信息。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有其他腫瘤及重要器官功能障礙者。采用門診、電話或網(wǎng)絡(luò)通信相結(jié)合的方式進(jìn)行隨訪。所有患者在首次就診后開始隨訪，每月隨訪1 次，隨訪時間截至2023 年07 月31 日，隨訪率100%。生存期(overall survival，OS)為從病理學(xué)診斷為胰腺癌到患者死亡或隨訪截止時間。此外，通過手術(shù)收集6 對新鮮胰腺癌組織及其癌旁正常組織標(biāo)本。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號為83220465)。

1.2.2 主要試劑過氧化氫、PBS緩沖液、TBST緩沖液、牛血清白蛋白均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DAB 染色液、蘇木素染色液、EDTA 抗原修復(fù)液、PMSF 蛋白酶抑制劑、RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、PVDF 膜、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；兔來源PGAM5 抗體和GAPDH 抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2.3 Western blot6 對新鮮胰腺癌組織及其癌旁正常組織標(biāo)本采用Western blot 檢測PGAM5 蛋白的表達(dá)水平。首先冰浴上取出新鮮胰腺癌組織及其癌旁正常組織，PBS 洗滌并剪碎，加入含PMSF 蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰浴超聲勻漿。冰浴靜置30 min，4 ℃離心20 min，取上清，取少量用BCA法測定蛋白質(zhì)含量，其余轉(zhuǎn)入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?0 μg蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，放入含5%脫脂牛奶的TBST 中，室溫封閉2 h。滴加PGAM5 一抗(1∶20 000 倍稀釋)，4 ℃輕搖過夜。TBST洗滌后滴加二抗(1∶1 000倍稀釋)，室溫輕搖孵育2 h。通過ECL 化學(xué)發(fā)光試劑檢測免疫反應(yīng)條帶。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色采用免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemical staining，IHC)檢測胰腺癌組織中PGAM5 蛋白的表達(dá)水平。常規(guī)石蠟包埋，脫蠟至水，加入EDTA 抗原修復(fù)緩沖液，并于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。3%過氧化氫溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉20 min 后滴加PGAM5 一抗(1∶200 倍稀釋)，4 ℃過夜。PBS 洗滌后滴加二抗(1∶50 倍稀釋)，室溫作用50 min。PBS洗滌后進(jìn)行DAB顯色，蘇木素對比染色。脫水封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

DAB 顯出的陽性表達(dá)為棕黃色，蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色。結(jié)果以陽性細(xì)胞百分率和染色強(qiáng)度結(jié)合綜合計分。陽性細(xì)胞比例評分標(biāo)準(zhǔn)：≤5%為0分，＞5%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，＞75%為4 分。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：無染色為0 分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩者分?jǐn)?shù)相乘，評分的中位值(6 分)為界，總分≥6 分判定為高表達(dá)，＜6分判定為低表達(dá)。染色結(jié)果由2名病理醫(yī)師獨(dú)立雙盲判斷。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

生物信息學(xué)數(shù)據(jù)應(yīng)用R 4.2.1 軟件進(jìn)行整理和統(tǒng)計學(xué)分析，利用Mann-WhitneyU檢驗比較PGAM5 在胰腺癌組織和正常組織中的表達(dá)差異。臨床數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用表示，計數(shù)資料用百分比(%)表示；采用Wilcoxon符號秩檢驗比較PGAM5 在配對樣本間的表達(dá)差異；卡方檢驗分析PGAM5 與臨床病理特征的關(guān)系；Spearman 相關(guān)系數(shù)分析二元變量間的相關(guān)性；Cox 回歸模型進(jìn)行單因素或多因素分析。應(yīng)用GraphPad Prism 9.4.0 軟件繪制Kaplan-Meier 生存曲線。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PGAM5在胰腺癌組織中的表達(dá)水平

TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫分析表明，胰腺癌組織中PGAM5 mRNA的相對表達(dá)量(4.04±0.50)高于正常組織(2.93±0.52)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見圖1。Western blot 檢測結(jié)果顯示在6 對新鮮胰腺癌組織中PGAM5蛋白的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，提示PGAM5蛋白的表達(dá)水平在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，見圖2。IHC 檢測結(jié)果顯示，PGAM5 蛋白在胰腺癌組織中呈棕黃色顆粒狀，主要在細(xì)胞胞漿中表達(dá)(圖3A)。IHC半定量分析顯示，52例胰腺癌組織PGAM5蛋白表達(dá)的中位評分為6分(5.27±3.31)，對應(yīng)的癌旁正常組織PGAM5 中位評分為2 分(2.65±2.12)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見圖3B。

圖1 生物信息學(xué)分析PGAM5 mRNA在胰腺癌組織中的表達(dá)水平

圖2 Western blot 檢測PGAM5蛋白在6對新鮮胰腺癌組織和對應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)

2.2 PGAM5與胰腺癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

在86例胰腺癌組織中，PGAM5高表達(dá)者占53.5%(46/86)，PGAM5 低表達(dá)占46.5%(40/86)，分析其表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。如表1 所示，PGAM5 的表達(dá)水平與胰腺癌患者TNM 分期、腫瘤長徑和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(均為P＜0.01)，與年齡、性別和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)(P＞0.05)。Spearman 相關(guān)分析表明，PGAM5 與TNM 分期、腫瘤長徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，與年齡和性別無明顯相關(guān)(P＞0.05)，見表2。

表1 PGAM5表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系

表2 PGAM5表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.3 PGAM5對胰腺癌的生存預(yù)后價值

采用Cox 回歸模型分析PGAM5 表達(dá)與86 例胰腺癌患者生存預(yù)后的相關(guān)性。單因素分析提示，PGAM5、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均是影響胰腺癌患者預(yù)后的危險因素(P＜0.01)；而年齡、性別、腫瘤長徑與患者預(yù)后無關(guān)(P＞0.05)。將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的變量納入多因素分析模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PGAM5蛋白的表達(dá)水平是胰腺癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立影響因素[HR=2.101，95%CI(1.210，3.646)，P=0.008]，見表3。Kaplan-Meier 生存曲線顯示，PGAM5低表達(dá)組患者的中位OS為27個月，而PGAM5高表達(dá)患者的中位OS 僅為17 個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[HR=2.470，95%CI(1.533，3.980)，P＜0.01]，見圖4。

表3 86例胰腺癌患者OS的單因素和多因素分析

圖4 86例胰腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

線粒體是細(xì)胞增殖過程中平衡氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡的重要細(xì)胞器，多項研究證實PGAM5 是線粒體動力學(xué)和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[7]。了解細(xì)胞如何防御線粒體應(yīng)激以避免細(xì)胞凋亡的過程對于開發(fā)有效的疾病治療方法至關(guān)重要。在輕度應(yīng)激下，PGAM5調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生和線粒體自噬，維持線粒體穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞存活[11]。在嚴(yán)重應(yīng)激下，PGAM5促進(jìn)線粒體分裂，整合多種死亡信號誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[12]。已有研究表明，PGAM5的異常表達(dá)與人類多種疾病密切相關(guān)。與健康人群相比，帕金森病患者血漿中PAMG5 水平明顯升高，且具有較高的敏感性和特異性，PGAM5可能是診斷帕金森病的生物標(biāo)志物[13]。在免疫反應(yīng)方面，PGAM5可抑制NDPK-B介導(dǎo)的組氨酸磷酸化，激活K+通道KCa3.1，并負(fù)性調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞[14]。敲除或抑制PGAM5 可通過抑制Drp1 減少心肌細(xì)胞壞死，并改善大鼠的心肌缺血再灌注損傷。抑制Ripk3-PGAM5-CypD-mPTP通路可減輕心臟微血管缺血再灌注損傷[15]。

線粒體功能障礙是腫瘤細(xì)胞的一個顯著特征。PGAM5的異常表達(dá)可導(dǎo)致線粒體超微結(jié)構(gòu)異常和線粒體功能障礙，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤相關(guān)。肝癌組織中PGAM5 的表達(dá)高于正常組織，PGAM5 通過與Bcl-xL和Keap1 的相互作用介導(dǎo)肝癌的化療耐藥[8]。Kwong等[9]已證實PGAM5在非小細(xì)胞肺癌和癌前組織(鱗狀不典型增生和原位癌)中表達(dá)，但在正常上皮中不表達(dá)。此外，PGAM5 在胃癌組織中高表達(dá)并通過PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的生長和侵襲[10]。在結(jié)直腸癌組織中，PGAM5 和Parkin 蛋白的表達(dá)也明顯升高[16]。然而，也有研究報道在人結(jié)直腸癌中，PGAM5 和Bcl-xL 的表達(dá)低于正常組織，而Keap1 的表達(dá)高于正常組織，Keap1介導(dǎo)的PGAM5和Bcl-xL降解可能在結(jié)直腸癌中較為活躍[17]。迄今為止，PGAM5在胰腺癌中的表達(dá)、與患者臨床病理特征之間關(guān)系的研究甚少，值得進(jìn)一步探索。

本研究通過分析TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中胰腺癌和正常組織的RNA-seq 數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示PGAM5 在胰腺癌組織中明顯過表達(dá)。隨后利用Western blot 和IHC驗證了生物信息學(xué)分析結(jié)果，Western blot 分析顯示PGAM5 在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織。IHC 結(jié)果顯示，腫瘤組織中PGAM5 的高表達(dá)率為53.5%(46/86)；相比之下，在癌旁正常組織中的高表達(dá)率僅為13.5%(7/52)，表明PGAM5 在胰腺癌中的表達(dá)水平顯著升高。這些結(jié)果表明，PGAM5可作為鑒別胰腺組織良性和惡性的標(biāo)記物。進(jìn)一步將PGAM5 的IHC 評分與胰腺癌患者的臨床病理數(shù)據(jù)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。相關(guān)性分析提示PGAM5 表達(dá)水平與TNM 分期、腫瘤長徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與年齡、性別無關(guān)。多因素分析發(fā)現(xiàn)PGAM5、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響胰腺癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險因素(P＜0.01)。Kaplan-Merier 生存分析表明，PGAM5 高表達(dá)的胰腺癌患者中位OS 僅為17 個月，明顯低于PGAM5 低表達(dá)患者中位OS 的27 個月(P＜0.01)。這些結(jié)果提示，PGAM5可能是判斷胰腺癌患者預(yù)后的重要分子標(biāo)志。

綜上，PGAM5可能是胰腺癌預(yù)后判斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，其表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理特征密切相關(guān)，PGAM5 高表達(dá)提示預(yù)后較差。因此，對于PGAM5高表達(dá)的胰腺癌患者，建議強(qiáng)化術(shù)后輔助治療方案，如患者一般狀況良好，可考慮奧沙利鉑+伊立替康+5-氟尿嘧啶/亞葉酸三藥方案作為術(shù)后輔助化療方案[18]。此外，本研究為回顧性研究，且樣本量較少，可能存在選擇偏倚，需要更加嚴(yán)格的大樣本、多中心研究來進(jìn)一步驗證。對于PGAM5 在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步的深入研究。