劉 菲, 王 倩, 韓婷婷, 楊素珍, 王文翠, 郭鳳嬌

(1. 山東福瑞達(dá)生物股份有限公司, 濟(jì)南 250101; 2. 上海交通大學(xué)設(shè)計(jì)學(xué)院, 上海 200240)

作為皮膚的最外層,表皮是皮膚屏障功能的主要承擔(dān)者,對(duì)維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)十分重要。皮膚細(xì)胞的正常增殖和分化、角化包膜的完整性、細(xì)胞間脂質(zhì)的正常代謝等,都是維持皮膚屏障健康的關(guān)鍵因素,如屏障相關(guān)蛋白絲聚蛋白(Filaggrin, FLG)、兜甲蛋白(Loricrin, LOR)、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1(Transglutaminase, TGM1)和緊密連接蛋白1(Claudin, CLDN1)等。研究表明:FLG缺乏會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)紊亂、成熟延遲,同時(shí)造成角質(zhì)層細(xì)胞緊密度降低,細(xì)胞間滲透性增強(qiáng)和光保護(hù)作用下降,最終導(dǎo)致皮膚屏障受損[1];LOR缺乏會(huì)導(dǎo)致屏障機(jī)械完整性降低;TGM1缺乏會(huì)導(dǎo)致角化包膜形成異?；驘o法形成,引發(fā)皮膚病;CLDN1蛋白表達(dá)的異常會(huì)導(dǎo)致屏障滲透性改變,影響信號(hào)傳導(dǎo)途徑[2]。此外,CD44受體在表皮分化、脂質(zhì)合成和皮膚屏障功能中起著重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn),CD44受體可通過激活ROS-Akt信號(hào)通路參與氧化還原狀態(tài)的調(diào)控,CD44的缺失會(huì)降低Akt和mTOR的磷酸化,導(dǎo)致p21(細(xì)胞周期抑制物)及促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加以及抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)降低,造成細(xì)胞凋亡,還會(huì)對(duì)緊密連接蛋白的含量、定位及功能產(chǎn)生影響,造成屏障功能的受損[3-5],甚至加重慢性皮膚炎癥[6]。

紫外線(Ultraviolet, UV)是造成皮膚屏障損傷的常見因素之一,中波紫外線(Ultraviolet B, UVB)照射皮膚后,會(huì)造成皮膚中活性氧自由基(Reactive oxygen species, ROS)水平的升高以及抗氧化酶活性的降低。適度的ROS可作為信號(hào)分子,有利于細(xì)胞間的信息傳遞,幫助機(jī)體消滅惡性細(xì)胞及病原體,過量的ROS則會(huì)超出人體自身的清除速度,損害細(xì)胞膜脂及蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,造成細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng),引起機(jī)體內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式(Damage associated molecular patterns, DAMPs)產(chǎn)生和細(xì)胞因子釋放,激活多條信號(hào)通路,如炎癥反應(yīng)、屏障結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白表達(dá)異常、CD44受體蛋白表達(dá)異常等,影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、代謝過程,對(duì)皮膚屏障造成損傷[7-9]。

薰衣草精油(Lavender essential oil, LEO)含有芳樟醇、乙酸芳樟酯、薰衣草醇、乙酸薰衣草酯、α-蒎烯、1,8-桉葉油醇等多種脂溶性小分子活性成分,具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗焦慮等多重藥理活性[10-11]。近年來,LEO被廣泛應(yīng)用于護(hù)膚品中,但多作為芳香劑使用;而事實(shí)上,LEO滲透性極好,可快速滲透皮膚并發(fā)揮作用[12-14],作為功效性護(hù)膚成分具有極大的應(yīng)用潛力,但目前對(duì)LEO護(hù)膚作用機(jī)制的研究并不深入。

3D表皮皮膚模型具有高度類似于天然皮膚的組織結(jié)構(gòu)、生理及代謝功能,可以更好地模擬物質(zhì)在表皮上的代謝及其作用機(jī)制。采用3D表皮皮膚模型,通過UVB輻照建立皮膚屏障紫外損傷模型,探討LEO對(duì)皮膚屏障紫外損傷的保護(hù)機(jī)制,旨在為L(zhǎng)EO在該領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

3D表皮皮膚模型(EpiKutis?)購(gòu)自廣東博溪生物科技有限公司,批號(hào)為ES220303;原代角質(zhì)形成細(xì)胞購(gòu)自廣東博溪生物科技有限公司,從人包皮組織提取分離得到的原代細(xì)胞;LEO由2020年6月自新疆伊犁地區(qū)采摘的狹葉薰衣草(Lavandulaangustifolia)花、莖部分,通過水蒸氣蒸餾法提取制得,購(gòu)自新疆伊帕爾汗香料股份有限公司;EpiGrowth培養(yǎng)液購(gòu)自廣東博溪生物科技有限公司;PBS購(gòu)自博士德公司;MTT、地塞米松、維生素E、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma公司;IL-1α ELISA 試劑盒、PGE2 ELISA 試劑盒、TNF-α ELISA 試劑盒購(gòu)自Abcam公司;CuZn/Mn-SOD活性檢測(cè)試劑盒(WST-8法)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒、蘇木素染色液、伊紅染色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;多聚甲醛購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;熒光染料購(gòu)自Takara公司;Epoch酶標(biāo)儀為BioTek公司產(chǎn)品;BX53正置顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品;DM2500熒光顯微鏡為L(zhǎng)eica公司產(chǎn)品;7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀為美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品;UVB輻照設(shè)備燈架為自制裝置,UVB紫外燈管(型號(hào):PL-S 9W/01/2P)為PHILIPS公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 LEO成分分析

將乙醇與正己烷以1∶1的體積比進(jìn)行混合,混合均勻后加入LEO,稀釋體積比比例為100∶1。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)方法對(duì)LEO進(jìn)行成分檢測(cè)分析。色譜條件:DB-WAX色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度260 ℃;載氣為氦氣(純度>99.999%),流速1 mL/min;進(jìn)樣量1 μL;分流比30∶1;升溫程序:初始柱溫為50 ℃,維持3 min,隨后以4 ℃/min升至120 ℃,維持10 min,再以2 ℃/min升至220 ℃,維持2 min。質(zhì)譜條件:四級(jí)桿溫度150 ℃,離子源溫度230 ℃;EI源電離能量70 eV;全掃描質(zhì)量范圍35～450 amu,掃描方式為全掃描,數(shù)據(jù)庫(kù)為NIST14譜庫(kù)。

1.2.2 細(xì)胞毒性檢測(cè)

在朱永剛等[15]實(shí)驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上,稍作修改。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的原代角質(zhì)形成細(xì)胞以8×103個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中,樣品體積分?jǐn)?shù)為0.008%～1%,稀釋9個(gè)濃度梯度,采用四甲基偶氮唑藍(lán)(Methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)比色法檢測(cè)LEO對(duì)原代角質(zhì)形成細(xì)胞活力的影響。

1.2.3 工作液配制

7 μg/mL 維生素E(Vitamin E, VE)工作液、質(zhì)量比為0.01%的地塞米松(Dexamethasone, DXM)工作液及體積比為1%/0.1%的LEO工作液均先以DMSO為溶劑,稀釋為一定濃度的母液,再以EpiGrowth培養(yǎng)液為溶劑將母液稀釋至相應(yīng)作用濃度。

1.2.4 組織形態(tài)檢測(cè)

將3D表皮皮膚模型預(yù)先轉(zhuǎn)移至6孔板中,實(shí)驗(yàn)設(shè)置未給藥+UVB未照射組、未給藥+UVB照射組、質(zhì)量比為0.01%的DXM+UVB照射組及體積比為0.1%/1%的LEO+UVB照射組,每組3個(gè)平行,將不同組別工作液分別加于模型表面,除未給藥+UVB未照射組外,其余組別采用600 mJ/cm2劑量的UVB進(jìn)行輻照(輻照強(qiáng)度為2.38 mW/cm2,照射時(shí)間為4 min 12 s,輻照劑量=輻照強(qiáng)度×輻照時(shí)間),于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)孵育24 h。孵育結(jié)束后,清洗模型表面殘留的受試物。將用于組織形態(tài)檢測(cè)的模型環(huán)切取下,使用4%多聚甲醛固定24 h 后,進(jìn)行蘇木精-伊紅 (Hematoxylin-Eosin, H&E )染色處理,顯微鏡下拍照觀察,采集圖片。

1.2.5 ROS含量檢測(cè)

將3D表皮皮膚模型預(yù)先轉(zhuǎn)移至6孔板中,實(shí)驗(yàn)設(shè)置未給藥+UVB未照射組、未給藥+UVB照射組、7 μg/mL VE+UVB照射組及體積比為0.1%的LEO+UVB照射組,每組3個(gè)平行,將不同組別工作液分別加于模型表面,于37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h。孵育結(jié)束后,將3D表皮皮膚模型轉(zhuǎn)移至含有20 μmol/L DCFH-DA探針的工作液中,于培養(yǎng)箱(5% CO2,37 ℃)孵育1 h。用PBS的洗瓶沖洗模型底部,將清洗后的模型轉(zhuǎn)移至含有PBS的6孔板中,除未給藥+UVB未照射組外,其余組別以600 mJ/cm2劑量的UVB進(jìn)行輻照(輻照強(qiáng)度為2.38 mW/cm2,照射時(shí)間為4 min 12 s,輻照劑量=輻照強(qiáng)度×輻照時(shí)間)。UVB輻照結(jié)束后,立即切取模型,置于1.5 mL EP管中,并在管中加1 mL 4%多聚甲醛固定液,進(jìn)行冰凍切片,熒光顯微鏡下拍照觀察,采集圖片并分析。

1.2.6 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)酶活力檢測(cè)

將3D表皮皮膚模型預(yù)先轉(zhuǎn)移至6孔板中,實(shí)驗(yàn)組別設(shè)置同1.2.5節(jié),每組3個(gè)平行,將不同組別工作液分別加于模型表面,除未給藥+UVB未照射組外,其余組別采用600 mJ/cm2劑量的UVB進(jìn)行輻照(輻照強(qiáng)度為2.38 mW/cm2,照射時(shí)間為4 min 12 s,輻照劑量=輻照強(qiáng)度×輻照時(shí)間),于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)孵育24 h。孵育結(jié)束后,清洗模型表面殘留的受試物后,收集模型,根據(jù)BCA及SOD試劑盒的操作說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 炎癥因子檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置未給藥+UVB未照射組、未給藥+UVB照射組、質(zhì)量比為0.01%的DXM+UVB照射組及體積比為0.1%的LEO+UVB照射組,每組3個(gè)平行,處理方法同1.2.6節(jié),清洗模型表面殘留的受試物后,收集模型培養(yǎng)液于EP管中,置于-80 ℃冰箱冷凍保存,根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)試劑盒的操作說明書對(duì)白介素1α(Interleukin 1α, IL-1α)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α, TNF-α)、前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 屏障相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)分組與模型處理方法同1.2.7節(jié),清洗模型表面殘留的受試物后,將用于檢測(cè)的模型環(huán)切取下,用 4%多聚甲醛進(jìn)行固定處理,固定24 h后,對(duì)屏障相關(guān)蛋白FLG和LOR進(jìn)行免疫熒光(Immunofluorescence, IF)檢測(cè); LEO對(duì)屏障相關(guān)蛋白TGM1和CLDN1的影響采用免疫組化(Immunohistochemisty, IHC)法進(jìn)行檢測(cè),分別在熒光顯微鏡或顯微鏡下拍照觀察,每組采集3個(gè)視野照片,采用ipwin32圖片分析軟件對(duì)圖片中的目標(biāo)信號(hào)進(jìn)行積分光密度(Integral optical density, IOD)分析,計(jì)算平均IOD值,以未給藥+UVB未照射組為基準(zhǔn),計(jì)算相對(duì)IOD平均值來表征蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.9 CD44受體表達(dá)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)分組與模型處理方法同1.2.7節(jié),清洗模型表面殘留的受試物后,測(cè)定不同分組對(duì)CD44受體表達(dá)的影響,根據(jù)IHC法的具體操作步驟進(jìn)行操作,在顯微鏡下拍照觀察,每組采集3個(gè)視野照片,采用ipwin32圖片分析軟件對(duì)圖片中的目標(biāo)信號(hào)進(jìn)行IOD分析,計(jì)算平均IOD值,以未給藥+UVB未照射組為基準(zhǔn),計(jì)算相對(duì)IOD平均值來表征蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 LEO成分分析

LEO的活性主要取決于其活性成分,而活性成分的含量受品種、提取時(shí)期、部位、地域、提取方式等影響[16-19]。通過GC-MS檢測(cè)分析LEO的成分組成,共鑒定出51種化學(xué)成分,占檢出總成分的99.965 7%,具體成分及含量如表1所示,主要成分乙酸芳樟酯(39.348 2%)、芳樟醇(28.073 7%)、乙酸薰衣草酯(5.339 0%)、樟腦(0.215 4%)的相對(duì)含量均在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 12653—2008規(guī)定的含量范圍之內(nèi)。

表1 LEO的GC-MS成分鑒定及相對(duì)含量結(jié)果Table 1 The results of LEO components identification and relative contents by GC-MS

2.2 LEO對(duì)原代角質(zhì)形成細(xì)胞活力的影響

LEO對(duì)原代角質(zhì)形成細(xì)胞的活力影響如圖1所示,LEO在體積比為0.1%的濃度范圍內(nèi),原代角質(zhì)形成細(xì)胞相對(duì)活力均在80%以上,未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。

圖1 LEO對(duì)原代角質(zhì)形成細(xì)胞的活力影響Figure 1 The effects of LEO on keratinocyte cell viability

為進(jìn)一步觀察LEO對(duì)3D表皮皮膚模型組織形態(tài)的影響,且綜合考慮到3D表皮皮膚模型的皮層結(jié)構(gòu)、滲透性及實(shí)際應(yīng)用情況,選擇體積分?jǐn)?shù)(下同)為0.1%及1%的LEO繼續(xù)觀察其對(duì)UVB誘導(dǎo)的皮膚屏障損傷模型的組織形態(tài)改善情況。

2.3 LEO對(duì)3D表皮皮膚模型組織形態(tài)的影響

不同處理對(duì)3D表皮皮膚模型組織形態(tài)影響結(jié)果及曬傷細(xì)胞陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2所示,與未給藥+UVB未照射組相比,經(jīng)UVB輻照后,3D表皮皮膚模型的角質(zhì)層結(jié)構(gòu)松散,表皮活細(xì)胞層厚度減小,活細(xì)胞層出現(xiàn)細(xì)胞核皺縮現(xiàn)象,基底層細(xì)胞數(shù)量減少,曬傷細(xì)胞大幅增多,說明紫外線會(huì)對(duì)皮膚組織造成損傷。與未給藥+UVB照射組相比,0.1%的LEO以及陽(yáng)性對(duì)照0.01% DXM均能顯著改善紫外線造成的組織損傷,3D表皮皮膚模型的角質(zhì)層松散程度降低,活細(xì)胞層厚度增加,活細(xì)胞層細(xì)胞核皺縮和基底層細(xì)胞數(shù)量減少的情況明顯改善,細(xì)胞空泡化減少,曬傷細(xì)胞數(shù)顯著降低,說明0.1%的LEO對(duì)UVB造成的3D表皮皮膚模型的組織損傷具有一定的保護(hù)效果。1%的LEO對(duì)紫外線造成的皮膚組織損傷無明顯作用,可能由于LEO含量過高,對(duì)細(xì)胞活力存在一定影響,故選擇體積分?jǐn)?shù)為0.1%的LEO進(jìn)行后續(xù)保護(hù)作用機(jī)制的探究。

(a)3D表皮皮膚模型組織形態(tài)H&E染色圖;(b)不同處理對(duì)3D表皮皮膚模型曬傷細(xì)胞陽(yáng)性率的影響結(jié)果;##為P<0.01, vs.未給藥+UVB未照射組;** 為P<0.01, vs.未給藥+UVB照射組。圖2 不同處理對(duì)3D表皮皮膚模型組織形態(tài)影響結(jié)果Figure 2 The results of 3D epidermal skin model tissue morphology with different treatments

2.4 LEO下調(diào)UVB誘導(dǎo)的3D表皮皮膚模型的ROS水平

圖3為不同處理對(duì)3D表皮皮膚模型ROS水平的影響結(jié)果,與未給藥+UVB未照射組相比,UVB刺激后會(huì)導(dǎo)致3D表皮皮膚模型的ROS水平顯著增加(P<0.01),與未給藥+UVB照射組相比,0.1%的LEO以及陽(yáng)性對(duì)照7 μg/mL VE處理均能顯著降低ROS的水平(P<0.01),減少氧化應(yīng)激反應(yīng)。

##為P<0.01, vs.未給藥+UVB未照射組;** 為P<0.01, vs.未給藥+UVB照射組。圖3 不同處理對(duì)3D表皮皮膚模型ROS水平的影響結(jié)果Figure 3 The results of ROS levels in 3D epidermal skin models with different treatments

2.5 LEO抑制UVB誘導(dǎo)的3D表皮皮膚模型的SOD酶活力下降

不同處理對(duì)3D表皮皮膚模型SOD酶活力的影響結(jié)果如圖4所示,與未給藥+UVB未照射組相比,UVB照射后,可引起3D表皮皮膚模型的SOD酶活力顯著降低(P<0.01)。與未給藥+UVB照射組相比,LEO以及陽(yáng)性對(duì)照7 μg/mL VE處理均能顯著提升SOD酶活力(P<0.01),且LEO的效果優(yōu)于VE,具有較強(qiáng)的抗氧化性,可提高皮膚自身抗氧化能力,減少氧化損傷。

##為P<0.01, vs.未給藥+UVB未照射組;** 為P<0.01, vs.未給藥+UVB照射組。圖4 不同處理對(duì)3D表皮皮膚模型SOD酶活力的影響結(jié)果Figure 4 The results of SOD enzyme activity in 3D epidermal skin models with different treatments

2.6 LEO下調(diào)UVB誘導(dǎo)的3D表皮皮膚模型的炎癥因子表達(dá)

不同處理對(duì)炎癥因子蛋白表達(dá)量的影響結(jié)果如圖5所示,UVB刺激后會(huì)導(dǎo)致3D表皮皮膚模型的IL-1α[圖5(a)]、TNF-α[圖5(b)]及PGE2[圖5(c)]蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.01)。相較未給藥+UVB照射組,LEO和陽(yáng)性對(duì)照0.01% DXM處理均可顯著降低UVB誘導(dǎo)的IL-1α、TNF-α及PGE2表達(dá)量的增加(P<0.05),LEO效果略遜于DXM,表明LEO可通過減少炎癥因子的表達(dá)來降低UVB誘導(dǎo)的皮膚屏障損傷。

(a)IL-1α蛋白表達(dá)量;(b)TNF-α蛋白表達(dá)量;(c)PGE2表達(dá)量;##為P<0.01, vs.未給藥+UVB未照射組;* 為P<0.05,** 為P<0.01, vs. 未給藥+UVB照射組。圖5 不同處理對(duì)3D表皮皮膚模型炎癥因子表達(dá)量的影響結(jié)果Figure 5 The results of inflammatory factor in 3D epidermal skin model with different treatments

2.7 LEO抑制UVB誘導(dǎo)的3D表皮皮膚模型的屏障相關(guān)蛋白表達(dá)下降

不同處理對(duì)屏障相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響如圖6所示,與未給藥+UVB未照射組相比,UVB輻照下,4種屏障相關(guān)蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.01),表明UVB對(duì)皮膚屏障結(jié)構(gòu)有一定的損傷作用;相較未給藥+UVB照射組,LEO及DXM處理均能顯著提高屏障相關(guān)蛋白TGM1、FLG、LOR和CLDN1的表達(dá)量(P<0.01);其中,對(duì)LOR和CLDN1,LEO的促進(jìn)效果優(yōu)于DXM。表明LEO對(duì)UVB誘導(dǎo)的皮膚屏障結(jié)構(gòu)損傷具有一定的保護(hù)效果。

(a)TGM1及CLDN1免疫組化代表性結(jié)果圖;(b)LOR及FLG免疫熒光代表性結(jié)果圖;(c)4種屏障相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量;##為P<0.01, vs.未給藥+UVB未照射組;** 為P<0.01, vs.未給藥+UVB照射組。圖6 不同處理對(duì)3D表皮皮膚模型屏障相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響結(jié)果Figure 6 The results of barrier-related proteins expression in 3D epidermal skin models with different treatments

2.8 LEO抑制UVB誘導(dǎo)的3D表皮皮膚模型的CD44受體表達(dá)下降

不同處理對(duì)3D表皮皮膚模型CD44受體蛋白表達(dá)量的影響結(jié)果如圖7所示,與未給藥+UVB未照射組相比,UVB輻照可引起3D表皮皮膚模型中CD44受體蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。相較模型組,LEO以及陽(yáng)性對(duì)照DXM處理均能顯著提高CD44受體蛋白的表達(dá)量(P<0.01),且LEO效果優(yōu)于DXM。LEO促進(jìn)受損皮膚屏障中CD44受體蛋白表達(dá)量恢復(fù)至正常水平,有利于調(diào)節(jié)氧化平衡,減少皮膚炎癥,促進(jìn)表皮正常分化,減少UVB誘導(dǎo)的皮膚屏障損傷。

(a)CD44免疫組化代表性結(jié)果圖;(b)CD44蛋白相對(duì)表達(dá)量;##為P<0.01, vs.未給藥+UVB未照射組;** 為P<0.01, vs.未給藥+UVB照射組。圖7 不同處理對(duì)3D表皮皮膚模型CD44受體蛋白表達(dá)量的影響結(jié)果Figure 7 The results of CD44 receptor expression in 3D epidermal skin models with different treatments

3 討論與結(jié)論

以上研究提示,LEO對(duì)多種條件誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)均有一定的抑制作用,基于現(xiàn)有研究結(jié)果推斷LEO的生物活性可能與其主要成分芳樟醇關(guān)系較大,其他活性成分如1,8-桉葉油醇、月桂烯、檸檬烯、α-蒎烯等也起到重要作用。但上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果基于的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c皮膚組織相差較大,缺少皮膚滲透吸收過程及細(xì)胞代謝過程,LEO是否在皮膚上也能起到與上述研究相似的結(jié)果還有待驗(yàn)證。在本研究中,我們通過UVB誘導(dǎo)3D表皮皮膚模型建立皮膚屏障紫外損傷模型,從LEO對(duì)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、屏障結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白以及CD44受體的影響,探究LEO對(duì)皮膚屏障紫外損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。研究結(jié)果提示,0.1%的LEO對(duì)UVB誘導(dǎo)的皮膚屏障損傷有一定的保護(hù)作用,其機(jī)制可能是LEO通過減少ROS的產(chǎn)生并提高SOD酶活力,參與氧化還原平衡調(diào)控;通過抑制炎癥因子IL-1α、TNF-α和PGE2的表達(dá),減輕炎癥反應(yīng);促進(jìn)屏障相關(guān)蛋白TGM1、FLG、LOR和CLDN1的正常表達(dá),保障屏障結(jié)構(gòu)的完整性與強(qiáng)度。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),LEO可抑制UVB誘導(dǎo)的皮膚CD44受體表達(dá)的減少。CD44受體的缺乏會(huì)激活氧化應(yīng)激、加重炎癥反應(yīng)、影響表皮正常分化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等,是皮膚屏障損傷的重要原因之一。LEO對(duì)UVB誘導(dǎo)的受損皮膚屏障中氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、屏障蛋白表達(dá)的調(diào)控是否與CD44受體相關(guān),還有待進(jìn)一步探索。