林興雨, 宋 南

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 鄭州 450002)

近年來,隨著下一代測序技術(shù)的快速發(fā)展,線粒體基因組測序已成為一種方便、快速的測序方法。鱗翅目昆蟲線粒體基因組通常為一個(gè)環(huán)狀、閉合、雙鏈的DNA,由37個(gè)相對(duì)保守的基因構(gòu)成,其中,包括13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因(PCGs)、22個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNAs)、2個(gè)核糖體RNA(rrnL和rrnS)以及1個(gè)非編碼控制區(qū)(non-coding control region)。昆蟲線粒體基因組因其具有結(jié)構(gòu)簡單和基因排列順序相對(duì)保守等特點(diǎn)被廣泛用于昆蟲系統(tǒng)發(fā)育分析[1-3]。

光眉刺蛾Narosafulgens又稱褐點(diǎn)眉刺蛾,屬于鱗翅目Lepidoptera斑蛾總科Zygaenoidea刺蛾科Limacodidae。迄今為止,刺蛾科包含301屬1 672個(gè)已知種,在我國各地廣泛分布[4]。它們的體背具有五顏六色的毒毛,用來保護(hù)它們免受天敵的傷害[5]。刺蛾科昆蟲以多種果樹及園藝植物的葉片為食,嚴(yán)重時(shí)可對(duì)農(nóng)林業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失,是果樹及園藝植物的重要害蟲[6]。目前,GenBank中公布的刺蛾科線粒體基因組數(shù)據(jù)僅有8條。有限的線粒體基因組數(shù)據(jù)不利于人們從線粒體基因組角度去研究刺蛾科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。為更好地了解刺蛾科的線粒體基因組特征以及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,本研究利用下一代測序技術(shù)獲得光眉刺蛾的線粒體基因組全序列,分別對(duì)其線粒體基因組序列進(jìn)行注釋,并對(duì)堿基組成、密碼子使用頻率的情況以及tRNA基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)等線粒體基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行詳細(xì)分析和預(yù)測。

此外,結(jié)合已經(jīng)公布的斑蛾總科的16個(gè)物種作為內(nèi)群,分別選擇木蠹蛾科和網(wǎng)蛾科各1個(gè)物種作為外群。本研究構(gòu)建線粒體基因組中13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的核苷酸和氨基酸序列矩陣以及第1、2密碼子的核苷酸序列矩陣,分別利用最大似然法(Maximum likelihood)和貝葉斯法(Bayesian inference),重建刺蛾科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,探究光眉刺蛾的系統(tǒng)發(fā)育位置。為更好地理解刺蛾科和光眉刺蛾的系統(tǒng)發(fā)育提供線粒體基因組數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

標(biāo)本采集和DNA提取。供試光眉刺蛾于2022年7月采集于河南省平頂山市畫眉谷(33°47′N, 112°19′E)。將采集到的光眉刺蛾泡在無水乙醇中,存放到河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院標(biāo)本館并置于-20 ℃冰箱保存直到用于DNA提取。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用天根公司的動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit,中國)提取光眉刺蛾胸部肌肉的總DNA。經(jīng)NanoDrop 2000分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行總DNA的質(zhì)量和濃度檢測。

1.2 方法

1.2.1 下一代測序及線粒體基因組的組裝

將質(zhì)量檢測合格且質(zhì)量濃度大于20 ng/μL的高質(zhì)量DNA送至河南微智因生物科技有限公司構(gòu)建350 bp的小片段文庫并進(jìn)行高通量測序,基于MGI 2000測序平臺(tái)進(jìn)行雙末端(Paired-end,PE)測序。最后,將下機(jī)的原始數(shù)據(jù)去除接頭和質(zhì)控。利用GetOrganelle v1.7.5.2軟件[7]進(jìn)行線粒體基因組的組裝和拼接,從而得到完整的線粒體基因組序列。

1.2.2 線粒體基因組、注釋和分析

將組裝得到的光眉刺蛾的線粒體基因組數(shù)據(jù)在MITOS[8]網(wǎng)站上進(jìn)行初步的基因注釋,具體參數(shù)設(shè)置:Genetic Code:05-inverterbrate;Reference:RefSeq 89 Metazoa,其余均按照MITOS默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行設(shè)置。22個(gè)tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)通過MITOS預(yù)測。然后,通過近緣種線粒體基因組的序列比對(duì),手動(dòng)矯正13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因邊界。將注釋好的線粒體基因組序列上傳至GenBank,得到光眉刺蛾的GenBank登錄號(hào):OP919326。利用MEGA 7.0[9]軟件分析光眉刺蛾線粒體基因組的蛋白質(zhì)編碼基因的堿基組成以及密碼子的使用頻率情況。利用AT-skew=(A-T)/(A+T)和GC-skew=(G-C)/(G+C) 公式分別計(jì)算AT偏斜和GC偏斜。

1.2.3 多序列比對(duì)

利用MAFFT軟件對(duì)蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行序列比對(duì)[10]。使用trimAl v1.4對(duì)模糊比對(duì)的序列進(jìn)行修剪和去除[11]。最后,運(yùn)用FASconCAT-G_v1.04進(jìn)行串聯(lián)矩陣[12]。用于系統(tǒng)發(fā)育分析的數(shù)據(jù)矩陣包括:13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的核苷酸序列構(gòu)建的數(shù)據(jù)矩陣用于最大似然法分析;13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的氨基酸序列構(gòu)建的數(shù)據(jù)矩陣用于貝葉斯法分析;13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的第1、2密碼子的核苷酸序列構(gòu)建的數(shù)據(jù)矩陣用于最大似然法和貝葉斯法分析。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用測序獲得的光眉刺蛾線粒體基因組,并結(jié)合GenBank中下載的17種昆蟲(15種斑蛾總科昆蟲,以及木蠹蛾和網(wǎng)蛾科各1個(gè)物種)的線粒體基因組序列(表1)的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因構(gòu)建的3個(gè)數(shù)據(jù)矩陣。通過最大似然法和貝葉斯法構(gòu)建斑蛾總科的系統(tǒng)發(fā)育樹。利用 IQ-TREE 2.0.6[13]進(jìn)行最大似然法分析:由軟件自動(dòng)篩選最適模型為GTR+F+I+G4模型,系統(tǒng)發(fā)育樹的節(jié)點(diǎn)支持率通過自舉檢驗(yàn)置信度進(jìn)行評(píng)估(運(yùn)行次數(shù)設(shè)置10 000),構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用MrBayes v3.2 進(jìn)行貝葉斯法分析[14]。運(yùn)算包含4條蒙特卡羅馬爾柯夫鏈(Markov Chain Monte Carlo,MCMC)同時(shí)運(yùn)行10 000 000代,每1 000代抽樣一次,丟棄25%,構(gòu)建多數(shù)一致樹。

表1 本研究中用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的物種樣本信息Table 1 Species sample information used in the phylogenetic tree construction in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體基因組分析

光眉刺蛾的線粒體基因組結(jié)構(gòu)圖利用OGDRAW Version 1.1繪制[15](圖1)。光眉刺蛾的線粒體全基因組長度為15 296 bp,其中,A+T含量為80.30%,G+C含量為19.70%,其線粒體基因組包含37個(gè)基因和1個(gè)非編碼控制區(qū),H鏈(Heavy strand)編碼23個(gè)基因,分別包括9個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因和14個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因;L鏈(Light strand)編碼14個(gè)基因,分別包含4個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因和8個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因以及2個(gè)核糖體RNA基因。此外,控制區(qū)位于rrnS和trnM之間,長度為363 bp(表2)。光眉刺蛾的整個(gè)線粒體基因組、13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、核糖體RNA和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA的AT含量為77.2%至85%不等,具有較高的AT含量。AT偏斜和GC偏斜分別為-0.182～0.038和-0.209～0.453(表3)。

圖1 光眉刺蛾線粒體基因組結(jié)構(gòu)Figure 1 Structure of the N. fulgens mitochondrial genome

表2 光眉刺蛾線粒體基因組注釋Table 2 Annotation of the mitochondrial genome of N. fulgens

表3 光眉刺蛾的核苷酸組成和偏斜Table 3 Nucleotide composition and skewness of the N. fulgens mitochondrial genome

2.2 蛋白質(zhì)編碼基因分析

光眉刺蛾線粒體基因組的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的序列全長為11 091 bp,其中,A+T含量為78.31%,G+C含量為21.39%。H鏈上的9個(gè)蛋白質(zhì)基因序列總長為6 861 bp,A+T含量為77.2%。L鏈上的4個(gè)蛋白質(zhì)基因序列總長為4 302 bp,A+T含量為80.2%。光眉刺蛾的蛋白質(zhì)編碼基因具有較高的AT含量。13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的起始密碼子除cox1利用CGA開頭外,剩下的12個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的起始密碼子都是以典型ATN開頭,終止密碼子除cox2和nad4以不完整的T結(jié)尾外,剩下的11個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的終止密碼子都是以TAA和TAG作為結(jié)尾。在所有蛋白質(zhì)編碼基因的氨基酸使用中,蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)有較高的使用頻率,它們平均使用的比例從多到少的順序依次為41.14%、39.16%、11.90%和7.78%。其余氨基酸均未使用。光眉刺蛾線粒體基因組的相對(duì)密碼子使用頻率見表4。

表4 光眉刺蛾線粒體基因組的相對(duì)密碼子使用頻率Table 4 Relative synonymous codon usage of the mitochondrial genome of N. fulgens

2.3 tRNA和rRNA基因分析

光眉刺蛾線粒體基因組的22個(gè)tRNA基因的序列長度為64～71 bp。trnR和trnS2基因最短為64 bp,trnK基因最長為71 bp。其中,16個(gè)tRNA基因位于H鏈,序列全長為926 bp。A+T含量為82%。6個(gè)tRNA位于L鏈,序列全長為532 bp,A+T含量為82.1%。除trnS1因缺少二氫尿嘧啶臂(DHU臂)導(dǎo)致形成一個(gè)簡單的環(huán),不能形成完整的三葉草結(jié)構(gòu),剩下的21個(gè)tRNA基因均能形成完整的三葉草結(jié)構(gòu)。此外,trnS1的反密碼子不是常見的GCU而是UCG(圖2)。光眉刺蛾的線粒體基因組rrnL的全長為1 335 bp,A+T含量為85.24%,G+C含量為14.76%。rrnS的全長為732 bp,A+T含量為84.70%,G+C含量為15.30%。

圖2 光眉刺蛾22 個(gè) tRNA基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)Figure 2 Secondary structure of 22 tRNAs genes of N. fulgens

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

以斑蛾總科的16個(gè)物種作為內(nèi)群,并選擇木蠹蛾科和網(wǎng)蛾科各1個(gè)物種作為外群,基于它們的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的核苷酸和氨基酸序列矩陣以及第1、2密碼子的核苷酸序列矩陣,分別利用最大似然法和貝葉斯法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖3和圖4所示,兩種不同的系統(tǒng)分析方法基于3種不同數(shù)據(jù)矩陣構(gòu)建的樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相同。斑蛾總科內(nèi)的科級(jí)別系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系顯示:刺蛾科和斑蛾科分別為單系群且有較高的節(jié)點(diǎn)支持值(BS≥91,PP=1)。此外,兩種系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果都支持本文測定的光眉刺蛾與龜形小刺蛾N.nigrisigna互為姐妹群,且在該分支上最大似然法與貝葉斯法都顯示出較高的節(jié)點(diǎn)支持率(BS=100,PP=1)。利用 Kimura-2-Parameter 模型計(jì)算刺蛾科8個(gè)物種(Iragoidesfasciata、Latoiahilarata、Monemaflavescens、光眉刺蛾N.fulgens、龜形小刺蛾N.nigrisigna、Parasaconsocia、Quasithoseasythoffi和Thoseasinensis)之間的種間遺傳距離,結(jié)果顯示:光眉刺蛾與龜形小刺蛾的遺傳距離最近,為0.115;光眉刺蛾與M.flavescens、L.hilarata、I.fasciata、P.consocia和Q.sythoffi的遺傳距離分別為0.171、0.173、0.174、0.175和0.179;與T.sinensis的遺傳距離最遠(yuǎn)為0.181(表5)。種間遺傳距離與系統(tǒng)發(fā)育樹所顯示的親緣關(guān)系支持光眉刺蛾與龜形小刺蛾互為姐妹群。

圖3 基于13個(gè)蛋白編碼基因的核苷酸和氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree inferred from the nucleotide and amino acid sequences of 13 protein-coding genes

圖4 基于13個(gè)蛋白編碼基因的核苷酸序列第1、2密碼子構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 Phylogenetic tree inferred from codon 1 and 2 of the nucleotide sequences of 13 protein-coding genes

表5 光眉刺蛾與刺蛾科昆蟲的線粒體蛋白質(zhì)編碼基因基于Kimura-2-Parameter模型的遺傳距離Table 5 Pairwise genetic distances of mitochondrial protein-coding gene sequences between and other species of Limacodidae based N. fulgens on Kimura-2-Parameters

3 討論與結(jié)論

盡管斑蛾總科的昆蟲在全世界分布廣泛并且具有重要的經(jīng)濟(jì)意義,但對(duì)該類群的系統(tǒng)發(fā)育研究仍較少。利用下一代測序技術(shù)獲得完整的光眉刺蛾線粒體基因組全序列,分別預(yù)測和分析光眉刺蛾的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和線粒體基因組結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)。光眉刺蛾線粒體基因組全長為15 296 bp,在昆蟲的線粒體基因組長度范圍內(nèi)[16]。光眉刺蛾的線粒體基因組的37個(gè)基因的排列順序與鱗翅目昆蟲線粒體基因組排列順序(trnM-trnI-trnQ)一致[17-18]。此外,光眉刺蛾除trnS1基因因缺少二氫尿嘧啶臂(DHU臂)導(dǎo)致不能形成穩(wěn)定的三葉草結(jié)構(gòu)外,其余轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因均能形成完整的三葉草結(jié)構(gòu)。這種現(xiàn)象在其他昆蟲中也有出現(xiàn)[19-26]。

種間遺傳距離與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果都支持光眉刺蛾與龜形小刺蛾有較近的親緣關(guān)系。這可能是由于在傳統(tǒng)的形態(tài)分類中,它們同歸為Narosa屬且都是植食性昆蟲,生活習(xí)性基本相同。

本研究結(jié)合已公布的斑蛾總科的線粒體基因組數(shù)據(jù),研究斑蛾總科內(nèi)部的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。使用斑蛾總科的16個(gè)物種作為內(nèi)群,木蠹蛾科和網(wǎng)蛾科的各1個(gè)物種作為外群的線粒體基因組的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的核苷酸和氨基酸序列矩陣以及第1、2密碼子的核苷酸序列矩陣,分別利用最大似然法和貝葉斯法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示,刺蛾科和網(wǎng)蛾科分別形成單系群且有較高的節(jié)點(diǎn)支持值。這一結(jié)果與Epstein等[27]基于成蟲和幼蟲的形態(tài)特征、Peng等[28]基于線粒體基因組數(shù)據(jù),利用谷蛾科的2個(gè)物種,刺蛾科的2個(gè)物種,卷蛾科的3個(gè)物種作為內(nèi)群,Thitarodespui和Hepialusxiaojinensis作為外群,通過鄰接法Neighbor Joining (NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、Zhang等[29]基于線粒體基因組數(shù)據(jù)利用貝葉斯法和最大似然法重建的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及Bian等[16]基于13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的線粒體基因組數(shù)據(jù)利用最大似然法和貝葉斯法重建的鱗翅目的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系結(jié)果一致,支持刺蛾科為單系群。

研究利用下一代測序技術(shù)獲得了光眉刺蛾的線粒體全基因組,預(yù)測和分析光眉刺蛾的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及線粒體基因組等特點(diǎn),豐富了刺蛾科的線粒體基因組數(shù)據(jù),證實(shí)光眉刺蛾與龜形小刺蛾的姐妹群關(guān)系,為后續(xù)斑蛾總科的系統(tǒng)發(fā)育以及光眉刺蛾的種群遺傳學(xué)等研究提供線粒體基因組數(shù)據(jù)。