王 琦, 楊江偉,2, 許超麗,2, 周利斌, 張 寧,2, 司懷軍,2

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術(shù)學院, 蘭州 730070; 2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室, 蘭州 730070; 3. 中國科學院近代物理研究所生物物理室, 蘭州 730000)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈的多年生草本植物,16至19世紀馬鈴薯通過中國西北和華南地區(qū)傳入國內(nèi)[1]。馬鈴薯適應(yīng)生存環(huán)境能力強,種植品種類型多,單位面積產(chǎn)量高,既適合多種生態(tài)地區(qū)種植,又是抗旱、救災(zāi)的主要農(nóng)作物之一。現(xiàn)如今它已成為繼小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)和玉米(Zeamays)之后的第四大主要糧食作物[2]。馬鈴薯栽培品種為同源四倍體,具有高度雜合的基因組,存在嚴重阻礙遺傳分析與品質(zhì)改良的問題。主要表現(xiàn)在產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣、生長勢降低等方面[3]。目前,馬鈴薯野生資源的應(yīng)用和探索以及種質(zhì)資源的改良進展緩慢[4-6]。因此,馬鈴薯育種面臨巨大挑戰(zhàn)[7]。

輻射誘變是進行種質(zhì)資源創(chuàng)新的有效途徑之一[8],其中,高能重離子束作為輻照誘變育種技術(shù)中的一種新的誘變源,已被廣泛應(yīng)用于植物的誘變育種[9],比如水稻[10]、小麥[11]、玉米[12]、大豆(Glycinemax)[13]和甜高粱(Sorghumbicolor)[14]等。盡管重離子束輻照誘變技術(shù)已廣泛應(yīng)用于許多糧食作物的品種改良[15],然而將重離子束輻照誘變應(yīng)用于馬鈴薯育種的報道卻很少。本研究以馬鈴薯品種‘新大坪’組培苗莖切段為材料,開展不同劑量的高能碳離子束輻照處理,對處理后的馬鈴薯組培苗莖切段生長指標、幼苗形態(tài)和生理指標等開展研究,以期確定適宜馬鈴薯品種‘新大坪’輻照誘變的劑量范圍,為進一步開展馬鈴薯輻照誘變育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以馬鈴薯品種‘新大坪’的無菌組培苗為供試材料,組培苗由甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術(shù)學院提供。

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯組培苗樣品制備

挑選生長情況一致的馬鈴薯品種‘新大坪 ’組培苗,在超凈工作臺上剪取只帶有一個腋芽的莖切段外植體(10～15 mm),迅速接入滅菌后含有基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基的直徑35 mm圓形培養(yǎng)皿中,每皿裝載20個樣品,并用Parafilm膜進行封口,做好標記后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d,后續(xù)進行高能碳離子束的輻射處理。

1.2.2 高能碳離子束輻射處理

將上述制備好的馬鈴薯組培苗莖切段樣品進行高能碳離子束輻照處理,使用高能碳離子束(12C6+)[中國科學院近代物理研究所蘭州重離子研究裝置(Heavy Ion Research Facility in Lanzhou,HIRFL)提供],束流能量為80.55 MeV/u,到達樣品的平均LET值為34 keV/μm,輻照的劑量率約為20 Gy/min,輻照劑量設(shè)置為10、20、30和40 Gy。對照組(0 Gy)保存放置的環(huán)境與處理組相同,但不進行輻照處理,整個輻照處理的過程均在室溫條件下進行。

1.2.3 馬鈴薯組培苗樣品的繼代培養(yǎng)

配制MS固體培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)pH值范圍為5.8～6.0,將調(diào)節(jié)好的培養(yǎng)基裝入150 mL的培養(yǎng)瓶中(每瓶50 mL),封口,121 ℃高壓滅菌20 min后備用。將經(jīng)高能碳離子束輻照后的馬鈴薯組培苗莖切段與對照組馬鈴薯組培苗莖切段在超凈工作臺進行擴繁,擴繁后剪取約1 cm的帶有1個葉片和腋芽的莖切段接種至MS固體培養(yǎng)基上,每個處理15瓶,每瓶5株。放入恒溫光照培養(yǎng)箱進行培養(yǎng),設(shè)定生長溫度(21±2) ℃,光照周期h/d=16 h/8 h,光照強度4 000 lx的生長條件,生長30 d后進行表型性狀和生物化學指標測定。

1.2.4 形態(tài)指標測定

觀察并記錄馬鈴薯組培苗莖切段輻照后30 d的生長情況以及變異情況,分析不同輻照劑量處理下的生理性狀差異。

致死率=死亡的組培苗莖切段數(shù)/輻照莖切段總數(shù)×100%

側(cè)芽形成率=生出側(cè)芽的組培苗莖切段數(shù)/輻照莖切段總數(shù)×100%

形態(tài)變異率=形態(tài)產(chǎn)生變化的組培苗莖切段數(shù)/輻照莖切段總數(shù)×100%

1.2.5 生理指標測定

輻照后30 d對不同高能碳離子束輻照處理后的幼苗地上部分取樣,未輻照組為對照,稱量鮮重后液氮快速冷凍,并置于-80 ℃冷凍保存,用于進行后續(xù)生理指標的測定分析。

粗酶液提取:稱取樣品放入預(yù)冷的研缽中,加入磷酸緩沖液(0.5 mol/L,pH 7.8),冰浴研磨,勻漿倒入離心管中,在10 000 r/min、4 ℃下離心20 min,上清液為粗酶液,將其分裝至離心管中,置于-20 ℃冷凍保存,用于后續(xù)試驗。

(1)超氧化物歧化酶活性測定。超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)活性測定采用氮藍四唑光化學還原法[16]。將磷酸緩沖液(0.5 mol/L,pH 7.8)、甲硫氨酸(130 mmol/L)、氮藍四唑(750 μmol/L)、乙二胺四乙酸二鈉(100 μmol/L)、核黃素(20 μmol/L)和水按15∶3∶3∶3∶3∶2.5配制混勻,得到SOD反應(yīng)液。將20 μL粗酶提取液和3 mL反應(yīng)液添加至5 mL離心管中。將參比管置于暗處,樣品與對照置于4 000 lx條件下光照30 min后于560 nm波長處測定吸光值,以參比管OD值調(diào)零,對SOD活性進行計算。SOD酶活力定義:將氮藍四唑(NBT)還原抑制到對照一半(50%)時,定義為1個酶活力單位(U)。

(2)過氧化物酶活性測定。過氧化物酶(Peroxidase,POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[16]。將磷酸緩沖液(0.1 mol/L,pH 6.0)50 mL和愈創(chuàng)木酚28 μL加熱攪拌使之完全溶解,冷卻后加入19 μL的30% H2O2溶液,得到POD反應(yīng)液。將10 μL粗酶提取液和3 mL POD反應(yīng)液置于比色皿中,在470 nm波長下每隔1 min測定一次吸光值。POD酶活力定義:每克樣品在每毫升反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為1個酶活力單位(U)。

(3)過氧化氫酶活性測定。過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性測定采用過氧化氫分解法[16]。磷酸緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.0)和H2O2(0.1 mol/L)按4∶1配制混勻,得到CAT反應(yīng)液。將50 μL粗酶提取液和2.5 mL CAT反應(yīng)液置于比色皿中,在240 nm波長下每隔1 min測定一次吸光值。CAT酶活力定義:每克樣品在反應(yīng)體系中每分鐘催化1 μmol H2O2降解定義為1個酶活力單位(U)。

(4)丙二醛含量測定。丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法[16]。少量NaOH溶液(1 mol/L )溶解0.6 g硫代巴比妥酸,用10%三氯乙酸定容至100 mL,得到MDA反應(yīng)液。將1 mL粗酶提取液和2 mL MDA反應(yīng)液混勻封口,置沸水浴15 min,迅速冷卻后在4 000 r/min、4 ℃下離心5 min,取上清液,在600、532和450 nm 3個波長下比色。

1.2.6 半致死劑量確定

在一定輻照劑量范圍內(nèi),提高輻照劑量可以提高植物的突變頻率,但也會增加植物的生理性損傷。輻照劑量的選擇應(yīng)該依據(jù)植物受到傷害程度低的前提下實現(xiàn)植物產(chǎn)生更多遺傳變異的原則,所以輻照誘變的適宜劑量一般采用半致死劑量(Lethal dose at 50 percent, LD50)較為合適。根據(jù)‘新大坪’組培苗莖切段在不同劑量照射下的存活率,利用SPSS軟件擬合線性回歸方程y=a+bx推導出LD50,以此確定‘新大坪’組培苗莖切段的半致死輻照劑量,從而找出高能碳離子束輻照馬鈴薯的適宜輻照劑量。

1.3 統(tǒng)計分析

利用Microsoft Excel 2019進行數(shù)據(jù)的整理和計算。使用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行Duncan顯著性分析,每組處理均設(shè)置3次生物學重復,采用Origin 2020進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同輻射劑量對馬鈴薯組培苗莖切段成活的影響

通過表1分析可知,經(jīng)過碳離子束輻照處理后的馬鈴薯品種‘新大坪 ’組培苗莖切段的致死率隨輻照劑量增加而提高。當輻照劑量為10 Gy時,‘新大坪’的致死率與對照組相比并無顯著差異且植株生長旺盛。當輻照劑量范圍為20～40 Gy時,‘新大坪’的致死率明顯高于對照組。輻照劑量為20 Gy時,‘新大坪’的生長良好,但輻照劑量在30～40 Gy時,植株的生長情況差。結(jié)果表明,隨著輻照劑量不斷增加,‘新大坪’組培苗莖切段的存活率與輻照劑量呈現(xiàn)負相關(guān)性,而致死率與輻照劑量呈現(xiàn)正相關(guān)性。

表1 不同輻射劑量對馬鈴薯組培苗莖切段的影響Table 1 Effects of different radiation doses on tissue culture plantlet stem segments of potato varieties

2.2 不同輻照劑量對馬鈴薯組培苗生長和變異的影響

從表2可知,‘新大坪’在10 Gy時的生根率和側(cè)芽形成率與對照組相比沒有明顯的差異,當劑量超過20 Gy時,隨著輻照劑量升高,生根率顯著下降。當劑量超過30 Gy時,‘新大坪’的側(cè)芽形成率顯著降低。在20 Gy劑量輻照下,‘新大坪’的形態(tài)變異率有小幅度提高,形態(tài)變異率為64.00%;隨著輻照劑量增高,‘新大坪’的形態(tài)變異率顯著下降。觀察到‘新大坪’在40 Gy處理組中有2株組培苗形成根,但這2株組培苗在15 d后開始陸續(xù)死亡。綜上所述,40 Gy已接近馬鈴薯組培苗莖切段的致死輻照劑量。

表2 不同輻射劑量對馬鈴薯組培苗生長及變異影響Table 2 Effects of different radiation doses on the growth and variation of potato tissue-cultured plantlets

與對照相比,‘新大坪’組培苗形態(tài)發(fā)生明顯變化 (圖1),植株的變化主要表現(xiàn)為葉片不對稱、葉緣不規(guī)則[圖1(b)]、莖變異伸長、葉片叢生[圖1(c)]、葉片卷曲狹長[圖1(d)]、莖上結(jié)薯生根[圖1(e)]、葉片叢生[圖1(f)]、葉片缺失[圖1(g)]、部分小葉變小[圖1(h)]、葉片粘連[圖1(i)]、小葉變小、葉緣不規(guī)則[圖1(j)]等。

(a)對照組植株;(b)葉片不對稱、葉緣不規(guī)則;(c)莖伸長、葉片叢生;(d)葉片卷曲狹長;(e)莖上結(jié)薯生根;(f)葉片叢生;(g)葉片缺失;(h)部分小葉變小;(i)葉片粘連;(j)葉片變小,葉緣不規(guī)則。圖1 碳離子束輻射對植株形態(tài)改變的影響Figure 1 Morphological variation of tissue-cultured plantlets irradiated by carbon ion beams

2.3 不同輻照劑量的高能碳離子束對馬鈴薯生理指標的影響

2.3.1 碳離子束輻照對馬鈴薯相關(guān)抗氧化酶活性的影響

為探討馬鈴薯組培苗對碳離子束輻照誘導的氧化應(yīng)激的抗氧化反應(yīng),測定了3種具有代表性的胞內(nèi)抗氧化酶的活性?！麓笃骸M培苗莖切段經(jīng)不同劑量的高能碳離子束輻照處理后,其組培苗葉片中SOD的活性呈現(xiàn)出先升高后下降的現(xiàn)象[圖2(a)]。10 Gy和20 Gy處理的SOD活性分別為236.80和230.89 U/gFW,高于對照(180.48 U/gFW);30 Gy時的SOD活性為156.17 U/gFW。10 Gy時SOD活性最高,隨著輻照劑量的升高,SOD活性逐漸降低,30 Gy處理組的SOD活性略低于對照。

(a)SOD活性;(b)POD活性;(c)CAT活性。圖中不同小寫字母代表處理間差異顯著(P<0.05)。圖2 高能碳離子束對馬鈴薯組培苗抗氧化酶活性的影響Figure 2 Effect of high-energy carbon ion beam on antioxidant enzyme activity of potato tissue-cultured plantlets

隨著高能碳離子束輻照劑量的增加,‘新大坪’組培苗葉片中的POD活性呈現(xiàn)出先升高后下降的現(xiàn)象[圖2(b)]。對照組的POD活性為29.87×103U/gFW,當高能碳離子束輻照劑量為10 Gy時,其POD活性為40.78×103U/gFW,顯著高于對照及其他劑量的輻照處理組;當輻照劑量增加到20 Gy時,POD活性開始顯著下降,POD活性為31.02×103U/gFW,30 Gy時的POD活性為27.41×103U/gFW,略低于對照組。

高能碳離子束輻照使組培苗葉片中CAT活性先逐步提高,在達到一定輻照劑量后,CAT活性開始降低。如圖2(c)所示,對照組的CAT活性為4.61×10-3U/gFW,隨著輻照劑量的增加,CAT活性增高,10 Gy時的CAT活性為5.64×10-3U/gFW;當輻照劑量為20 Gy時,‘新大坪’幼苗葉片的CAT活性顯著上升(7.79×10-3U/gFW);輻照劑量增加到30 Gy時,CAT活性降低為2.63×10-3U/gFW,顯著低于對照組。

2.3.2 碳離子束輻照對馬鈴薯丙二醛含量的影響

MDA是衡量氧化脅迫程度的常用指標之一,反映植物膜脂過氧化的程度。不同程度的高能碳離子束劑量處理后,幼苗葉片內(nèi)MDA含量出現(xiàn)波動(圖3)。隨著輻照劑量增加,MDA含量先增加后降低,而后又顯著升高。對照組的MDA含量為15.34×10-3nmol/gFW,10 Gy時MDA含量開始顯著上升(26.15×10-3nmol/gFW);當輻照劑量上升到20 Gy時,MDA含量為21.08×10-3nmol/gFW,較10 Gy組的MDA含量有小幅下降,但仍高于對照組;當輻照劑量為30 Gy時,MDA含量顯著上升,為40.95×10-3nmol/gFW,顯著高于對照及其他處理組。

圖中不同小寫字母代表處理間差異顯著(P<0.05)。圖3 高能碳離子束對馬鈴薯組培苗丙二醛含量的影響Figure 3 Effect of high-energy carbon ion beam on malondialdehyde content of potato tissue culture plantlets

2.4 高能碳離子束輻照馬鈴薯的半致死輻照劑量的確定

根據(jù)碳離子束輻照劑量與致死率之間得到的線性回歸可得知(表3),馬鈴薯‘新大坪’的回歸系數(shù)b為2.53,截距a為-1.60,可以得知‘新大坪’的線性回歸方程為y=-1.60+2.53x,其中,因變量y為致死率,自變量x為碳離子束輻照劑量。從線性回歸方程可得,當‘新大坪’的致死率為50%時,即y為50,x=20.37,即‘新大坪’的半致死輻照劑量LD50=20.37 Gy,約為20.00 Gy。表3中的P值若小于0.01則可以表明自變量對因變量具有極顯著影響?！麓笃骸腜值為0.001(<0.01),即輻照劑量和致死率之間存在極顯著的線性關(guān)系。

表3 馬鈴薯組培苗輻射后的一元一次方程回歸系數(shù)及檢驗結(jié)果Table 3 Regression coefficients and test results of univariate linear equation of tissue cultured plantlets of potato after radiation

3 討論

作為有顯著效果的物理誘變技術(shù),高能重離子束可以影響植物生長發(fā)育,對植物的生理造成損傷。本研究發(fā)現(xiàn),高能碳離子束處理的輻照劑量和‘新大坪’組培苗莖切段的生根率呈負相關(guān)。高輻照劑量的損傷效應(yīng)明顯,植株會產(chǎn)生嚴重且不可逆轉(zhuǎn)的生理性損傷甚至全部死亡,該結(jié)果與劉玲等[17]和石紫薇等[18]的研究結(jié)果一致。高輻照劑量處理在一定程度上對馬鈴薯組培苗的側(cè)芽形成產(chǎn)生抑制效應(yīng),這與吳大利[19]對一串紅和胡麻進行輻射研究的結(jié)果相符合。高能重離子束可以影響細胞DNA等生物分子,特定能量及劑量的電子束輻照植物,可導致DNA分子發(fā)生斷裂及重組,從而誘發(fā)基因突變,產(chǎn)生表型變異。如王靜等[20]輻射燕山早豐后其接穗葉片的面積增大,發(fā)現(xiàn)葉片卷曲。本研究發(fā)現(xiàn)將碳離子束輻照后的馬鈴薯組培苗莖切段繼代培養(yǎng),其表型改變主要表現(xiàn)在葉柄、葉緣、葉片和葉頂端;表型變化主要為葉片不對稱、葉緣不規(guī)則、莖變異伸長、葉片叢生和葉片粘連等。當植物受到傷害時,活性氧產(chǎn)生和清除機制的動態(tài)平衡會被破壞,植物為保護自身不被活性氧傷害,形成了酶促抗氧化系統(tǒng)來清除過多的活性氧。本試驗結(jié)果表明,在10 Gy輻照處理下,‘新大坪’組培苗葉片中的SOD、CAT、POD活性升高,表明輻照處理下‘新大坪’組培苗莖切段通過提高細胞內(nèi)SOD、CAT、POD的酶活來消除過多的活性氧,以減輕輻射帶來的損傷。隨著輻照劑量升高,其SOD、CAT和POD的酶活下降,說明高劑量的碳離子束輻照對組織細胞損傷增加,當活性氧的累積超出自身損傷最大值時,酶促抗氧化系統(tǒng)被破壞,從而導致致酶活降低。MDA是衡量氧化脅迫程度的常用指標之一,可以反映植物膜脂過氧化的程度[21]。本研究中10 Gy的輻照劑量下,‘新大坪’組培苗的MDA含量升高,說明低劑量輻照使其積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來增強對逆境的抵抗。當輻照劑量為20 Gy時,‘新大坪’組培苗的MDA含量較峰值略有下降,表明此時抵御逆境的機制仍在發(fā)揮作用,但合成效率降低,對輻射的抵御效果減弱。當輻照劑量為30 Gy時,MDA含量顯著上升,說明高輻照劑量使其產(chǎn)生較為嚴重的膜質(zhì)過氧化損傷,使得植物產(chǎn)生的活性氧的自由基累積超過自身所承受閾值,從而導致膜結(jié)構(gòu)被破壞。在輻照誘變育種研究中,輻照劑量的選擇應(yīng)該依據(jù)植物受到傷害程度低的前提下實現(xiàn)植物產(chǎn)生更多遺傳變異的原則,所以輻照誘變的適宜劑量一般采用半致死劑量。通過輻照劑量與致死率之間得到的線性回歸可得知馬鈴薯品種‘新大坪’組培苗的碳離子束輻照LD50為20.37 Gy,劑量率為20 Gy/min。

4 結(jié)論

馬鈴薯組培苗莖切段隨著高能碳離子束輻照劑量的升高,組培苗生長受到明顯抑制作用,尤其是高劑量(40 Gy)嚴重影響組培苗存活率及其生長;SOD活性、POD活性和CAT活性隨輻照劑量的增加都呈先升后降趨勢,MDA含量則呈先升后降,隨后又升高的現(xiàn)象。根據(jù)半致死輻照劑量回歸方程可以得出馬鈴薯品種‘新大坪’組培苗的碳離子束輻照LD50為20.37 Gy,初步認為在20 Gy/min高劑量率輻照條件下, 以20 Gy左右劑量進行輻照較為適宜。