劉彼得，李循，王書恒，賈宏亮，張小安，李九智

0 引言

前列腺癌（prostate cancer, PCa）為男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，隨著人口老齡化的加重，我國PCa發(fā)病率及死亡率呈上升態(tài)勢[1]。血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry, VM）是由腫瘤細胞圍成的具有內(nèi)皮性血管功能的管狀結(jié)構(gòu)，已在包括PCa在內(nèi)的多種實體惡性腫瘤組織中被證實存在，并與腫瘤的惡性程度及不良預(yù)后相關(guān)[2]。VM的形成涉及腫瘤細胞可塑性及模擬內(nèi)皮細胞的過程，這與腫瘤干細胞（cancer stem cells, CSCs）及上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）密切相關(guān)[2-3]。Wnt5a是Wnt非經(jīng)典信號通路配體，Wnt5a不僅參與調(diào)控CSCs特性和EMT進程，且有研究報道其能夠促進卵巢癌、非小細胞肺癌及脈絡(luò)膜黑色素瘤VM的形成，但Wnt5a對PCa的VM調(diào)控作用尚未被探究[4-7]。故本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測PCa組織中Wnt5a的表達及VM的形成情況，并收集PCa患者的臨床病理資料，從人體組織水平初步探究Wnt5a與VM形成的相關(guān)性及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 組織標本 收集新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院2019—2020年間行PCa根治術(shù)的患者組織標本50例，所有患者術(shù)前均未接受內(nèi)分泌治療、放療、化療及免疫治療等，并以年齡及體重指數(shù)1:1匹配收集良性前列腺增生患者組織標本50例。標本經(jīng)福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋，并經(jīng)病理醫(yī)師明確診斷。收集患者一般資料及臨床病理資料。

1.1.2 主要試劑 Wnt5a抗體（1:200）和Vimentin抗體（1:500）購自英國Abcam公司，E-cadherin抗體（1:1 000）和CD133抗體（1:1 000）購自美國Proteintech公司，CD34抗體（1:200）、HRP-山羊抗兔二抗（1:5 000）和HRP-山羊抗小鼠二抗（1:5 000）購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 組織切片脫蠟、水化，采用高壓修復(fù)法進行抗原修復(fù)，5%BSA封閉20 min后滴加一抗，室溫孵育1 h后轉(zhuǎn)入4℃恒溫箱過夜，滴加二抗室溫孵育1 h，DAB和蘇木精顯色后，梯度脫水封片，由兩名醫(yī)師在顯微鏡下共同評估蛋白表達情況。

1.2.2 CD34/PAS雙染 按照上述步驟進行CD34染色后，0.5%PAS溶液37℃孵育10 min，蘇木精對比染色后，梯度脫水封片。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色判讀標準 每例標本取10個含有陽性細胞的高倍視野（×200）分別計數(shù)100個腫瘤細胞或增生腺體細胞，取其平均值計算陽性細胞百分率，0分：陽性細胞占0～5%；1分：陽性細胞占5%～25%；2分：陽性細胞占25%～50%；3分：陽性細胞＞50%。染色強度：0分：無明顯染色；1分：與基質(zhì)相比有輕微染色；2分：易見的深黃色；3分：棕黃色。染色指數(shù)為陽性細胞百分率和染色強度之和，最終將染色結(jié)果分為兩組：陰性和弱陽性為一組（0～2分），以低表達表示；中等陽性和強陽性為一組（3～6分），以高表達表示。

1.2.4 CD34/PAS雙染判讀標準 CD34染色位置為血管內(nèi)皮細胞，定位在細胞膜，顏色呈棕黃色，PAS著色于基底膜，呈櫻桃紅色。內(nèi)皮細胞性血管CD34和PAS均染色陽性；VM的CD34染色陰性，PAS染色陽性，且管道內(nèi)可見紅細胞。觀察并計數(shù)整張切片上VM的數(shù)量，有則為陽性，無則為陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用χ2檢驗分析Wnt5a在兩組間的表達差異，以及Wnt5a和VM的臨床意義，Spearman相關(guān)性分析Wnt5a和VM的相關(guān)性及與CD133、Vimentin、E-cadherin表達的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Wnt5a在PCa組織及良性前列腺增生組織中的表達情況

前列腺上皮細胞及間質(zhì)細胞均表達Wnt5a，以上皮細胞表達為著。在PCa組織中Wnt5a的高表達率為72.0%，良性前列腺增生組織中高表達率為50.0%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.024），見圖1、表1。

表1 Wnt5a蛋白在PCa組織及良性前列腺增生組織中的表達Table 1 Expression of Wnt5a protein in prostate cancer tissues and benign prostatic hyperplasia tissues

圖1 Wnt5a在PCa組織及良性前列腺增生組織中的IHC染色結(jié)果 (×200)Figure 1 IHC staining results of Wnt5a in PCa and benign prostatic hyperplasia tissues (×200)

2.2 PCa組織中VM的形成情況及與Wnt5a表達的關(guān)系

CD34可將內(nèi)皮細胞染色，PAS著色于血管樣結(jié)構(gòu)的基底膜，經(jīng)CD34/PAS雙染可見，在PCa組織中CD34染色陰性而PAS染色陽性的腫瘤細胞圍成的管腔樣結(jié)構(gòu)為VM（圖2A）；而CD34和PAS均染色的管腔樣結(jié)構(gòu)為內(nèi)皮細胞血管（圖2B），前列腺癌組織中VM陽性率為38.0%（19/50）。前列腺癌組織中VM的形成與Wnt5a的表達具有正相關(guān)性（r=0.396,P=0.004），見表2。

表2 PCa組織中Wnt5a、VM及CSCs/EMT標志蛋白表達的相關(guān)性Table 2 Correlation among Wnt5a expression, VM, and CSCs/EMT-related protein expression in prostate cancer tissues

圖2 VM在前列腺癌組織中的染色情況 (×200)Figure 2 Morphology of VM in prostate cancer tissues by CD34/PAS double staining (×200)

2.3 PCa組織中Wnt5a的表達及VM與CSCs/EMT標志蛋白表達的關(guān)系

E-cadherin為上皮特異性標志蛋白，Vimentin為間皮特異性標志蛋白，由圖3及表2可見，PCa組織中Wnt5a的表達與Vimentin的表達呈顯著正相關(guān)（r=0.673,P＜0.001），而與E-cadherin的表達無顯著相關(guān)性；且VM的存在同樣與Vimentin的表達呈顯著正相關(guān)（r=0.303,P=0.033），而與E-cadherin的表達無顯著相關(guān)性。CD133為CSCs標志蛋白，其在前列腺癌組織中的表達與Wnt5a的表達（r=0.603,P＜0.001）及VM（r=0.396,P=0.004）均呈顯著正相關(guān)。

圖3 免疫組織化學(xué)染色檢測PCa組織中CSCs及EMT標志蛋白的表達情況 (×200)Figure 3 IHC staining results of CSCs/EMT-related proteins in prostate cancer tissues (×200)

2.4 PCa組織中Wnt5a的表達及VM與臨床病理特征的關(guān)系

W n t 5a 蛋 白 的 表 達 與PCa的G lea so n 評 分（χ2=15.675,P＜0.001）、輸精管侵犯（χ2=4.049,P=0.044）及淋巴轉(zhuǎn)移（χ2=1.049,P=0.044）均呈正相關(guān)。PCa組織中VM的形成同樣與Gleason評分（χ2=12.738,P＜0.001）、輸精管侵犯（χ2=5.995,P=0.014）及淋巴轉(zhuǎn)移（χ2=5.995,P=0.014）呈正相關(guān)，此外還與腫瘤T分期正相關(guān)（χ2=4.529,P=0.033），見表3。

表3 PCa組織中Wnt5a的表達及VM與臨床病理特征的關(guān)系Table 3 Relationship between Wnt5a expression, VM and clinicopathological factors of prostate cancer patients

3 討論

血管作為維持腫瘤生長必需的營養(yǎng)通道，是腫瘤微環(huán)境的重要調(diào)節(jié)因素，靶向于腫瘤血管的治療應(yīng)為理想的抗癌方式，抗血管靶向藥物已被證實對多種腫瘤顯著有效。然而臨床試驗卻發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的抗血管靶向藥物對PCa療效甚微，尤其是對去勢抵抗性PCa，其機制可能涉及腫瘤微環(huán)境缺氧及VM的激活[8]。既往研究表明腫瘤微環(huán)境與PCa的治療耐受及進展密切相關(guān)，因此針對腫瘤微環(huán)境的研究可能是改善進展性PCa治療現(xiàn)狀的關(guān)鍵[9-10]。故本研究從VM的角度，在PCa組織水平初步探究Wnt5a與VM的相關(guān)性，同時分析其與CSCs和EMT的關(guān)系，為發(fā)掘新的PCa治療靶點提供基礎(chǔ)性依據(jù)。

本研究通過CD34/PAS雙染對PCa組織進行VM檢測，結(jié)果表明其與PCa的惡性程度、侵犯及轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示VM可能為進展性PCa的潛在治療靶點。靶向于VM的研究也證明，抑制VM的形成并與血管內(nèi)皮細胞靶向藥物或其他療法進行組合，可能是治療PCa（尤其是預(yù)后不良的PCa）的重要方向[2]。目前雖有研究表明一些有機化合物（如表沒食子兒茶素沒食子酸酯及山奈酚）能夠抑制PCa的VM形成，但形成VM的機制尚未完全闡明，目前亦缺乏對PCa的VM形成機制的研究，這促使學(xué)者們對其展開探索[11-12]。

CSCs和EMT在VM的形成中起到重要作用[2-3,13]。已有研究證實，源自三陰性乳腺癌細胞的干細胞樣細胞能夠直接構(gòu)成VM結(jié)構(gòu)，然而目前尚無研究證實PCa的VM形成與CSCs及EMT的確切關(guān)系[14]。本研究從前列腺癌組織水平初步證明，CSCs標志因子CD133及間皮細胞特性標志因子Vimentin的表達與VM的形成具有明顯正相關(guān)性，提示CSCs及EMT可能為促進PCa形成VM的因素。

CSCs、EMT 及VM受多種信號通路的調(diào)控，并存在交互、重疊，其中就包括Wnt信號通路[2,15-16]。研究表明Wnt信號通路與雄激素受體的交互作用在PCa的進展中起到重要作用，其中Wnt5a（Wnt非經(jīng)典信號通路配體）對雄激素受體的抑制作用以及對PCa進展的促進作用較為顯著[17-19]。進一步查閱文獻發(fā)現(xiàn)Wnt5a能夠促進卵巢癌、非小細胞肺癌及脈絡(luò)膜黑色素瘤VM的形成，但Wnt5a對PCa的VM的調(diào)控作用及其機制尚未被探究[5-7]。本研究在PCa組織水平初步證實Wnt5a的表達不僅與VM的形成正相關(guān)，還與CD133及Vimentin的表達正相關(guān)。此外，通過對臨床病理參數(shù)的分析發(fā)現(xiàn)，Wnt5a可能對PCa的進展起促進作用。由此可見，Wnt5a可能在PCa的發(fā)生和進展過程中扮演重要角色，并可能通過促進VM的形成參與PCa的進展，且其對PCa的CSCs及EMT可能存在調(diào)控作用。

綜上所述，Wnt5a在PCa組織中的表達明顯高于良性前列腺增生組織，且在PCa組織中Wnt5a的表達與VM的形成正相關(guān)；此外，二者的表達不僅與CSCs及EMT標志蛋白的表達具有正相關(guān)性，還與PCa的惡性程度、侵犯及轉(zhuǎn)移正相關(guān)。以上結(jié)果提示W(wǎng)nt5a具有作為評估PCa惡性程度及預(yù)后新指標的潛力，并有助于開拓PCa靶向治療的新思路。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。