王艷陽,劉 嬋,周 雪,張隆澤,余麗梅,何志旭,4

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)科大學(xué)組織損傷修復(fù)與再生醫(yī)學(xué)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,貴州 遵義 563099;3.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,貴州 遵義 563099;4.貴州省兒童醫(yī)院,遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 小兒內(nèi)科,貴州 遵義 563099)

miRNA是一類非編碼RNA,是一種內(nèi)源性、高度進(jìn)化保守的單鏈RNA,可作為基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子來發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。1993年,Lee等[2]在對(duì)秀麗隱桿線蟲的研究中,第1次報(bào)道了miRNA。迄今為止,已鑒定出超過2 000種miRNA,miRNA在大多數(shù)生物過程的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,其中包括細(xì)胞分化、增殖以及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和代謝[3],miRNA現(xiàn)被用于多種臨床診斷標(biāo)志以及疾病治療靶點(diǎn)[4]。超過60%的人類蛋白質(zhì)編碼基因在其3' 非翻譯區(qū)含有miRNA靶位點(diǎn)[5],miRNA在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控目的基因的表達(dá),可以通過與啟動(dòng)子區(qū)域中的反向互補(bǔ)序列結(jié)合來調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄,核miRNA通過轉(zhuǎn)錄基因激活(TGA)和轉(zhuǎn)錄基因沉默(TGS)來發(fā)揮作用[6],成熟的miRNA被加載到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體中,引導(dǎo)復(fù)合體靶向mRNA,導(dǎo)致翻譯抑制和靶向mRNA降解[4]。每個(gè)miRNA可調(diào)控?cái)?shù)個(gè)靶基因,而同一個(gè)靶基因也可以被多個(gè)miRNA調(diào)控[6],因此miRNA對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控作用在人類組學(xué)中具有龐大而復(fù)雜的系統(tǒng),近年來許多科學(xué)研究已經(jīng)在特定的miRNA改變和疾病之間建立、驗(yàn)證了它們之間的聯(lián)系,miRNA已經(jīng)逐漸成為國內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)。

miR-181a可通過參與細(xì)胞的增殖、凋亡和分化調(diào)節(jié)各種各樣的生物過程,包括T細(xì)胞分化的調(diào)控[7],血小板活化的調(diào)節(jié)[8],精子的形成[9],也可以作為癌基因或腫瘤抑制因子參與各種癌癥的發(fā)病機(jī)制[10]等,這些研究結(jié)果提示miR-181a在多種生物學(xué)過程中發(fā)生作用,因此對(duì)其功能的深入探索尤為重要。

本研究根據(jù)現(xiàn)有生物信息學(xué)分析系統(tǒng)對(duì)hsa-miR-181a-5p進(jìn)行了全面的分析[11],首先對(duì)hsa-miR-181a-5p的染色體基因定位及miR-181a-5p的物種保守性進(jìn)行分析,根據(jù)其結(jié)果驗(yàn)證其是否有重要生物學(xué)功能。在這些基礎(chǔ)上,對(duì)hsa-miR-181a-5p在人類各組織以及不同疾病發(fā)生中的表達(dá)豐度進(jìn)行分析,為進(jìn)一步對(duì)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)所驗(yàn)證結(jié)論進(jìn)行整理概述提供充分的理論支持,最后對(duì)其靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)并對(duì)其靶基因進(jìn)行GO功能分析、KEGG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析以及靶基因之間蛋白質(zhì)相互作用,并在細(xì)胞水平驗(yàn)證靶基因及其富集通路,為預(yù)測(cè)結(jié)果提供理論支撐,同時(shí)在討論部分結(jié)合現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步相互佐證,為hsa-miR-181a-5p在生物學(xué)過程中所起到的的調(diào)控機(jī)制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 hsa-miR-181a-5p的基因組信息和物種序列保守性的預(yù)測(cè)分析 使用在線數(shù)據(jù)庫UCSC(http://genomea-sia.ucsc.ed)檢索hsa-miR-181a-5p的基因組信息;采用miRBase(https://www.mir-base.org/)在線數(shù)據(jù)庫下載物種成熟序列并對(duì)hsa-miR-181a-5p的成熟序列進(jìn)行物種保守性分析。

1.2 hsa-miR-181a-5p在人類各組織以及不同疾病中的表達(dá)水平分析 采用miGator v3.0 數(shù)據(jù)庫(http://mirgator.obic.re.kr/)對(duì)hsa-miR-181a-5p進(jìn)行分析,檢索hsa-miR-181a-5p在人類不同的組織器官中、不同疾病發(fā)生過程的表達(dá)水平。

1.3 hsa-miR-181a-5p的靶基因預(yù)測(cè) 采用miRWALK( http://mirwalk.umm.uniheidelberg.de/)、miRDB(http: //www.mirdb.org/)和Target Scan(http://www.target-scan.org/vert71/)靶基因數(shù)據(jù)庫分析預(yù)測(cè)hsa-miR-181a-5p的靶基因,預(yù)測(cè)結(jié)果用Venny2.1.0 ( https://bioinfogp.cnb.csic.es/to-ols/venny/ )繪制韋恩圖,取其交集靶基因用于后續(xù)分析。

1.4 hsa-miR-181a-5p預(yù)測(cè)靶基因的GO和KEGG富集通路 將交集靶基因使用SangerBox數(shù)據(jù)庫(http://sangerbox.com/home.html)進(jìn)行GO功能注釋分析和KEGG信號(hào)通路富集分析。將483個(gè)交集基因作為目的基因輸入,GO功能注釋包括細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)、生物功能(BP)3大應(yīng)用部分;對(duì)靶基因進(jìn)行KEGG富集分析,找出差異顯著的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 hsa-miR-181a-5p靶基因編碼蛋白質(zhì)之間相互作用分析 將交集靶基因數(shù)據(jù)集導(dǎo)入String 11.0 數(shù)據(jù)庫(http://www.string-db.org),選擇顯示選項(xiàng)為hide disconnected nodes in the network,交互分?jǐn)?shù)為highest confidence,構(gòu)建靶基因編碼的蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 主要儀器及試劑 逆轉(zhuǎn)錄儀型號(hào)為東勝龍ETC-811,基因擴(kuò)增PCR儀、熒光定量PCR儀型號(hào)為美國伯樂bio-rad cfx96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀;miR-181a-5p agomir、agomir NC及antagomir、antagomir NC購于上海吉瑪基因;Trizol購于Takara有限公司;Gibco F12/DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、Gibco胎牛血清以及LIPO 2000(L7800)購于thermo賽默飛有限公司;miRNA 第一鏈 cDNA 合成 (加尾法)、miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒 (染料法)購于上海生工生物有限公司;A549細(xì)胞(肺癌人類肺泡基底上皮細(xì)胞)購于中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)共有5組:A549細(xì)胞空白組,miR-181a-5p agomir A549細(xì)胞組,miR-181a-5p antagomir A549細(xì)胞組。分別按照說明書將50 nmol/L miR-181a-5p agomir、agomir NC,100 nmol/L miR-181a-5p antagomir、miR-181a-5p antagomir NC(序列見表1)轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)miR-181a-5p在不同組細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量, 轉(zhuǎn)染步驟按照試劑說明書嚴(yán)格進(jìn)行,細(xì)胞在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。

表1 轉(zhuǎn)染RNAoligo序列及RT-qPCR 引物序列

1.8 轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證 提取細(xì)胞總RNA后,轉(zhuǎn)染效率采用miRNA第一鏈cDNA合成(加尾法)及miRNA熒光定量PCR試劑盒(染料法)進(jìn)行驗(yàn)證,逆轉(zhuǎn)錄體系及反應(yīng)條件嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,將得到的cDNA反應(yīng)液稀釋50倍后點(diǎn)板。miRNA擴(kuò)增反應(yīng)體系以及miRNA擴(kuò)增條件嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,引物根據(jù)上海和元公司提供的引物序列由上海生工生物有限公司合成(表1),內(nèi)參使用U6,結(jié)果采用2-ΔΔCt的方法來統(tǒng)計(jì)miRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 將A549細(xì)胞空白組、miR-181a-5p agomir A549細(xì)胞組、miR-181a-5p antagomir A549細(xì)胞組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,按照武漢華大基因技術(shù)服務(wù)有限公司高通量實(shí)驗(yàn)室所提供的標(biāo)準(zhǔn)步驟執(zhí)行,使用BGISEQ平臺(tái)檢測(cè)對(duì)比基因集,測(cè)序長度為PE150。參考物種名為HOMO_SAPIENS,來源為NCBI,參考基因組版本為GCF_000001405.39_GRCH38.P13。測(cè)序得到的RAW DATA使用SOAPNUKE (V1.5.6)進(jìn)行過濾,得到CLEAN DATA。后續(xù)使用Dr. Tom多組學(xué)數(shù)據(jù)挖掘系統(tǒng)(https://biosys.bgi.com)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、繪圖及挖掘。TPM是根據(jù)測(cè)序深度歸一化后的表達(dá)量度量,根據(jù) kegg_pathway 注釋分類,使用 R 軟件中的 phyper 函數(shù)進(jìn)行富集分析,計(jì)算 Pvalue,然后對(duì) Pvalue 進(jìn)行 FDR 校正得到 Qvalue。在系統(tǒng)中篩選反映差異倍數(shù),log2(處理組表達(dá)量 / 對(duì)照組表達(dá)量),大于0表示相對(duì)于對(duì)照組,處理組基因表達(dá)量上調(diào),小于0表示下調(diào)。計(jì)算用的表達(dá)量一般是歸一化后的 read counts。以上下1.5倍差距為標(biāo)準(zhǔn),篩選log2(處理組表達(dá)量 / 對(duì)照組表達(dá)量)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組基因后進(jìn)一步進(jìn)行KEGG通路富集。結(jié)合前期預(yù)測(cè)以及現(xiàn)有文獻(xiàn),選擇通路,篩選基因集做熱圖分析,標(biāo)準(zhǔn)化方法為:z-score (row direction)。

2 結(jié)果

2.1 hsa-miR-181a-5p的基因定位及成熟序列的保守性分析 檢索UCSC數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn) hsa-miR-181a-5p基因定位于人類基因組chr1:198859109-198859130,chr9:124692481-124692502之間(圖1)。對(duì)miR-181a-5p成熟序列進(jìn)行分析,結(jié)果顯示miR-181a-5p的成熟序列在物種間基本一致,該序列在36種物種進(jìn)化過程中具有高度保守性(表2)。

圖1 hsa-miR-181a-5p在人類基因組chr1、chr9的定位

表2 不同物種中 miR-181a-5p 的成熟序列

2.2 hsa-miR-181a-5p在人體各器官及不同疾病中的表達(dá)分析 通過定位人類1號(hào)染色體的miR-181a-5p,圖2結(jié)果結(jié)果顯示,其分布器官的優(yōu)先排名為中樞神經(jīng)系統(tǒng)、扁桃體、淋巴細(xì)胞、肺部、乳房;圖3結(jié)果顯示位于人類9號(hào)染色體的hsa-miR-181a-5p的優(yōu)先排名為中樞神經(jīng)系統(tǒng)、扁桃體、淋巴細(xì)胞、乳房、色素細(xì)胞。通過分析hsa-miR-181a-5p在不同疾病發(fā)生的表達(dá)情況,圖4結(jié)果顯示,位于1號(hào)染色體的hsa-miR-181a-5p在急性髓系白血病的表達(dá)豐度最高,其次是卵巢漿液性癌以及前列腺癌等生殖系統(tǒng)癌癥,乳腺浸潤性導(dǎo)管癌等乳腺癌,以及多種白血病與淋巴瘤等血液系統(tǒng)疾病;圖5結(jié)果顯示位于9號(hào)染色體的hsa-miR-181a-5p在鼻咽癌、銀屑病的表達(dá)豐度排在前列,同時(shí)也在多種乳腺癌以及多種血液系統(tǒng)疾病中豐度呈現(xiàn)顯著增加。

圖2 位于人類1號(hào)染色體的hsa-miR-181a-5p在人各個(gè)組織器官中的表達(dá)情況

圖3 位于人類9號(hào)染色體的hsa-miR-181a-5p在人各個(gè)組織器官中的表達(dá)情況

圖4 位于人類1號(hào)染色體的hsa-miR-181a-5p在不同疾病中的表達(dá)豐度

圖5 位于人類9號(hào)染色體的hsa-miR-181a-5p在不同疾病中的表達(dá)豐度

2.3 hsa-miR-181a-5p的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果 miRWALK預(yù)測(cè)靶基因?yàn)? 112個(gè),miRDB預(yù)測(cè)靶基因?yàn)? 408個(gè),Target Scan預(yù)測(cè)靶基因?yàn)? 371個(gè),交集靶基因有483個(gè)用于后續(xù)分析(圖6)。

圖6 MIRDB、miWALK 、TargetScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)hsa-miR-181a-5p的靶基因韋恩圖

2.4 hsa-miR-181a-5p預(yù)測(cè)靶基因的 GO功能分析 對(duì)3個(gè)數(shù)據(jù)庫交集靶基因進(jìn)行GO功能分析,結(jié)果顯示hsa-miR-181a-5p的交集靶基因參與多種細(xì)胞組分,排名前十的有胞漿、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、核質(zhì)、質(zhì)膜、細(xì)胞膜、染色質(zhì)、高爾基體、粘著斑、大分子復(fù)合物;hsa-miR-181a-5p的交集靶基因執(zhí)行多種分子功能,排名前十的包括蛋白質(zhì)結(jié)合、金屬離子結(jié)合、RNA結(jié)合、異丙腎上腺素結(jié)合、DNA結(jié)合、RNA 聚合酶Ⅱ核心啟動(dòng)子近端區(qū)域序列特異性 DNA 結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、鋅離子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性,序列特異性DNA結(jié)合;hsa-miR-181a-5p的交集靶基因參與多種生物學(xué)過程,排名前十的包括RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA模板化、轉(zhuǎn)錄正性調(diào)控、DNA 模板化、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)磷酸化、細(xì)胞粘附、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育(圖7)。

圖7 hsa-miR-181a-5p預(yù)測(cè)靶基因的GO功能分析

2.5 hsa-miR-181a-5p預(yù)測(cè)靶基因的KEGG信號(hào)通路分析 對(duì)hsa-miR-181a-5p的3個(gè)數(shù)據(jù)庫交集靶基因 KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn),排名前十的涉及MAPK、Ras、Pap1、PI3K-Akt等多個(gè)信號(hào)通路,還涉及癌癥的發(fā)生過程,富集通路所涉及的關(guān)鍵靶基因有MAPK1、KRAS、AKT3、RAP1B、MAPK8等,見圖8、9。這些結(jié)果提示我們hsa-miR-181a-5p的重要功能,也為后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行靶標(biāo)通路的選擇提供了理論基礎(chǔ)。同時(shí),本研究的多個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果均提示hsa-miR-181a-5p與癌癥發(fā)生發(fā)展的重要關(guān)聯(lián)。

圖8 hsa-miR-181a-5p預(yù)測(cè)靶基因的KEGG信號(hào)通路分析氣泡圖

圖9 hsa-miR-181a-5p預(yù)測(cè)靶基因的 KEGG 信號(hào)通路分析

2.6 hsa-miR-181a-5p預(yù)測(cè)靶基因的蛋白質(zhì)之間相互作用分析 hsa-miR-181a-5p預(yù)測(cè)靶基因編碼蛋白質(zhì)之間相互作用分析結(jié)果顯示,編碼蛋白之間存在較強(qiáng)作用關(guān)系的靶基因?yàn)镸APK1、MAPK8、TGFBR1、KRAS、RBBP7等(圖10)。MAPK1、MAPK8都是MAPK信號(hào)通路的關(guān)鍵分子,MAPK是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者,又涉及多種生物學(xué)過程;TGFBR1更是參與炎癥發(fā)生與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等生物過程的重要分子;KRAS基因是GDP/GTP結(jié)合蛋白,活化后的KRAS可以激活下游如控制細(xì)胞生成的PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路,以及控制細(xì)胞增殖的RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路。以上這些都可以表明hsa-miR-181a-5p的生物重要性,也為hsa-miR-181a-5p后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究靶標(biāo)的確認(rèn)提供了一些理論支持。

圖10 預(yù)測(cè)靶基因所編碼蛋白質(zhì)之間的相互作用分析

2.7 轉(zhuǎn)染結(jié)果 為了進(jìn)一步觀察miR-181a-5p對(duì)基因表達(dá)的影響,轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞中miR-181a-5p的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示,miR-181a-5p agomir 組中miR-181a-5p的表達(dá)量顯著高于control、agomir NC組 (P<0.01),如圖11A。miR-181a-5p antagomir 組中miR-181a-5p的表達(dá)量顯著低于control、antagomir NC 組 (P<0.001),如圖11B。

A:miRNA-181a-5p Agomir組;B:miRNA-181a-5p Antagomir組;*、**:P<0.01、P<0.001;ns:無差異。

2.8 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果 在Dr. Tom系統(tǒng)中篩選反映差異倍數(shù),同時(shí)篩選log2(處理組表達(dá)量 / 對(duì)照組表達(dá)量)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組基因,差異倍數(shù)數(shù)據(jù)選為1.5,對(duì)這2 234個(gè)基因進(jìn)行了KEGG通路富集,如圖12A。結(jié)果顯示顯著差異基因富集于癌癥相關(guān)通路:胰腺癌、癌癥中的miRNAs、結(jié)直腸癌、癌癥通路、腎細(xì)胞癌、乳腺癌;代謝相關(guān)通路:胰島素抵抗、非酒精性脂肪肝、胰島素信號(hào)通路;神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)通路:長壽調(diào)節(jié)途徑、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)通路、長程增強(qiáng)效應(yīng);細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)通路:細(xì)胞循環(huán)途徑;還涉及炎癥相關(guān)通路:TNF信號(hào)通路、TGF-beta信號(hào)通路;以及前期生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的PI3K-AKT信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路,如圖12B。結(jié)合前期預(yù)測(cè)以及現(xiàn)有研究,選擇了胰島素抵抗(圖13A)、結(jié)直腸癌(圖13B)、PI3K-AKT信號(hào)通路(圖13C)、細(xì)胞循環(huán)途徑(圖13D)、Ras信號(hào)通路(圖13E)5個(gè)通路,將顯著差異詳細(xì)基因集做熱圖分析,如圖13,其中涉及MAPK10、PTEN、TGFB3等基因。

A:在Dr.Tom系統(tǒng)中篩選反映差異倍數(shù),同時(shí)篩選log2(處理組表達(dá)量/對(duì)照組表達(dá)量)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組基因,差異倍數(shù)數(shù)據(jù)選為1.5,對(duì)這2 234個(gè)基因進(jìn)行了KEGG通路富集;B:KEGG通路富集氣泡圖。

A:胰島素抵抗;B:結(jié)直腸癌;C:PI3K-AKT信號(hào)通路;D:細(xì)胞循環(huán)途徑;E:Ras信號(hào)通路。

3 討論

研究表明,miRNA可以實(shí)現(xiàn)生物學(xué)過程代謝和功能的調(diào)節(jié),涉及許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-RNA相互作用的機(jī)制[12]。miRNA表達(dá)豐度與許多疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān),但是因?yàn)閙iRNA種類和數(shù)量較多, 并且其表達(dá)具有時(shí)序性和組織特異性,其涉及的相關(guān)生物學(xué)過程以及發(fā)揮的具體作用還有待研究。生物信息學(xué)能夠快速預(yù)測(cè)miRNA的靶基因,可以實(shí)現(xiàn)將數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)的靶基因取交集后進(jìn)行生物功能相關(guān)分析,對(duì)后續(xù)研究奠定了一定的理論基礎(chǔ),本研究對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)資源進(jìn)行了整合分析。

miR-181a-5p可以通過參與細(xì)胞的增殖、凋亡和分化調(diào)節(jié)各種各樣的生物過程,但其具體作用機(jī)制、靶基因及其靶基因相關(guān)功能還未明了,在現(xiàn)有研究中,沒有對(duì)hsa-miR-181a-5p潛在靶點(diǎn)和相關(guān)功能通路的全面分析。本研究通過生信分析,發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p在36個(gè)物種中具有高度保守性,表明其可能參與編碼了重要的生命過程相關(guān)蛋白質(zhì)。

通過對(duì)miR-181a-5p的生物信息學(xué)分析,并結(jié)合現(xiàn)有的文獻(xiàn)研究,發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p可以通過其靶向基因在神經(jīng)系統(tǒng)、血液免疫系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)疾病以及癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究通過對(duì)hsa-miR-181a-5p在人體組織中的表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)hsa-miR-181a-5p在人體神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)水平最高。hsa-miR-181a-5p預(yù)測(cè)靶基因的GO功能生物過程結(jié)果也顯示,hsa-miR-181a-5p參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程。miR-181a-5p的異常表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。有研究表明miR-181a-5p和miR-181a-3p在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和血漿中的表達(dá)均降低,它們都是抗動(dòng)脈粥樣硬化的miRNA,可以通過靶向NF-κB信號(hào)通路抑制血管炎癥來限制動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展,恢復(fù)miR-181a-5p和miR-181a-3p可能是治療動(dòng)脈粥樣硬化的新治療方法[13]。還有研究表明miR-181a在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的表達(dá)增加,在miR-181a潛在調(diào)控的基因中,有幾個(gè)已知基因是神經(jīng)發(fā)育所必需的,包括Engrailed1(En1),Engrailed2(En2),Lmx1a和Brn2[14]。miR-181a-5p還在癲癇的發(fā)生和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用,miR-181a-5p的高表達(dá)會(huì)促進(jìn)癲癇的發(fā)展,miR-181a-5p的抑制可以通過靶基因SIRT1減弱癲癇引起的空間學(xué)習(xí)和記憶功能障礙[15]。miR-181a-5p在健康人與阿爾茲海默癥患者、新生兒缺氧缺血性腦病模型的血清中的表達(dá)也有差異出現(xiàn)[16-17]。通過對(duì)hsa-miRNA-181a-5p 的交集靶基因進(jìn)行KEGG通路富集,本研究發(fā)現(xiàn) hsa-miRNA-181a-5p的交集靶基因多數(shù)富集于MAPK信號(hào)通路。miR-181a可以通過抑制MAPK/JNK信號(hào)通路來調(diào)節(jié)帕金森病中細(xì)胞的凋亡和自噬過程[18],這與我們預(yù)測(cè)到的結(jié)果相符。綜上所述,hsa-miR-181a-5p或可成為神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病防治的新靶點(diǎn),值得進(jìn)一步的研究。

在血液免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病中,本研究預(yù)測(cè)結(jié)果顯示hsa-miRNA-181a-5p在多種血液系統(tǒng)相關(guān)疾病中高度表達(dá),例如白血病與淋巴瘤?，F(xiàn)在一些實(shí)驗(yàn)對(duì)臨床樣本進(jìn)行分析,結(jié)果也表明了hsa-miRNA-181a-5p在血液系統(tǒng)的重要性,Egyed 等[19-20]通過對(duì)臨床樣本微陣列分析得到結(jié)論:miRNA-181a可以作為小兒急性淋巴細(xì)胞白血病中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累的新型液體活檢標(biāo)志物,miRNA-181a也可以作為T細(xì)胞白血病和淋巴瘤的生物標(biāo)志物,這與腫瘤細(xì)胞化學(xué)耐藥性有關(guān),miR181a可能是治療T細(xì)胞惡性腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)。本研究生信結(jié)果顯示hsa-miR-181a-5p在急性髓系白血病的表達(dá)豐度最高?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),miR-181a本身的表達(dá)及活性水平發(fā)生改變都可以對(duì)白血病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行調(diào)節(jié),沉默miR-181a可被視為增強(qiáng)潑尼松龍治療白血病效果的策略[21]。如前所述,本研究通過生信預(yù)測(cè)得知,miR-181a靶基因多數(shù)富集于MAPK 信號(hào)通路,現(xiàn)在也有研究證實(shí),miR-181a的下調(diào)可以通過調(diào)節(jié)MAPK級(jí)聯(lián)過程中靶基因SOS1在白血病生成中起主要作用[22], miR-181a表達(dá)的上調(diào)可通過靶向MAP2K1表達(dá)和ERK/MAPK信號(hào)通路抑制白血病細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,降低耐藥性[23],miR-181a本身的活性水平也可直接下調(diào)NRAS,KRAS和MAPK1,對(duì)急性髓系白血病進(jìn)行調(diào)節(jié)[24]。還有研究表明,供體T細(xì)胞中的miR-181a表達(dá)可以調(diào)節(jié)同種異體骨髓移植后移植物抗宿主病[25]。miR-181a還可以通過調(diào)節(jié) ERK-MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)維持 DC-SIGN (單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞)的表達(dá)并限制單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞的活化[26]。生信分析結(jié)果顯示,hsa-miRNA-181a-5p的交集靶基因也富集于Ras信號(hào)通路, RalA是一種Ras下游信號(hào)分子和小GTP酶,在白血病生成中起重要作用,但確切的機(jī)制仍然難以捉摸,研究表明miR-181a可通過靶向RalA酶,激活Ras相關(guān)信號(hào)通路來促進(jìn)慢性粒細(xì)胞白血病轉(zhuǎn)化和進(jìn)展[27],現(xiàn)在miR-181a-5p靶基因通過靶向Ras信號(hào)通路調(diào)節(jié)生物學(xué)過程相關(guān)研究還較少,本研究可以為后續(xù)的靶向研究進(jìn)展提供一定的理論支持。

在骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病,現(xiàn)有一些臨床樣本研究與本研究預(yù)測(cè)到的結(jié)果相符,在骨關(guān)節(jié)炎研究中,Chang等[28]對(duì)臨床樣本進(jìn)行分析,結(jié)果顯示膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的關(guān)鍵miRNA包括miR-181a。Svitlana等[29]觀察到健康人軟骨組織中miR-181a表達(dá)水平在骨關(guān)節(jié)炎中被破壞,miR-181a在多發(fā)性骨髓瘤患者外周血和骨髓中的表達(dá)量增加,與多發(fā)性骨髓瘤的臨床病理指標(biāo)密切相關(guān)[30],miR-181a還可以通過靶向RASSF1A促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[31]。在機(jī)制通路研究方面,miR-181a/b-1 過表達(dá)可通過調(diào)節(jié) PI3K/AKT 信號(hào)傳導(dǎo)和線粒體代謝來增強(qiáng)成骨作用,這些發(fā)現(xiàn)對(duì)治療骨折或異位骨化等骨骼疾病有重要作用,Dong等[32]發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p介導(dǎo)的GAS1下調(diào)可以通過PI3K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎中滑膜成纖維細(xì)胞的增殖,這為后續(xù)膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的研究提供了新思路。還有研究表明,miR-181a-5p可通過調(diào)控Sirt1/PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡和分化[33]。以上研究提示hsa-miR-181a-5p與骨骼系統(tǒng)疾病密切相關(guān),但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

通過靶基因通路富集與相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研,發(fā)現(xiàn)hsa-miR-181a的異常表達(dá)與各種癌癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān),可作為癌基因或腫瘤抑制因子[10]。本研究對(duì)hsa-miR-181a-5p與疾病相關(guān)的生信分析中也可以得到結(jié)論:hsa-miR-181a與卵巢癌、鼻咽癌的發(fā)生密切相關(guān)。hsa-miR-181a的異常表達(dá)與多種癌癥相關(guān),例如紋肌肉瘤、宮頸癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌。Pozzo 等[34]發(fā)現(xiàn),miR-181a的上調(diào)通過減少癌細(xì)胞增殖可以改善小鼠融合陰性橫紋肌肉瘤。GRP78的高表達(dá)是宮頸癌的腫瘤促進(jìn)因子,miR-181a還可以通過下調(diào)GRP78抑制宮頸癌的發(fā)展[35]。miR-181a還可以通過靶向KRAS在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中起著至關(guān)重要的腫瘤抑制作用[36]。在通路相關(guān)研究中,胃癌腫瘤組織中miR-181a-5p的高表達(dá)與癌癥增殖和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),在機(jī)制研究上,miR-181a-5p可以通過激活RASSF6/MAPK信號(hào)通路在體外和體內(nèi)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和上皮到間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[37]。RASSF1作為一種MAPK信號(hào)因子,miR-181a通過下調(diào)RASSF1表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞索拉非尼耐藥[38]。Cai等[39]發(fā)現(xiàn)PGRMC1/EGFR-PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活是炔諾酮對(duì)人乳腺上皮MCF10A細(xì)胞促腫瘤發(fā)生作用的主要機(jī)制,miR-181a可通過此信號(hào)通路抑制炔諾酮促進(jìn)乳腺癌發(fā)生。miR-181a不僅可以直接調(diào)節(jié)下游分子,還可以作為靶分子對(duì)癌癥過程進(jìn)行調(diào)控,LncRNA SNHG12通過激活非小細(xì)胞肺癌中的miR-181a的MAPK/Slug通路,促進(jìn)其耐藥性[40]。綜上所述,miR-181a-5p與多種腫瘤的增殖與侵襲密切相關(guān),其對(duì)腫瘤細(xì)胞的調(diào)控作用取決于癌癥類型,還需要進(jìn)一步的探索與研究,miR-181a-5p有望成為腫瘤診斷、治療預(yù)后的生物標(biāo)志物和靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)組差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組基因KEGG通路富集結(jié)果與預(yù)測(cè)靶基因的KEGG通路富集結(jié)果相似,均提示hsa-miR-181a-5p與結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種癌癥發(fā)生發(fā)展的重要關(guān)聯(lián),同時(shí)與胰島素抵抗、非酒精性脂肪肝等代謝途徑相關(guān),以及與PI3K-AKT信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、細(xì)胞周期循環(huán)等涉及細(xì)胞增殖、凋亡等周期調(diào)節(jié)途徑顯著相關(guān),還涉及神經(jīng)營養(yǎng)因子等神經(jīng)系統(tǒng)方面信號(hào)通路,這與現(xiàn)有許多研究結(jié)果保持一致,進(jìn)一步印證了生信預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

根據(jù)生信分析及轉(zhuǎn)錄組驗(yàn)證,miR-181a-5p可能通過靶向PTEN調(diào)控PI3K-AKT信號(hào)通路。PTEN的磷酸酶活性負(fù)責(zé)將磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)。而PIP3是PI3K的產(chǎn)物,它激活A(yù)KT,進(jìn)而影響下游效應(yīng)蛋白的活性。當(dāng)PTEN表達(dá)正常時(shí),它通過抑制PI3K-AKT信號(hào)通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)過程。PTEN通常被認(rèn)為是一種抑制腫瘤發(fā)展的蛋白質(zhì),因?yàn)樗种芇I3K-AKT信號(hào)通路,防止異常細(xì)胞增殖和生存。PTEN的突變或缺失會(huì)導(dǎo)致PI3K-AKT信號(hào)通路的異常活化,促進(jìn)癌細(xì)胞的生長和存活,這被認(rèn)為是多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展的驅(qū)動(dòng)力之一。miR-181a-5p通過靶向PTEN調(diào)控PI3K-AKT信號(hào)通路也在現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)結(jié)論中得到了驗(yàn)證,其中涉及增殖調(diào)控相關(guān)癌癥的發(fā)展[41-44]。

miR-181a-5p可能通過靶向PPARA調(diào)控胰島素抵抗信號(hào)通路。PPARA(過氧化物酶體增殖激活受體-α)是核受體超家族中的一員,主要參與調(diào)控脂質(zhì)代謝和能量平衡[45]。與胰島素抵抗之間存在一些復(fù)雜的相互作用,涉及脂質(zhì)代謝、糖代謝和炎癥等多個(gè)生物學(xué)過程[46-47]。PPARA在肝臟中的表達(dá)被激活時(shí),可以促進(jìn)脂質(zhì)的氧化,尤其是脂肪酸的氧化。這有助于降低血漿中的脂質(zhì)水平,減少脂質(zhì)堆積,有利于改善胰島素敏感性。通過調(diào)控脂質(zhì)代謝,PPARA可能影響胰島素的敏感性。脂質(zhì)過多的堆積可能導(dǎo)致胰島素抵抗,而PPARA的激活可能有助于減少這種抵抗?？傮w而言,PPARA通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制炎癥以及對(duì)葡萄糖代謝的影響,可能在一定程度上影響胰島素的敏感性,從而對(duì)胰島素抵抗產(chǎn)生一定的影響。miR-181a-5p調(diào)控胰島素抵抗信號(hào)通路影響代謝相關(guān)疾病研究該領(lǐng)域仍在積極研究中[48-49],以助于更全面地理解這些分子之間的復(fù)雜關(guān)系。

綜上所述,本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)并結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)has-miR-181a-5p進(jìn)行分析討論,miR-181a-5p可以通過其靶向基因在神經(jīng)系統(tǒng)、血液免疫系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)疾病以及癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,為后續(xù)將miR-181a-5p作為新靶點(diǎn)研究疾病發(fā)生和防治機(jī)制提供了理論支持。