劉婷婷,黃志豪,楊紅霞,張建勇

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,貴州 遵義 563099;2.四川省自貢市第一人民醫(yī)院 感染科,四川 自貢 683000)

支氣管哮喘(bronchial asthma)簡(jiǎn)稱哮喘,是一種以慢性氣道炎癥為特征的異質(zhì)性疾病[1]。目前認(rèn)為氣道炎癥是哮喘發(fā)病的主要機(jī)制,但氣道炎癥的確切發(fā)病機(jī)制并未完全闡明。研究表明,包括氣道炎癥在內(nèi)的多種因素可導(dǎo)致氣道黏液高分泌,引起氣道黏液栓形成,阻塞氣道,是致死性哮喘發(fā)生的重要因素和評(píng)估哮喘病情嚴(yán)重程度的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2-3]。水飛薊賓是從水飛薊中提取的一種天然類黃酮物質(zhì),研究表明其具有較強(qiáng)的抗炎活性[4]。本研究觀察不同濃度水飛薊賓對(duì)氣道黏蛋白Muc5ac表達(dá)水平的影響,探討水飛薊賓對(duì)哮喘氣道黏液高分泌的影響及其機(jī)制,為哮喘的治療探索新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)6～8周齡雌性BALB/c 小鼠40只,購(gòu)自湖南斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(湘)2019-0004]。動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[NO:KLLY(A)-2020-076]。建模前,所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周。

1.1.2 主要藥品、試劑 雞卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)、水飛薊賓(Silybin,美國(guó)Sigma公司);氫氧化鋁凝膠(英國(guó)Invitrogen公司);小鼠IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(中國(guó)依科賽生物公司);阿利新藍(lán)-過(guò)碘酸雪夫(alcian blue/periodic acid schiff,AB-PAS)染色試劑盒、Masson染色試劑盒(北京索來(lái)寶生物科技有限公司);鼠抗細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)1/2、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(phospho-extracellular regulated protein kinases,pERK)、轉(zhuǎn)錄因子SP1(transcription factor SP1)單克隆抗體(中國(guó)艾菲生物公司);鼠抗Muc5ac單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(中國(guó)博士德公司);二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 主要儀器 壓縮式霧化器 NE-C900[歐姆龍(大連)有限公司];Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司);Centrifuge 5417R、5415D離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);光學(xué)顯微鏡NIKON YS100(日本NIKON公司);IPWin32采圖系統(tǒng)DM4000B(德國(guó)Lecia公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立 將小鼠隨機(jī)分為正常組(NS組)、哮喘組(AS組)、水飛薊賓40 mg/kg組(Silybin40組)、水飛薊賓80 mg/kg組(Silybin80組)、地塞米松組(DEX組),每組8只。AS組、DEX組、Silybin40組、Silybin80組于第1、13天予雞卵清白蛋白/氫氧化鋁凝膠溶液(40 μg OVA+1 mg 氫氧化鋁)腹腔注射聯(lián)合皮下注射致敏。第19～23天,以10% OVA溶液每次30 min,每天1次霧化激發(fā)。NS組致敏用PBS,激發(fā)用NS作為對(duì)照處理。AS組、DEX組、Silybin40組及Silybin80組分別于每次激發(fā)前30 min予PBS、地塞米松(dexamethasone,DEX)2 mg/kg、水飛薊賓40 mg/kg及水飛薊賓80 mg/kg腹腔注射。末次激發(fā)后 24 h 收樣。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗液(BALF) 炎癥細(xì)胞分類及計(jì)數(shù) 1.25%阿佛丁(2,2,2-三溴乙醇)小鼠麻醉劑充分麻醉處死小鼠后,行氣管插管術(shù),計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù),剩余予PBS進(jìn)行支氣管肺泡灌洗以制備支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF),灌洗液經(jīng)離心后取細(xì)胞沉淀重懸,涂片制片后行瑞士-吉姆薩染色,計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil,EOS)百分比。

1.2.3 BALF的IL-6、TNF-α水平檢測(cè) 按試劑盒說(shuō)明書操作,在 450 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行讀數(shù),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各相應(yīng)指標(biāo)的濃度。

1.2.4 肺組織病理切片HE、AB-PAS染色 小鼠肺組織用4%多聚甲醛浸泡固定 24 h,石蠟包埋,以4 μm厚度切片,行 HE、AB-PAS染色。對(duì)HE染色切片進(jìn)行支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分,5個(gè)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分別為無(wú)、少許、較多分布不均勻、大量均勻不成團(tuán)、大量均勻并成團(tuán),分?jǐn)?shù)為0～4分。AB-PAS染色:有酸性、中性及混合黏液物質(zhì)及細(xì)胞表達(dá),分別呈現(xiàn)藍(lán)色、紅色及紫紅色。應(yīng)用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件測(cè)量氣道黏液物質(zhì)相對(duì)著色面積進(jìn)行定量分析。

1.2.5 免疫組織化學(xué)(IHC)分析 石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、檸檬酸鹽抗原修復(fù)、山羊血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液孵育、DAB顯色、蘇木素復(fù)染細(xì)胞核、鹽酸酒精分化、脫水中性樹膠封片,顯微鏡鏡檢,圖像采集并用Image pro plus6.0軟件測(cè)量目標(biāo)蛋白的陽(yáng)性面積,以積分光密度(integral optical density,IOD)表示。

2 結(jié)果

2.1 水飛薊賓對(duì)哮喘小鼠BALF細(xì)胞總數(shù)及EOS的影響 AS組的BALF細(xì)胞總數(shù)及EOS百分比較NS組增加(P<0.05);與AS組相比,DEX組、水飛薊賓組BALF細(xì)胞總數(shù)及EOS百分比均降低(P<0.05),詳見表1。

表1 各組小鼠BALF細(xì)胞總數(shù)和EOS的變化

2.2 水飛薊賓對(duì)哮喘小鼠BALF的細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的影響 AS組小鼠BALF的細(xì)胞因子IL-6、TNF-α水平較NS組升高(P<0.05),且IL-6升高更明顯。與AS組相比,水飛薊賓及地塞米松干預(yù)組IL-6、TNF-α水平均下降(P<0.05),詳見表2。

表2 各組小鼠BALF中IL-6、TNF-α水平的變化

2.3 水飛薊賓對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的影響 與NS組相比,AS組肺組織表現(xiàn)出明顯的病理改變,包括明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道上皮黏膜不完整,氣道上皮細(xì)胞及杯狀細(xì)胞增生,管壁增厚,管腔狹窄,氣道黏液分泌增多,部分管腔內(nèi)可見黏液栓,將管腔完全阻塞(P<0.05)。而水飛薊賓及地塞米松干預(yù)組小鼠肺部炎癥反應(yīng)、氣道黏液分泌較AS組減輕(P<0.05)。詳見表3、圖1。

A:NS組氣道上皮細(xì)胞排列整齊,氣管及肺血管周圍少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);B:AS 組氣道大量黏液堵塞,氣管及肺血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);C～E:DEX組、Silybin40組與Silybin80組管腔通暢,氣道周圍少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);HE×200。

表3 各組小鼠支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)病理評(píng)分比較

2.4 水飛薊賓對(duì)哮喘小鼠氣道黏液物質(zhì)分泌的影響 AS組可見大量黏液物質(zhì)阻塞氣道,氣道上皮杯狀細(xì)胞增生,其表達(dá)高于NS組、Silybin40組、Silybin80組,而Silybin40組高于Silybin80組,以上組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2、表4。

A:NS組氣道中見極少杯狀細(xì)胞,未見黏液分泌;B:AS組氣道周圍可見大量的杯狀細(xì)胞,大量黏液分泌堵塞氣道;C～E:DEX組、Silybin40組與Silybin80組管腔通暢,氣道中見少量杯狀細(xì)胞,黏液分泌較少;AB-PAS×200。

表4 各組小鼠氣道黏液物質(zhì)相對(duì)著色面積的變化

2.5 水飛薊賓對(duì)哮喘小鼠的ERK、pERK、SP1和Muc5ac蛋白表達(dá)的影響 AS組顯示肺組織中pERK蛋白表達(dá)較NS組增加(P<0.05)。與AS組相比,水飛薊賓或地塞米松處理組ERK的磷酸化水平均降低(P<0.05)。Muc5ac、SP1蛋白的表達(dá)與pERK的變化趨勢(shì)一致(P<0.05)。而ERK在各組之間表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。詳見表5、圖3。

AS組小鼠肺組織中pERK、SP1、Muc5ac 的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性,NS 組表達(dá)較弱;水飛薊賓及地塞米松干預(yù)后上述蛋白的表達(dá)較AS 組進(jìn)一步減弱;而ERK的表達(dá)在各組之間表達(dá)無(wú)明顯差異;標(biāo)尺為50 μm,放大倍數(shù)為×200。

表5 各組小鼠ERK、pERK、SP1和Muc5ac蛋白表達(dá)IOD變化

3 討論

哮喘是一種由T細(xì)胞、EOS及肥大細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的慢性氣道疾病[5]。目前普遍認(rèn)為氣道炎癥和氣道重塑是哮喘的重要病理特征,兩者可導(dǎo)致氣道黏液高分泌,進(jìn)一步加重氣道阻塞[2,6-7]。氣道黏液高分泌的病理基礎(chǔ)是氣道上皮杯狀細(xì)胞增生、化生及黏液腺增生肥大以及由此導(dǎo)致的氣道黏蛋白Muc5ac水平升高[8-9]。但哮喘氣道黏液高分泌涉及多種細(xì)胞及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的參與,其確切的發(fā)生與調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全闡明。GINA及我國(guó)哮喘防治指南均推薦吸入性糖皮質(zhì)激素作為一線治療藥物。但部分患者存在激素抵抗、治療效果不佳,且長(zhǎng)期大量吸入糖皮質(zhì)激素可能出現(xiàn)不良反應(yīng),因此,尋求新藥及作用靶點(diǎn),長(zhǎng)期穩(wěn)定控制哮喘癥狀,對(duì)提高哮喘患者生活質(zhì)量具有重要的意義。

水飛薊賓是一種從植物水飛薊中分離出來(lái)的多酚類化合物。研究證明,水飛薊賓具有保肝、抗炎、抗氧化、抗纖維化、抑菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及神經(jīng)保護(hù)等廣泛的藥理作用[10-15]。Choi等[16]研究發(fā)現(xiàn),水飛薊賓通過(guò)抑制NF-κB途徑減少Th2促炎細(xì)胞因子的分泌,使OVA誘導(dǎo)的IFN-γ水平升高,從而調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡。EOS是參與哮喘氣道慢性炎癥的重要炎性細(xì)胞,其趨化受到Th2輔助細(xì)胞因子(如IL-4、IL-13)、促炎因子(如IL-6、TNF-α)以及特定的協(xié)調(diào)趨化因子(如EOS趨化因子和黏附因子)等多種細(xì)胞因子的調(diào)控[17]。IL-6和TNF-α可上調(diào)EOS趨化因子和黏附因子,引起EOS募集,促進(jìn)細(xì)胞因子釋放,導(dǎo)致氣道慢性炎癥反應(yīng)及氣道高反應(yīng)性等[18]。另外,氣道黏液分泌受到ERK/SP1信號(hào)通路的調(diào)節(jié),SP1轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的突變時(shí)會(huì)導(dǎo)致Muc5ac合成降低,當(dāng)SP1上游的ERK信號(hào)通路異常激活時(shí),ERK持續(xù)磷酸化,SP1與Muc5ac基因啟動(dòng)子持續(xù)結(jié)合,導(dǎo)致Muc5ac高分泌;而抑制ERK磷酸化,可減少M(fèi)uc5ac分泌和炎性細(xì)胞因子、炎性細(xì)胞數(shù)量的產(chǎn)生,減輕哮喘癥狀,減緩氣道重塑過(guò)程[19]。

本研究通過(guò)卵清蛋白致敏與激發(fā)構(gòu)建哮喘小鼠動(dòng)物模型,發(fā)現(xiàn) AS 組小鼠在激發(fā)過(guò)程中表現(xiàn)出毛發(fā)豎起、抓耳撓腮、呼吸急促、大小便失禁,甚至出現(xiàn)躁動(dòng)不安或活動(dòng)遲緩等表現(xiàn),且氣道炎癥評(píng)分、BALF 總細(xì)胞計(jì)數(shù)、EOS百分比、促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α水平、氣道黏液物質(zhì)著色面積及黏蛋白Muc5ac水平均較NS組顯著升高,提示成功建立哮喘小鼠模型。本研究結(jié)果表明哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞磷酸化ERK和SP1表達(dá)水平較NS組升高。而不同濃度水飛薊賓可減輕哮喘小鼠氣道炎癥水平,降低BALF細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的分泌水平,使氣道上皮細(xì)胞磷酸化ERK和SP1表達(dá)減少,氣道黏蛋白Muc5ac水平降低。水飛薊賓的治療作用可能與抑制ERK磷酸化和SP1表達(dá)有關(guān)[20]。即水飛薊賓可能通過(guò)抑制ERK/SP1信號(hào)通路,減少炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α表達(dá),抑制氣道炎癥和氣道黏蛋白Muc5ac分泌。本實(shí)驗(yàn)地塞米松干預(yù)組氣道炎癥與氣道黏蛋白Muc5ac較AS組明顯減低,提示糖皮質(zhì)激素可能通過(guò)多個(gè)環(huán)節(jié)全面抑制哮喘的氣道炎癥及氣道黏液高分泌。

綜上所述,水飛薊賓干預(yù)可抑制哮喘小鼠氣道炎癥和氣道黏液高分泌,其機(jī)制可能與抑制ERK/SP1信號(hào)通路有關(guān)。由于哮喘病理生理機(jī)制的復(fù)雜性及哮喘的藥物治療仍面臨新的挑戰(zhàn),水飛薊賓在哮喘治療中的作用、確切機(jī)制及未來(lái)的臨床應(yīng)用前景尚需更進(jìn)一步的研究。