李本根,朱 焓,付梓峰,李 成

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 泌尿外科,貴州 遵義 563099)

腎結(jié)石是工業(yè)化社會(huì)中最常見的泌尿系統(tǒng)疾病之一,超過80%的腎結(jié)石為草酸鈣結(jié)石[1]。目前腎結(jié)石主要治療方法分為手術(shù)治療和非手術(shù)治療,以手術(shù)取石為主[2]。雖然設(shè)備的改進(jìn)及醫(yī)生操作水平的提高使得結(jié)石清除達(dá)到滿意的療效,但腎結(jié)石的10年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)50%[3],給患者帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)及心理負(fù)擔(dān)。因此,降低結(jié)石復(fù)發(fā)率顯得至關(guān)重要。目前研究認(rèn)為高草酸尿、高鈣尿癥和活性氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激在草酸鈣結(jié)石的形成中至關(guān)重要[4-7],因此降低尿液中草酸和Ca2+濃度可以預(yù)防結(jié)石復(fù)發(fā)。臨床將枸櫞酸氫鉀鈉顆粒作為含鈣結(jié)石預(yù)防用藥,其治療機(jī)理為堿化尿液及提高尿枸櫞酸含量,臨床用藥較為單一。因此,通過益生菌干預(yù)調(diào)控腸道吸收草酸治療高草酸尿癥預(yù)防草酸鈣腎結(jié)石成為研究熱點(diǎn)[8]。由武漢康復(fù)得生物科技股份有限公司生產(chǎn)的酶化石復(fù)合菌粉通過食用菌發(fā)酵獲得的草酸降解酶調(diào)控腸道對(duì)草酸吸收,從而降低尿液中草酸含量,受到泌尿外科學(xué)者關(guān)注[9-10]。但是否可以抑制腎結(jié)石形成及對(duì)腎功能是否具有保護(hù)作用臨床爭(zhēng)議較大,因此探討酶化石復(fù)合菌粉治療效果具有重要意義。本研究通過酶化石復(fù)合菌粉治療草酸鈣結(jié)石大鼠,觀察結(jié)石及腎功能相關(guān)指標(biāo)的變化,從而探索其治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠24只,SPF級(jí),雄性10周齡,體重250～300 g,購買自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010。飼養(yǎng)條件:溫度20～26 ℃,濕度為30%～70%。本研究嚴(yán)格遵守國際通行的動(dòng)物福利與倫理準(zhǔn)則,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)審批(NO:ZMC21-2207-015)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 酶化石復(fù)合菌粉(武漢康復(fù)得生物科技股份有限公司);枸櫞酸氫鉀鈉顆粒(武漢維奧制藥有限公司);蘇木素返藍(lán)液、伊紅染色液(Servicebio);草酸檢測(cè)試劑盒(sigma);鈣檢測(cè)試劑盒、尿素檢測(cè)試劑盒、肌酐檢測(cè)試劑盒(山東博科);大鼠用丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒、過氧化氫酶(catalase, CAT)試劑盒;組織脫水機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司);兔抗NF-κB p65抗體(AF5006,Affinity);兔抗STAT3抗體(AF6294,Affinity);兔抗TNF-α抗體(AF7014,Affinity);兔抗IL-1β抗體(AF5103,Affinity);石蠟包埋機(jī)(Leica);切片機(jī)(Leica);攤片機(jī)(Leica);顯微鏡(OLYMPUS);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(北京六一);全自動(dòng)生化分析儀(山東博科)。

1.3 草酸鈣結(jié)石大鼠模型建立 動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,通過連續(xù)28 d飲用1%乙二醇水構(gòu)建草酸鈣結(jié)石大鼠模型[11]。對(duì)照組給予普通飲用水,模型組、酶化石粉組、枸櫞酸氫鉀鈉組飲用1%乙二醇水,同時(shí)酶化石菌粉組按0.4 g/kg(以成人體重70 kg按體表面積法進(jìn)行人-鼠間給藥量進(jìn)行換算)劑量灌胃酶化石菌粉,枸櫞酸氫鉀鈉組按0.9 g/kg(以成人體重70 kg按體表面積法進(jìn)行人-鼠間給藥量進(jìn)行換算)灌胃枸櫞酸氫鉀鈉。藥物配制的方法為:稱取酶化石菌粉 9.8 g,溶于245 mL純水,濃度為0.04 g/mL;稱取枸櫞酸氫鉀鈉22.5 g,溶于250 mL純水,濃度為0.09 g/mL。

1.4 生化檢測(cè) 第0天及第28天收集尿液,尾靜脈采集血液。造模結(jié)束后0、28 d,取大鼠血液、尿液行生化檢測(cè),血液用于測(cè)定血清尿素氮、肌酐和 Ca2+濃度;尿液用于測(cè)定尿草酸鹽和尿 Ca2+濃度。取血清和尿液樣本,5 000 g離心10 min,上機(jī)檢測(cè)。開機(jī)前檢查供水、檢查電源和檢查廢液連接;打開儀器總電源,打開儀器制冷電源和打開儀器主控電源;打開操作軟件確認(rèn)儀器狀態(tài),準(zhǔn)備試劑探測(cè)試劑余量進(jìn)行定標(biāo)質(zhì)控測(cè)試,錄入檢測(cè)項(xiàng)目尿素氮、肌酐和 Ca2+開始測(cè)試,測(cè)試完將數(shù)據(jù)導(dǎo)出,儀器維護(hù)保養(yǎng)后關(guān)閉儀器電源 。采用生化試劑盒檢測(cè)草酸的水平。取大鼠尿液樣本5 000 g離心10 min,按照試劑盒說明書進(jìn)行草酸檢測(cè),用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定各孔吸光度(OD)值。

1.5 大鼠腎組織氧化應(yīng)激水平檢測(cè) 采用ELISA檢測(cè)MDA、SOD、GSH-PX、CAT的水平。取28 d后各組大鼠血清,5 000 g離心10 min,按照說明書進(jìn)行操作,具體操作步驟如下:ELISA試劑盒室溫下復(fù)溫,配制標(biāo)準(zhǔn)液,設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔,空白孔中不加樣本及酶標(biāo)試劑,向其余各孔中加入50 μL樣本或標(biāo)準(zhǔn)品,加入酶標(biāo)試劑100 μL,37 ℃孵育1 h。洗板5次后,加入顯色劑,37 ℃孵育15 min,加入終止液終止反應(yīng),在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度值,根據(jù)相應(yīng)公式計(jì)算濃度。

1.6 HE染色及偏光顯微鏡觀察大鼠腎臟組織草酸鈣晶體形成 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頸處死各組大鼠,取左腎腎組織石蠟切片(4～6 μm)經(jīng)烤片、脫蠟、水化后,用蘇木素染液染色3～5 min,流水沖洗后,用1%鹽酸酒精分化,反藍(lán)液反藍(lán),伊紅染色3～5 min后,切片脫水,封片。在偏光顯微鏡下觀察腎組織草酸鈣晶體沉積情況。觀察5個(gè)視野中大鼠腎組織腎小管草酸鈣晶體形成情況并拍照,統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野草酸鈣晶體數(shù)量,取平均值,共重復(fù)10次。

1.7 免疫組化檢測(cè)NF-κB p65、STAT3、TNF-α、IL-1β在腎組織中的表達(dá) 采用免疫組化檢測(cè)NF-κB p65、STAT3、TNF-α、IL-1β在腎組織中的表達(dá)情況。大鼠右腎組織切片,烤片、脫蠟、水化后,用檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。經(jīng)5% BSA抗原封閉后,用兔抗NF-κB p65抗體(1∶100)、兔抗STAT3抗體(1∶100)、兔抗TNF-α抗體(1∶100)、兔抗IL-1β抗體(1∶100)進(jìn)行一抗孵育,4 ℃過夜后,進(jìn)行辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶100)孵育,經(jīng)DAB顯色,蘇木精復(fù)染反藍(lán),脫水透明后,封片,在顯微鏡(BX43,Olympus)下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠尿液、血液生化基線指標(biāo) 大鼠模型建立成功前,對(duì)各組大鼠尿液中的Ca2+、草酸,及血清中的尿素、肌酐、Ca2+等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示具有可比性(表1)。

表1 大鼠尿液、血液生化基線指標(biāo)(n=6)

2.2 酶化石復(fù)合菌粉對(duì)大鼠腎臟中草酸鈣結(jié)晶沉積的影響 如圖1所示,對(duì)照組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常,部分腎小管管腔擴(kuò)張,無草酸鈣結(jié)晶,無炎性細(xì)胞浸潤。模型組中,結(jié)構(gòu)紊亂,腎小管管腔內(nèi)充滿草酸鈣結(jié)晶,間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤。與模型組對(duì)比,酶化石復(fù)合菌粉治療組、枸櫞酸氫鉀鈉組的腎小管結(jié)構(gòu)紊亂減輕,腎小管管腔內(nèi)充滿草酸鈣結(jié)晶減少,炎性浸潤大量減少。

A:對(duì)照組;B:模型組;C:酶化石復(fù)合菌粉組;D:枸杞酸氫鉀鈉組,箭頭表示結(jié)晶位置;標(biāo)尺為100 μm。

2.3 酶化石復(fù)合菌粉對(duì)大鼠尿液草酸及Ca2+濃度,及血清中的尿素、肌酐、Ca2+的影響 如表2所示,28 d尿液中的Ca2+、草酸與對(duì)照組相比,模型組顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,酶化石復(fù)合菌粉治療組、枸櫞酸氫鉀鈉組的Ca2+、草酸含量均下降(P<0.05)。28 d血清中,與對(duì)照組相比,尿素、肌酐在模型組中升高(P<0.05)。與模型組相比,尿素、肌酐在酶化石復(fù)合菌粉治療組、枸櫞酸氫鉀鈉組的含量下降(P<0.05),而血清Ca2+在各組之間的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 干預(yù)28d時(shí)大鼠尿液、血液生化指標(biāo)(n=6)

2.4 酶化石復(fù)合菌粉對(duì)大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 如圖2所示,與對(duì)照組比較,模型組CAT、GSH-PX和SOD指標(biāo)水平下降,而MDA指標(biāo)水平升高(P< 0.05)。與模型比較,酶化石復(fù)合菌粉治療組和枸櫞酸氫鉀鈉組中CAT、GSH-PX和SOD指標(biāo)水平升高,而MDA指標(biāo)下降(P<0.05)。

*:與對(duì)照組比較,P <0.05;#:與模型組比較,P < 0.05。

2.5 酶化石復(fù)合菌粉對(duì)大鼠腎臟NF-κB p65、STAT3、TNF-α及IL-1β表達(dá)的影響 如圖3及圖4所示,通過免疫組化方法對(duì)大鼠腎臟染色,明確大鼠腎臟NF-κB p65、STAT3、TNF-α、IL-1β的表達(dá)。結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組NF-κB p65、STAT3、TNF-α、IL-1β在腎臟組織中的表達(dá)上升(P<0.05);與模型比較,酶化石復(fù)合菌粉治療組和枸櫞酸氫鉀鈉組中NF-κB p65、STAT3、TNF-α、IL-1β表達(dá)降低(P<0.05)。

比例尺 400∶1。

*:與對(duì)照組比較,P <0.05;#:與模型組比較,P<0.05。

3 討論

目前研究認(rèn)為高草酸尿、高鈣尿是引起腎結(jié)石發(fā)生的重要原因[3-4]。血清肌酐及尿素水平在腎小球損傷或功能減退時(shí)升高,研究發(fā)現(xiàn)腎結(jié)石也可引發(fā)血清中的肌酐和尿素含量升高[12-13]。在我們構(gòu)建的草酸鈣結(jié)石大鼠模型中,HE結(jié)果顯示模型組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)紊亂,部分腎小管管腔內(nèi)充滿草酸鈣結(jié)晶。在本研究中,我們同樣發(fā)現(xiàn),模型組的大鼠(28 d)鈣離子(Ca2+)、草酸在尿液的含量增加,肌酐、尿素在血清中的含量增加。當(dāng)我們用酶化石復(fù)合菌粉治或枸櫞酸氫鉀鈉治療后,肌酐、草酸在尿液的含量下降,肌酐、尿素在血清中的含量下降。枸櫞酸氫鉀鈉顆粒作為治療腎結(jié)石有效藥物之一,其治療機(jī)理為堿化尿液及提高尿枸櫞酸含量抑制腎結(jié)石形成.而酶化石復(fù)合菌粉治療機(jī)理則是通過食用菌發(fā)酵獲得的草酸降解酶調(diào)控腸道對(duì)草酸吸收,降低尿液中草酸含量抑制腎結(jié)石形成。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶化石復(fù)合菌粉治療組和枸櫞酸氫鉀鈉治療組都可以降低尿液中Ca2+、草酸及血清中尿素、肌酐,但兩者之間無顯著性差異,說明酶化石復(fù)合菌粉可以起到類似枸櫞酸氫鉀鈉顆粒減輕腎結(jié)石的作用。

近年來,有研究[14]表明氧化應(yīng)激損傷參與腎結(jié)石的發(fā)生。結(jié)石患者血清中抗氧化酶水平與正常組相比有所下降。CAT作為一種過氧化氫酶,可以分解H2O2并可能調(diào)節(jié)細(xì)胞中活性氧,具有抗氧化應(yīng)激的作用,保護(hù)器官免受活性氧的傷害[11]。活性氧的產(chǎn)生是氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的關(guān)鍵步驟,導(dǎo)致丙二醛(MDA)、NO和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)水平升高,SOD、CAT和GSH-px水平降低[15]。GSH-Px可以保護(hù)細(xì)胞免受過氧化物引起的氧化損傷[16]。CAT、GSH-Px在結(jié)石的腎臟組織中含量低,致使器官喪失了及時(shí)清除過氧化產(chǎn)物(如活性氧、MDA)的能力,導(dǎo)致組織損傷[17-18]。在模型組中CAT、GSH-Px、SOD的含量下降,而MDA含量上升,說明模型組大鼠遭受了過氧化損傷。當(dāng)酶化石復(fù)合菌粉治或枸櫞酸氫鉀鈉治療后,CAT、GSH-Px、SOD含量上升,MDA含量下降,說明藥物減輕了機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷。

氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的氧化產(chǎn)物水平的升高會(huì)通過NF-κB和JAK-STAT通路導(dǎo)致一系列炎癥因子的釋放[14]。NF-κB家族由五種蛋白質(zhì)組成,通過形成同源或異源二聚體發(fā)揮作用[19]。NF-κB抑制因子α(IκBα)與p65的核定位信號(hào)(NLS)的結(jié)合,使p50/p65在細(xì)胞質(zhì)中保持非活性;當(dāng)存在TNF-α?xí)r,會(huì)激活I(lǐng)κB激酶(IKK),激活的IKKβ磷酸化IκBα,促使IκBβ泛素化并被蛋白酶體降解,隨后p50/p65易位進(jìn)入細(xì)胞核,激活下游基因的表達(dá)[20]。NF-κB p65、STAT3在腎結(jié)石發(fā)生中有重要作用,會(huì)促進(jìn)腎臟器官的損傷,并造成炎癥[21-24]。我們同樣發(fā)現(xiàn),NF-κB p65、STAT3及炎癥因子(TNF-α、IL-1β)在模型組腎臟組織中的表達(dá)量增加;用酶化石復(fù)合菌粉治或枸櫞酸氫鉀鈉治療后,NF-κB p65、STAT3及炎癥因子(TNF-α、IL-1β)表達(dá)量下降。說明酶化石復(fù)合菌粉可以減輕腎臟炎癥反應(yīng)。

綜上所述,酶化石復(fù)合菌粉能夠降低尿草酸、Ca2+含量,增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激,具有抑制腎結(jié)石形成及對(duì)腎功能的保護(hù)作用。該結(jié)果可為后續(xù)的機(jī)制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)或依據(jù)。不足之處是本研究?jī)H初步明確了酶化石復(fù)合菌粉可以抑制大鼠腎結(jié)石形成及對(duì)腎功能具有保護(hù)作用,有待進(jìn)一步證實(shí)并揭示酶化石復(fù)合菌粉對(duì)草酸鈣結(jié)石形成的抑制及保護(hù)腎功能作用機(jī)制,有望為臨床草酸鈣結(jié)石的防治提供一種新的藥物。