袁東杰，李艷峰，盧振民

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科，河南 新鄉(xiāng) 453100

鼻咽癌是臨床上常見的頭頸部惡行腫瘤，發(fā)病率為耳鼻咽喉惡性腫瘤之首，具很強(qiáng)的地域分布性，常發(fā)于我國南方地區(qū)[1]。目前，臨床上關(guān)于鼻咽癌患者治療主要通過同步放化療方式，但是長期的放化療容易造成患者復(fù)發(fā)和病灶轉(zhuǎn)移[2]。因此，積極探尋鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制及相關(guān)治療靶點(diǎn)是目前迫切需要的。細(xì)胞自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移及耐藥性中發(fā)揮雙重調(diào)控作用，被認(rèn)為是腫瘤治療潛在的重要機(jī)制[3]。多項(xiàng)研究證實(shí)，細(xì)胞自噬參與了鼻咽癌細(xì)胞的增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移[4-5]。激活細(xì)胞自噬能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。但也有部分研究證實(shí)，自噬對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的增殖和生長具有顯著的促進(jìn)作用，通過激活細(xì)胞自噬能夠抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，提高鼻咽癌細(xì)胞的存活[7-8]。以上研究表明自噬在鼻咽癌中可能發(fā)揮“雙刃劍”作用。因此，以細(xì)胞自噬為靶點(diǎn)的研究將對(duì)鼻咽癌新藥的開發(fā)具有重大意義。

牡荊素是一種天然的生物活性黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化以及抗腫瘤等多種生物學(xué)活性，且對(duì)疾病的治療效果較為顯著，不良反應(yīng)小、安全性較高等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是一種極具開發(fā)潛力的活性天然化合物[9-10]。研究顯示，牡荊素能夠發(fā)揮抗結(jié)直腸癌[11]、肺癌[12]、肝癌[13]等作用。Wang 等[14]研究證實(shí)，牡荊素能夠通過調(diào)控核因子-κB（NF-κB）通路誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長，表明牡荊素可能是未來鼻咽癌潛在的治療藥物。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/UNC-51 樣激酶1（ULK1）是介導(dǎo)細(xì)胞自噬形成的重要信號(hào)通路，參與鼻咽癌細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生[15]。Zhang 等[16]研究證實(shí)，牡荊素能過夠通過激活A(yù)MPK 信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞自噬，改善氧化低密度脂蛋白介導(dǎo)的內(nèi)皮損傷。此外，牡荊素能夠通過激活A(yù)MPK/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平升高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制腎細(xì)胞癌生長[17]。以上研究提示牡荊素很有可能通過調(diào)控AMPK/ULK1 介導(dǎo)的細(xì)胞自噬途徑抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤生長。為此，本研究擬通過對(duì)BALB/c 裸鼠左側(cè)前肢腋窩下接種CNE-2 細(xì)胞構(gòu)建鼻咽癌裸鼠成瘤模型，探究牡荊素對(duì)其移植瘤生長及AMPK/ULK1 介導(dǎo)的細(xì)胞自噬通路的影響，旨在闡明牡荊素抗鼻咽癌生長的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和動(dòng)物 人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；50 只SPF 級(jí)的BALB/c 裸鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～20 g，周齡4～6 周，動(dòng)物購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2021-0012]。動(dòng)物飼養(yǎng)于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度60%～70%，晝夜12 h/12 h 交替光照，自由飲食，飲水，所有小鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)LLSC2021-11-002）。

1.1.2 試劑 牡荊素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20220312）；AMPK激動(dòng)劑AICAR、AMPK 抑制劑Compound C（美國Selleck 公司，貨號(hào)S1802、S7306）；蘇木素–伊紅（HE）染色試劑盒、TUNEL 染色檢測試劑盒、蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、ECL 發(fā)光液、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）小鼠單克隆抗體、DAPI 染色液（上海碧云天生物技術(shù)公司，貨號(hào)C0105S、C1091、P0011、P0018FS、A0409、A0413、AF5001、C1005）；免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)SP-9001）；Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）抗體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）抗體、p-AMPK（Thr172）抗體、AMPK、p-ULK1（Ser317）抗體、ULK1 抗體、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）-II抗體、泛素結(jié)合蛋白（p62）抗體（美國Cell Signaling Technology 公司，貨號(hào)2772、9662、15071、50081、2532、37762、8054、2775、5114）。

1.1.3 儀器 Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 伯樂公司）；CKX53 型熒光倒置顯微鏡（日本奧林巴斯）；H3-18KR 型高速冷凍離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）；LD-96A 型酶標(biāo)儀（山東萊恩德智能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞裸鼠移植瘤模型構(gòu)建[18]、分組及給藥 取對(duì)數(shù)生長期的人鼻咽癌CNE-2 制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。將0.2 mL 細(xì)胞懸液sc 于裸鼠左側(cè)前肢腋窩下，以皮下腫瘤組織隆起直徑大于0.5 cm 視為模型構(gòu)建成功。待裸小鼠移植瘤模型構(gòu)建成功后將其隨機(jī)分為模型組、牡荊素（5、10 mg/kg）組、AICAR（200 mg/kg）組、牡荊素（10 mg/kg）＋Compound C（20 mg/kg）組，每組各10 只。牡荊素臨用前使用生理鹽水稀釋至所需濃度。

牡荊素組裸鼠分別ig 5、10 mg/kg 牡荊素[19]；AICAR 組裸鼠ip 200 mg/kg AICAR；牡荊素＋Compound C 組裸鼠ig 10 mg/kg 牡荊素的同時(shí)ip 20 mg/kg Compound C[20]；模型組裸鼠ig 等量的生理鹽水，各組均給藥1 次/d，連續(xù)給藥21 d。給藥后，次日將裸鼠頸椎脫臼處死，并剝離腫瘤組織進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測。

1.2.2 移植瘤生長體積、質(zhì)量及抑瘤率測定 各組裸鼠于造模成功后3、7、14、21 d，利用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體長徑（a）和短徑（b），并計(jì)算腫瘤體積。21 d 后各組裸鼠ip 戊巴比妥鈉麻醉，行頸椎脫臼處死，剝離腫瘤體，稱量質(zhì)量（W），計(jì)算抑瘤率。

腫瘤體積＝（a×b2）/2

抑瘤率＝1－W給藥/W模型

1.2.3 腫瘤組織病理學(xué)觀察 將腫瘤體組織放于4%的多聚甲醛中固定24 h、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、組織石蠟包埋、切片，行HE 染色、封片、復(fù)染，之后于顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 TUNEL 染色檢測腫瘤組織細(xì)胞凋亡 按照TUNEL 染色試劑盒進(jìn)行染色，通過光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)。其中TUNEL 陽性細(xì)胞核呈棕黃色顆粒，即為凋亡細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選取6 個(gè)視野，計(jì)算TUNEL 陽性細(xì)胞率。

TUNEL 陽性細(xì)胞率＝TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)

1.2.5 免疫組化檢測腫瘤組織LC3-II、p62 蛋白表達(dá) 給藥21 d 后，各組裸鼠ip 戊巴比妥鈉麻醉，行頸椎脫臼處死，剝離瘤體組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，乙醇脫水，石蠟包埋、切片后采用內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑阻斷、抗原修復(fù)、組織封閉后，滴加LC3-II 抗體、p62 抗體（1∶500），孵育過夜，對(duì)應(yīng)二抗孵育2 h，滴加DAB 顯色液，蘇木素復(fù)染，于200 倍顯微鏡下觀察腫瘤體組織LC3-II、p62 著色情況，并通過Image Pro-Plus 6.0 軟件分析腫瘤體組織LC3-II 及p62 蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 免疫熒光檢測腫瘤組織LC3-II、Caspase-3 蛋白表達(dá) 將各組裸小鼠腫瘤組織切片放入PBS 緩沖液中清洗，經(jīng)0.2% TritionX-100 透化5 min，PBS緩沖液清洗后10%的BSA 溶液封閉60 min，阻斷非特異性反應(yīng)，去除切片上殘留的BSA 后，行雙重免疫熒光染色，室溫條件下分別孵育LC3-II 抗體（1∶200）和Caspase-3 抗體（1∶200）4 h，去除一抗后避光條件下孵育熒光素酶標(biāo)記的山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗2 h，PBS 緩沖液清洗后，DPAI 進(jìn)行細(xì)胞核染色5 min，最后滴加抗熒光淬滅劑，避光條件下熒光顯微鏡下觀察并拍照。LC3-II、Caspase-3 表達(dá)水平以平均熒光強(qiáng)度表示。

平均熒光強(qiáng)度＝區(qū)域熒光強(qiáng)度總和/區(qū)域面積

1.2.7 Western blotting 檢測AMPK/ULK1 通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 末次給藥結(jié)束后，立即將裸鼠處死，剝離腫瘤體并提取總蛋白，按照質(zhì)量與體積比1∶5 加入細(xì)胞裂解液，于4 ℃條件下裂解40 min；BCA 法測定各組腫瘤組織蛋白質(zhì)濃度；蛋白上樣（按照每孔上樣量30 μg 計(jì)算得出上樣體積）；凝膠電泳；濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜；5% BSA 室溫封閉2 h；分別加p-AMPK 抗體（1∶500）、AMPK 抗體（1∶500）、p-ULK1 抗體（1∶500）、ULK1 抗體（1∶500）、Bax抗體（1∶1 000）、Bcl-2 抗體（1∶1 000）、Caspase-3（1∶500）、β-actin 抗體（1∶2 000），4 ℃條件下孵育16 h；37 ℃條件下二抗孵育60 min；去除二抗后TBST 洗膜15 min；滴加顯影液后于Gel Doc XR+成像系統(tǒng)中顯影拍照，并采用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)條帶灰度值半定量分析。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以表示，數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布且方差齊性，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 牡荊素對(duì)鼻咽癌裸鼠移植瘤生長的影響

給藥后3 d，各組裸鼠移植瘤體積組間比較均無顯著差異。給藥后7、14、21 d，與模型組相比，牡荊素各劑量組、AICAR 組移植瘤體積均明顯減?。≒＜0.05）。給藥后7、14、21 d，與牡荊素10 mg/kg組相比，牡荊素＋Compound C 組移植瘤體積顯著增大（P＜0.05）。

給藥后21 d，與模型組相比，牡荊素各劑量組、AICAR 組移植瘤質(zhì)量均顯著降低（P＜0.05）。與牡荊素10 mg/kg 組相比，牡荊素＋Compound C 組移植瘤質(zhì)量顯著增加（P＜0.05），各給藥組腫瘤抑制率分別為24.86%、35.26%、25.92%、13.76%，見圖1、表1。

表1 各組裸鼠鼻咽癌細(xì)胞移植瘤生長變化（，n=10）Table 1 Growth changes of transplanted nasopharyngeal carcinoma cells of nude mice in each group (,n=10)

表1 各組裸鼠鼻咽癌細(xì)胞移植瘤生長變化（，n=10）Table 1 Growth changes of transplanted nasopharyngeal carcinoma cells of nude mice in each group (,n=10)

與模型組比較：*P＜0.05；與牡荊素10 mg?kg?1組比較：#P＜0.05。*P <0.05 vs model group;#P <0.05 vs vitexin 10 mg?kg?1 group.

圖1 牡荊素裸鼠移植瘤生長的影響Fig.1 Effect of vitexin on the growth of transplanted tumors in nude mice

2.2 牡荊素對(duì)鼻咽癌裸鼠移植瘤病理學(xué)的影響

與模型組相比，牡荊素各劑量組、AICAR 組腫瘤細(xì)胞生長較差，可見腫瘤細(xì)胞排列疏松，部分細(xì)胞胞質(zhì)減少，細(xì)胞核出現(xiàn)不同程度的固縮，細(xì)胞間出現(xiàn)淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤。與牡荊素10 mg/kg 組相比，牡荊素＋Compound C 腫瘤組織細(xì)胞生長狀態(tài)良好，腫瘤細(xì)胞排列相對(duì)緊密，細(xì)胞間淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤明顯降低，見圖2。

圖2 各組裸鼠移植瘤組織病理學(xué)變化（HE，×400）Fig.2 Pathological changes of xenograft tissues in nude mice of each group (HE,× 400）

2.3 牡荊素對(duì)鼻咽癌裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡的影響

與模型組相比，牡荊素各劑量組、AICAR 組移植瘤中Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。與牡荊素10 mg/kg 組相比，牡荊素高劑量＋Compound C 組移植瘤中Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡率均顯著降低（P＜0.05），見圖3、4 和表2。

表2 各組鼻咽癌裸鼠移植瘤組織Bax/Bcl-2、Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)和細(xì)胞凋亡率比較（，n=10）Table 2 Comparison of Bax/Bcl-2,Caspase-3 protein relative expression and apoptosis rate in nasopharyngeal carcinoma xenograft tissues of nude mice in each group (,n=10)

表2 各組鼻咽癌裸鼠移植瘤組織Bax/Bcl-2、Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)和細(xì)胞凋亡率比較（，n=10）Table 2 Comparison of Bax/Bcl-2,Caspase-3 protein relative expression and apoptosis rate in nasopharyngeal carcinoma xenograft tissues of nude mice in each group (,n=10)

與模型組比較：*P＜0.05；與牡荊素10 mg?kg?1組比較：#P＜0.05。*P <0.05 vs model group;#P <0.05 vs vitexin 10 mg?kg?1 group.

圖3 各組裸鼠移植瘤組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達(dá)條帶圖Fig.3 Bands of Bax,Bcl-2,and Caspase-3 protein expression in xenograft tissues of nude mice in each group

圖4 各組鼻咽癌裸鼠移植瘤組織細(xì)胞凋亡染色（TUNEL，×400）Fig.4 Apoptosis staining of nasopharyngeal carcinoma xenograft tissues in nude mice of each group (TUNEL,×400)

2.4 牡荊素對(duì)鼻咽癌裸鼠移植瘤細(xì)胞自噬的影響

與模型組相比，牡荊素各劑量組和AICAR 組移植瘤組織中細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-II 表達(dá)顯著升高，p62 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。與牡荊素10 mg/kg 組相比，牡荊素＋Compound C 組裸鼠腫瘤組織LC3-II 表達(dá)顯著降低，p62 表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見圖5、表3。

表3 各組鼻咽癌裸鼠移植瘤組織中LC3-II、p62 蛋白相對(duì)表達(dá)比較（，n=10）Table 3 Comparison of LC3-II and p62 protein relative expression in nasopharyngeal carcinoma xenograft tissues of nude mice in each group (,n=10)

表3 各組鼻咽癌裸鼠移植瘤組織中LC3-II、p62 蛋白相對(duì)表達(dá)比較（，n=10）Table 3 Comparison of LC3-II and p62 protein relative expression in nasopharyngeal carcinoma xenograft tissues of nude mice in each group (,n=10)

與模型組比較：*P＜0.05；與牡荊素10 mg?kg?1組比較：#P＜0.05。*P <0.05 vs model group;#P <0.05 vs vitexin 10 mg?kg?1 group.

圖5 各組鼻咽癌裸鼠移植瘤組織中LC3-II、p62 表達(dá)（IHC，×200）Fig.5 Expression of LC3-II and p62 in nude mice xenograft tissues nasopharyngeal carcinoma tissues in each group (IHC,×200）

2.5 牡荊素對(duì)鼻咽癌裸鼠移植瘤組織LC3-II 和Caspase-3 熒光表達(dá)的影響

免疫熒光檢測顯示，與模型組相比，牡荊素各劑量組和 AICAR 組移植瘤組織中 LC3-II 和Caspase-3 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。與牡荊素10 mg/kg 組相比，牡荊素＋Compound C 組能夠抑制牡荊素對(duì)LC3-II 和Caspase-3 的表達(dá)，見圖6、表4。

表4 各組鼻咽癌裸鼠移植瘤組織中LC3-II、Caspase-3 平均熒光強(qiáng)度表達(dá)比較（，n=10）Table 4 Comparison of LC3-II and Caspase-3 mean fluorescence intensity expression in nasopharyngeal carcinoma xenograft tissues of nude mice in each group (,n=10)

表4 各組鼻咽癌裸鼠移植瘤組織中LC3-II、Caspase-3 平均熒光強(qiáng)度表達(dá)比較（，n=10）Table 4 Comparison of LC3-II and Caspase-3 mean fluorescence intensity expression in nasopharyngeal carcinoma xenograft tissues of nude mice in each group (,n=10)

與模型組比較：*P＜0.05；與牡荊素10 mg?kg?1組比較：#P＜0.05。*P <0.05 vs model group;#P <0.05 vs vitexin 10 mg?kg?1 group.

圖6 各組鼻咽癌裸鼠移植瘤組織中LC3-II、Caspase-3 平均熒光強(qiáng)度表達(dá)（IF，×400）Fig.6 Mean fluorescence intensity expression of LC3-II and Caspase-3 in nude mice xenograft tissues nasopharyngeal carcinoma tissues in each group (IF,×400）

2.6 牡荊素對(duì)鼻咽癌裸鼠移植瘤組織 AMPK/ULK1 信號(hào)通路的影響

與模型組相比，牡荊素各劑量組、AICAR 組移植瘤組織中p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1 均顯著升高（P＜0.05）。與牡荊素10 mg/kg 組相比，牡荊素＋Compound C 組移植瘤組織中 p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1 比值均顯著降低（P＜0.05），見圖7、表5。

表5 各組鼻咽癌裸鼠移植瘤組織p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1 水平比較（，n=10）Table 5 Comparison of p-AMPK/AMPK,p-ULK1/ULK1 levels in nasopharyngeal carcinoma xenograft tissues of nude mice in each group (,n=10)

表5 各組鼻咽癌裸鼠移植瘤組織p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1 水平比較（，n=10）Table 5 Comparison of p-AMPK/AMPK,p-ULK1/ULK1 levels in nasopharyngeal carcinoma xenograft tissues of nude mice in each group (,n=10)

與模型組比較：*P＜0.05；與牡荊素10 mg?kg?1組比較：#P＜0.05。*P <0.05 vs model group;#P <0.05 vs vitexin 10 mg?kg?1 group.

圖7 各組裸鼠移植瘤組織中AMPK/ULK1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)條帶圖Fig.7 Expression bands of AMPK/ULK1 pathway related proteins in xenograft tissues of nude mice in each group

3 討論

鼻咽癌來源鼻黏膜上皮，是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，具有明顯的地域差異，同步方化療被認(rèn)為是臨床上治療局部晚期鼻咽癌的主要手段。臨床研究發(fā)現(xiàn)，長期的化療藥物治療鼻咽癌具有不良反應(yīng)大，敏感性差等缺點(diǎn)，常常導(dǎo)致鼻咽癌患者的治療效果不佳[8]。近年來，中醫(yī)藥在腫瘤的治療中顯現(xiàn)明顯的優(yōu)勢(shì)和特色，能夠有效改善患者治療的有效率，提高患者的生活質(zhì)量。多項(xiàng)研究表明，中藥可以通過多靶點(diǎn)、多途徑抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[21-22]。牡荊素是一種生物活性黃酮類化合物，多存在于山里紅葉、山楂干燥成熟果實(shí)或山楂葉中，具有顯著抗炎、抗氧化及抗腫瘤等生物學(xué)功能，其中在抗腫瘤生物學(xué)作用中對(duì)于牡荊素的研究主要局限于肝癌、肺癌、結(jié)直腸癌等[9]，是否對(duì)其他類型的癌癥具有同樣的治療作用尚不清楚。此外，既往多數(shù)關(guān)于牡荊素抗腫瘤的研究僅停留在細(xì)胞水平，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究相對(duì)缺乏[9]。為此，本研究首先通過構(gòu)建鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，觀察牡荊素對(duì)腫瘤生長的影響。結(jié)果顯示，與模型組相比，牡荊素各劑量組腫瘤體積明顯減小，腫瘤質(zhì)量明顯減輕，且腫瘤細(xì)胞生長較差，可見腫瘤細(xì)胞排列疏松，部分細(xì)胞胞質(zhì)減少，細(xì)胞核出現(xiàn)不同程度的固縮，細(xì)胞見出現(xiàn)淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤，細(xì)胞凋亡率和 Caspase-3 蛋白表達(dá)和Bax/Bcl-2 均顯著升高，表明牡荊素具有抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤生長的作用。

細(xì)胞自噬是一種程序化的細(xì)胞內(nèi)的降解機(jī)制，通過清除受損的細(xì)胞器、非功能性蛋白質(zhì)以及病原微生物等并遞送至溶酶體中消化降解，并將回收營養(yǎng)物質(zhì)供細(xì)胞和組織再利用[23]。已有多項(xiàng)研究證實(shí)自噬與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且自噬對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長具有促進(jìn)和抑制的雙重作用[24-25]。Wang 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，CNE-2 細(xì)胞在放療中誘發(fā)的自噬可以明顯提高細(xì)胞的存活率，從而發(fā)揮對(duì)CNE-2 細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)，而抑制自噬水平能夠顯著增加CNE-2 細(xì)胞放療的敏感性，降低細(xì)胞的存活率。Chow 等[27]研究顯示，次黃芩素能夠誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞自噬和凋亡，激活自噬能夠通過抑制mTOR 通路抑制鼻咽癌細(xì)胞凋亡。Xu 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，茶黃素能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞凋亡。以上研究關(guān)于自噬對(duì)鼻咽癌發(fā)揮相反的作用效果可能與治療藥物不同有關(guān)。LC3、p62 是自噬發(fā)生過程中的重要調(diào)控蛋白，是反映自噬水平高低的標(biāo)志性蛋白。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，牡荊素組裸鼠腫瘤組織中LC3-II 表達(dá)明顯升高，p62 表達(dá)明顯降低，表明牡荊素能過夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡，從而抑制鼻咽癌腫瘤生長。AMPK/ULK1 信號(hào)通路已被證實(shí)可同時(shí)對(duì)細(xì)胞凋亡和自噬產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤效果[29]。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激、缺氧刺激后，AMPK 通過磷酸化被顯著激活，從而抑制mTOR 磷酸化，促進(jìn)ULK1 Ser317位點(diǎn)磷酸化，激活細(xì)胞自噬[30]。Xie 等[15]研究顯示，在鼻咽癌細(xì)胞中AMPK/ULK1 通路及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)降低，激活A(yù)MPK/ULK1 通路能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，牡荊素各劑量組p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1 水平明顯升高。Min等[31]研究發(fā)現(xiàn)，硼替佐米能夠通過調(diào)控AMPK/ULK1 介導(dǎo)的細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)胰腺癌和結(jié)直腸癌癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞毒性，但是此作用效果能夠被AMPK 抑制劑Compound C 所取消。為進(jìn)一步明確AMPK/ULK1 介導(dǎo)的細(xì)胞自噬在牡荊素誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡中的作用。本研究通過對(duì)模型裸鼠ip AMPK 激動(dòng)劑/抑制劑后觀察腫瘤體生長變化。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，AICAR 能夠促進(jìn)AMPK/ULK1 通路活化，上調(diào)LC3-II，下調(diào)p62 表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并最終抑制腫瘤體生長，從而發(fā)揮與牡荊素相同的保護(hù)作用。與牡荊素高劑量組相比，AMPK 抑制劑Compound C 處理后能夠逆轉(zhuǎn)牡荊素對(duì)鼻咽癌裸鼠移植瘤的抑制作用。

綜上所述，牡荊素能夠通過激活A(yù)MPK/ULK1通路介導(dǎo)的自噬，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞裸鼠移植瘤生長。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突