鄧鴻飛，楊自力，羅毅

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210000

宮頸癌作為威脅女性健康的頭號“殺手”，已成為威脅女性健康的重要因素，全世界每年約有25 萬女性因?qū)m頸癌死亡[1-2]。作為傳統(tǒng)名方的西黃丸已廣泛應(yīng)用于臨床，研究證明西黃丸輔助治療宮頸癌可以有效減輕西醫(yī)治療的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量，提高療效，延長生命[3]。

西黃丸記載于《外科證治全生集》，方由牛黃、麝香、乳香、沒藥4 味中藥組成，具有清熱活血、化痰消徵、解毒散結(jié)等功效[4]。根據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果，西黃丸具備一系列的藥理效應(yīng)，這些效應(yīng)包括抑制惡性腫瘤的增殖和傳播、誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡、阻止新血管生成及調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境等[3,5-8]。因此，西黃丸常被用于治療多種惡性腫瘤，如乳腺癌和胃癌等。但西黃丸輔助治療宮頸癌的機(jī)制尚不明確。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接的方法[9]來預(yù)測西黃丸防治宮頸癌的有效活性成分、作用靶點(diǎn)及參與調(diào)控的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，闡述西黃丸抗宮頸癌的作用機(jī)制，以此為后面的科學(xué)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 西黃丸有效成分及目標(biāo)靶基因的篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫[10]（https://tcmsp-e.com/）中檢索牛黃、乳香、沒藥對應(yīng)數(shù)據(jù)庫中的化合物，以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18進(jìn)行篩選，獲得上述3 味藥的有效成分。同時，在BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫[11]（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）中，以分?jǐn)?shù)閾值（score cutoff）≥30和P≤0.05 為條件篩選麝香的有效成分及靶點(diǎn)。

1.2 西黃丸有效成分–靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用 UniProt（https://www.uniprot.org/）和BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫獲得西黃丸的有效成分作用靶點(diǎn)基因名。通過Excel 構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)活性成分–靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 宮頸癌疾病靶點(diǎn)的篩選

以“cervical cancer”為關(guān)鍵詞在GeneCards 人類基因數(shù)據(jù)庫（https://auth.lifemapsc.com/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/）中檢索宮頸癌的相關(guān)基因，合并去重后得到疾病基因靶點(diǎn)。

1.4 西黃丸–宮頸癌共同靶點(diǎn)篩選及蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將西黃丸–宮頸癌共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 12.0 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/），物種選擇“人類（homo sapiens）”最低相互作用域值≥0.9，獲得靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，將該圖導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。并通過“network analyzer”插件網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)介數(shù)中心性（BC）、緊密度（CC）、節(jié)點(diǎn)連接度（degree）篩選得到核心靶點(diǎn)。

1.5 基因本體論（GO）功能富集分析與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

將西黃丸–宮頸癌共同靶點(diǎn)以Gene Symbol 的格式導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），進(jìn)行GO 功能富集分析以及KEGG 基因通路富集分析。通過微生信在線平臺（http://www.bio informatics.com.cn）進(jìn)行可視化處理，以解釋西黃丸治療宮頸癌的生物功能及相關(guān)信號通路過程。

1.6 “西黃丸–靶點(diǎn)–宮頸癌–通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過KEGG 富集分析結(jié)果，選取與宮頸癌聯(lián)系緊密的通路，通過Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建“西黃丸–靶點(diǎn)–宮頸癌–通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 分子對接驗(yàn)證

通過PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載核心靶點(diǎn)排名前10 位蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，利用PyMol、Autodock-vina 軟件處理大分子蛋白結(jié)構(gòu)，后保存為“pdbqt”格式文件。通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到西黃丸核心有效成分小分子的3D 結(jié)構(gòu)，并通過Autodock Tools 軟件處理后保存為“pdbqt”格式文件。最后利用Autodock Vina 1.5.6 軟件將大分子和小分子進(jìn)行對接，利用PyMol 軟件處理對接結(jié)果，建立對接相互作用圖。

2 結(jié)果

2.1 西黃丸活性成分及其靶點(diǎn)

檢索到西黃丸有效活性成分共70 個，對應(yīng)的靶點(diǎn)共428 個，經(jīng)篩選后，牛黃、麝香、乳香、沒藥有效成分分別為5、25、6、34 個，靶點(diǎn)分別有7、280、13、195 個，見表1。

2.2 西黃丸活性成分–靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

采用Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建西黃丸活性成分–靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，共有502 個節(jié)點(diǎn)，1 221 條邊。degree值顯示活性成分中槲皮素（quercetin，degree＝147）、表雄酮（3beta-hydroxy-5alpha-androstan-17-one，degree＝64）、雄甾酮（androsterone，degree＝64）、3α-羥基-5α-17-酮（3alpha-hydroxy-5alpha-androstan-17-one，degree＝64）、5-順-環(huán)十五烷-L-酮（5-ciscyclopentadecen-1-one，degree＝63）等在西黃丸中具有主要作用，見圖1、表2。

圖1 西黃丸“藥物–活性成分–作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Xihuang Pills “drug -active ingredient -target” network diagram

表2 西黃丸主要活性成分Table 2 Main active ingredient of Xihuang Pills

2.3 共同靶點(diǎn)及PPI 網(wǎng)絡(luò)

在GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫中分別找到相關(guān)靶點(diǎn)1 062、495 個，合并去重后得到宮頸癌疾病靶點(diǎn)1 449 個，將西黃丸靶點(diǎn)與宮頸癌疾病靶點(diǎn)進(jìn)行篩選得到交集基因靶點(diǎn)116 個；通過String 數(shù)據(jù)庫，最終得到114 個節(jié)點(diǎn)和1 121 條邊。通過Cytoscape 3.9.1 軟件生成PPI 網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)共包含114 個節(jié)點(diǎn)和1 121 條邊。顏色越深、節(jié)點(diǎn)越大，degree 值越高，提示這些蛋白越重要。用插件Centiscape 2.2 對PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，以CC 大于中位數(shù)0.556 064 306、BC 大于中位數(shù)0.003 372 877、degree 大于2 倍中位數(shù)值33，篩選得到腫瘤蛋白P53（TP53）、表皮生長因子受體（EGFR）、蛋白激酶B1（Akt1）、白細(xì)胞介素（IL）-6、原癌基因（MYC）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、IL-1B、腫瘤壞死因子（TNF）、雌激素受體1（ESR1）、B 淋巴細(xì)胞2（Bcl-2）、低氧誘導(dǎo)因子-1A（HIF-1A）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、V-Rel 網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒癌基因同源物A（RELA）等22 個核心靶點(diǎn)，見圖2～4。根據(jù)degree 排名前10 位的基因見表3。這些靶點(diǎn)在西黃丸治療宮頸癌中發(fā)揮主要作用。

圖2 西黃丸–宮頸癌PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Xihuang Pills– cervical cancer PPI network

圖3 基于Cytoscape 構(gòu)建的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram based on Cytoscape

圖4 西黃丸–宮頸癌PPI 關(guān)鍵靶點(diǎn)Fig.4 Key target PPI of Xihuang Pills– cervical cancer

表3 交集基因靶點(diǎn)信息Table 3 Intersection gene target information

2.4 GO 生物過程和KEGG 通路富集分析

交集基因通過DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析，獲得1 018 個GO 條目，包括生物過程（BP）805個，主要包括細(xì)胞凋亡過程正負(fù)調(diào)控、RNA 聚合酶啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、對刺激反應(yīng)的調(diào)控、細(xì)胞增殖調(diào)控、基因表達(dá)的調(diào)控等方面；細(xì)胞組成（CC）70個，涉及轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、細(xì)胞核、染色體等；分子功能（MF）143 個，涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)異構(gòu)化活性等、蛋白激酶活性等。根據(jù)P＜0.05，分別取排名前10 位的的條目進(jìn)行可視化處理，見圖5。

圖5 GO 功能富集分析Fig.5 GO functional enrichment analysis histogram

通過KEGG 富集分析共獲得164 條通路，根據(jù)P＜0.01，取排名前40 位的通路進(jìn)行可視化處理，見圖6?？v軸表示富集途徑名稱，橫軸表示基因比例。氣泡顏色深淺與P值呈正比，顏色越深P值越?。粴馀荽笮∨c基因數(shù)量呈正比，氣泡越大，數(shù)量越多。結(jié)果顯示涉及的通路主要有胰腺癌（pancreatic cancer）、膀胱癌（bladder cancer）、前列腺癌（prostate cancer）、結(jié)直腸癌（colorectal cancer）、HIF-1、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt、TP53 等信號通路。

圖6 KEGG 通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis bubble diagram

選取前50 位富集通路中的IL-17、TNF、PI3K/Akt、p53、HIF-1 信號通路，構(gòu)建“西黃丸–靶點(diǎn)–宮頸癌–通路”網(wǎng)絡(luò)，見圖7。

圖7 西黃丸–靶點(diǎn)–宮頸癌–通路互作網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Xihuang Pills– target– cervical cancer– pathway interaction network

2.5 分子對接驗(yàn)證

對篩選得到的10 個核心成分及10 個核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接。并用結(jié)合能結(jié)果作圖，分子對接結(jié)合能熱圖見圖8（在BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫里顯示雄甾酮與3α-羥基-5α-17-酮顯示為麝香的2 種有效成分，在PubChem 數(shù)據(jù)庫顯示其為同一化學(xué)結(jié)構(gòu)）。最低結(jié)合能≤?1.2 kcal/mol（1 cal＝4.4 J），即表明藥效分子與蛋白對接效果良好，結(jié)合能越低，分子與蛋白結(jié)合能力越好。其中結(jié)合自由能排名靠前的為表雄酮與ESR1（?10.45 kcal/mol）、雄甾酮（3α-羥基-5α-17-酮）與ESR1（?9.97 kcal/mol）、4-雄烯二酮與ESR1（?9.95 kcal/mol）、雄甾酮（3α-羥基-5α-17-酮）與EGFR（?9.55 kcal/mol）、雌二醇與ESR1（?9.13 kcal/mol）、4-雄烯二酮與 Akt1（?8.82 kcal/mol）。通過Pymol 軟件對上述的結(jié)果進(jìn)行處理，見圖9。

圖8 分子對接結(jié)合能熱圖Fig.8 Molecular docking binding energy heat map

圖9 分子對接模式圖Fig.9 Molecular docking model diagram

3 討論

通過活性成分–靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖得知西黃丸關(guān)鍵活性成分有表雄酮、槲皮素、雄甾酮、3α-羥基-5α-17-酮、5-順-環(huán)十五烷-L-酮等?，F(xiàn)代研究表明，槲皮素是一種具有高抗癌活性的天然類黃酮，特別是對于與人乳頭瘤病毒（HPV）相關(guān)的宮頸癌等癌癥具有治療作用[12]。槲皮素可通過誘導(dǎo)ESR 通路促進(jìn)宮頸癌HELA 細(xì)胞的凋亡，達(dá)到抗腫瘤目的[13]。研究表明，槲皮素具有作為化學(xué)預(yù)防/抗腫瘤劑的內(nèi)在潛力，并通過逆轉(zhuǎn)上皮–間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）信號傳導(dǎo)來減緩腫瘤進(jìn)展[14]。惡性腫瘤中的重組人泛素結(jié)合酶E2-S（UBE2S）通過EMT 信號傳導(dǎo)有助于細(xì)胞運(yùn)動，并能被槲皮素逆轉(zhuǎn)，且UBE2S 可能有助于宮頸癌中HIF-1A 信號傳導(dǎo)。結(jié)果表明，槲皮素通過降低UBE2S表達(dá)對宮頸癌的轉(zhuǎn)移抑制作用[15]。這些研究不僅為抑制宮頸癌的轉(zhuǎn)移提供了新的見解，也提示槲皮素在治療宮頸癌中具有重要價值。表雄酮可以在機(jī)體內(nèi)與脫氫表雄酮進(jìn)行轉(zhuǎn)化，已經(jīng)有研究推測脫氫表雄酮可能通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移來預(yù)防或治療宮頸癌[16-17]?，F(xiàn)在研究已經(jīng)表明，雄甾酮具有很好的細(xì)胞毒活性，具有潛在的抗癌作用。因此，西黃丸能夠通過相關(guān)通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)凋亡。

通過西黃丸–宮頸癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖推測西黃丸治療宮頸癌的主要靶點(diǎn)包括TP53、EGFR、Akt1、IL-6、MYC 基因、JUN、CASP3、TNF 等。TP53 基因的體細(xì)胞突變是人類癌癥中最常見的改變之一，TP53 突變通過影響DNA 損傷修復(fù)途徑，減緩細(xì)胞周期，造成染色質(zhì)重塑和細(xì)胞凋亡，從而影響腫瘤的發(fā)展過程，是腫瘤治療潛在的預(yù)后和預(yù)測標(biāo)志物，也是藥物干預(yù)的靶標(biāo)之一[18-19]。宮頸癌的發(fā)生與TP53 基因密切相關(guān)[20]，EGFR 水平的升高能夠促進(jìn)實(shí)體瘤生長[21]。EGFR/Akt 信號傳導(dǎo)的過度激活使NANOG 腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（CTL）殺傷具有抗性。NANOG/LC3B-p/EGFR 軸存在于各種類型的人類癌癥中，并與宮頸癌患者的總生存率呈負(fù)相關(guān)[22]。研究表明，通過抑制EGFR 基因的表達(dá)水平，能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞活力、增殖、遷移和癌癥干細(xì)胞樣表型，從而達(dá)到治療宮頸癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的目的[23]。研究表明，circ-Akt1在宮頸癌樣品和細(xì)胞系中的高表達(dá)，體內(nèi)檢測證實(shí)circ-Akt1 會促進(jìn)宮頸癌腫瘤生長[24]。研究表明，IL-6 的表達(dá)與腫瘤大小、婦科腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)分級和腫瘤分化顯著相關(guān)。IL-6 表達(dá)陽性與預(yù)后不良顯著相關(guān)，其被認(rèn)為是宮頸癌預(yù)后和潛在治療靶點(diǎn)的有價值的生物標(biāo)志物[25]。有學(xué)者提出MYC 基因的過表達(dá)促進(jìn)了侵襲性宮頸癌的轉(zhuǎn)移[26]。有研究表明，TNF-α 啟動子區(qū)域參與宮頸癌的發(fā)展[27]。

通過GO 富集分析可知，西黃丸治療宮頸癌的生物功能主要涉及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號調(diào)節(jié)、RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控及對藥物刺激的反應(yīng)等；參與了蛋白質(zhì)結(jié)合和酶結(jié)合等分子功能。KEGG 富集分析顯示，西黃丸治療宮頸癌涉及了多條信號通路，包括IL17、TNF、PI3K/Akt、p53、HIF-1 等信號通路。IL-17 被認(rèn)為是炎癥的重要因素。試驗(yàn)研究證明，IL-17 通過激活Janus 激酶2（JAK2）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）和PI3K/Akt/核因子-κB（NF-κB）信號傳導(dǎo)促進(jìn)宮頸癌的進(jìn)展[28]。TNF 信號通路調(diào)控著細(xì)胞的生長和侵襲轉(zhuǎn)移，對宮頸癌疾病的發(fā)展有著重要的作用[29]。PI3K/Akt 信號通路調(diào)控著人宮頸癌細(xì)胞系（CaSki、HELA）的細(xì)胞活力和遷移，從而影響宮頸癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[30]。研究表明，T 細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白-1（TIM-1）過表達(dá)通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/p53 和PI3K/Akt/mTOR 信號通路促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲，抑制宮頸癌細(xì)胞凋亡，可能是該病的候選診斷生物標(biāo)志物[31]。研究表明，HIF 信號通路可能在宮頸癌中起關(guān)鍵作用[32]，參與宮頸癌細(xì)胞的增殖和調(diào)亡[33-35]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接的方法，篩選分析西黃丸和宮頸癌的相關(guān)靶點(diǎn)，并對藥物的活性成分和重要靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，對接結(jié)果均良好，由此可以推斷西黃丸發(fā)揮主要作用的活性成分有槲皮素、表雄酮、雄甾酮等；潛在治療靶點(diǎn)是TP53、EGFR、Akt1、IL-6、MYC、TNF 等；相關(guān)調(diào)控通路有IL17、TNF、PI3K/Akt、p53、HIF-1、癌癥等信號通路。由此得知西黃丸治療宮頸癌的作用靶點(diǎn)是多途徑、多層面的，為西黃丸的后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供了更多的理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突