莊翠翠,韓 博

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,晉中 030801;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 100193)

奶業(yè)是我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展的支柱性產(chǎn)業(yè)。奶牛乳腺炎仍然是奶牛最常見(jiàn),也是最具挑戰(zhàn)性的疾病之一。奶牛乳腺炎不僅會(huì)影響動(dòng)物福利,也會(huì)造成牛奶質(zhì)量下降,從而嚴(yán)重地影響奶業(yè)的發(fā)展并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。奶牛乳腺炎的嚴(yán)重程度不僅取決于入侵病原體的種類和致病力,也受奶牛自身如哺乳期、年齡、胎次、自身免疫力以及外界飼養(yǎng)環(huán)境和擠奶方式等的影響,但病原微生物感染仍是引起奶牛乳腺炎最主要的病因[2]。目前有150多種病原體會(huì)誘發(fā)奶牛乳腺炎。根據(jù)病原體的不同,奶牛乳腺炎可分為細(xì)菌性乳腺炎、真菌性乳腺炎、藻類性乳腺炎和支原體性乳腺炎,其中發(fā)生率最高,病情最嚴(yán)重且經(jīng)濟(jì)損失最大的是細(xì)菌性乳腺炎[3]。根據(jù)細(xì)菌的不同來(lái)源及傳播方式,奶牛乳腺炎的致病菌可以分為傳染性病原菌、機(jī)會(huì)性病原菌和環(huán)境性病原菌,其中傳染性病原菌主要有金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌等,機(jī)會(huì)性病原菌主要有表皮葡萄球菌、模擬葡萄球菌和產(chǎn)色葡萄球菌等,環(huán)境性病原菌主要有克雷伯桿菌、化膿隱秘桿菌和大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)等[4]。

E.coli是引起奶牛乳腺炎最常見(jiàn)的環(huán)境致病菌之一。Gao等[5]對(duì)我國(guó)161個(gè)牛場(chǎng)的3 288份臨床乳腺炎來(lái)源的牛奶樣本進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)最多的病原菌是E.coli,占14.4%。E.coli感染會(huì)引起奶牛乳腺發(fā)生急性腫脹、疼痛和發(fā)熱,乳汁呈水樣、帶血或凝乳,產(chǎn)奶量急劇減少,并伴有毒血癥的臨床癥狀,如體溫升高、心率加快、精神沉郁和食欲不振[6-7]。盡管環(huán)境乳腺炎受到管理實(shí)踐的高度影響,但畜群結(jié)構(gòu)和不斷提高的牛奶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)使乳腺炎成為一種復(fù)雜的疾病,且乳腺炎仍然是乳制品行業(yè)的首要問(wèn)題[1,8]。目前,抗生素依然是國(guó)內(nèi)外獸醫(yī)人員治療奶牛乳腺炎最常用的方法[9],然而抗生素大量且不合理的使用甚至濫用導(dǎo)致了耐藥致病菌株的出現(xiàn)和傳播以及畜產(chǎn)品抗生素殘留等問(wèn)題,進(jìn)而威脅著人類公共衛(wèi)生安全。線粒體作為細(xì)胞中重要的兩層膜細(xì)胞器,不但能為細(xì)胞供給能量,還參與了細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和細(xì)胞周期調(diào)控、信息傳遞以及細(xì)胞凋亡等。但E.coli感染對(duì)線粒體的損傷機(jī)制仍不清晰。因此,本研究旨在進(jìn)一步探究E.coli感染對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞線粒體的影響及其機(jī)理,為尋找安全、高效的抗生素替代品提供新思路且為E.coli性奶牛乳腺炎的防治提供新方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及奶牛乳腺上皮細(xì)胞

分娩1周的12周齡SPF級(jí)昆明小鼠購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的動(dòng)物房?jī)?nèi),每籠3只母鼠,自由采食和飲水。動(dòng)物房溫度23 ℃±3 ℃,濕度50%±10%,每小時(shí)換氣15次,每天光照12 h。

奶牛乳腺上皮細(xì)胞系MAC-T[購(gòu)自上海晶馬生物科技有限公司]在含有10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng),傳8代后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 E.coli培養(yǎng)

E.coli菌株由本實(shí)驗(yàn)室前期從內(nèi)蒙古患有臨床型乳腺炎的奶牛乳樣中分離并儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中[10],用血平板復(fù)蘇后,在Luria-Bertani肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于后續(xù)試驗(yàn)。該患病奶牛直腸溫度高達(dá)40.0 ℃,產(chǎn)奶量下降,牛奶中含有大量凝塊,乳腺組織持續(xù)腫脹。此外,本E.coli菌株在預(yù)試驗(yàn)中能夠誘發(fā)小鼠乳腺炎。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將18只分娩1周的12周齡SPF級(jí)昆明小鼠母鼠隨機(jī)分成3組,分別為空白對(duì)照(Control)組、大腸桿菌(E.coli)組和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)組,每組6只。全部小鼠左腿肌肉注射50 mg·kg-1體重舒泰50麻醉后,保定于體視顯微鏡下,利用無(wú)菌超微注射器對(duì)E.coli組母鼠的右側(cè)第4對(duì)乳腺導(dǎo)管注射25 μLE.coli生理鹽水溶液(包含106CFUE.coli),LPS組注射25 μL 20 mg·kg-1體重LPS生理鹽水溶液[11],Control組注射等量的無(wú)菌生理鹽水,處理后24 h,實(shí)施安樂(lè)死并收集乳腺組織。

以第9代奶牛乳腺上皮細(xì)胞為研究對(duì)象,隨機(jī)分成3組,分別為空白對(duì)照(Control)組、大腸桿菌(E.coli)組和脂多糖(LPS)組,Control組未被E.coli感染且未被LPS處理;E.coli組被感染復(fù)數(shù)為5的E.coli感染6 h,LPS組被1 μg·mL-1LPS處理6 h,重復(fù)3次試驗(yàn),每組3個(gè)重復(fù),根據(jù)后續(xù)試驗(yàn)需求收集感染后的奶牛乳腺上皮細(xì)胞。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 乳腺上皮細(xì)胞角18蛋白免疫熒光鑒定 第9代奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)于細(xì)胞爬片后,將細(xì)胞爬片上的奶牛乳腺上皮細(xì)胞置于500 μL 4 mL·L-1多聚甲醛中冰育固定10 min,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌3次,再加入500 μL的0.2% Triton X100透化,冰育7 min,PBS洗滌3次。細(xì)胞爬片室溫下于1%牛血清白蛋白封閉液中封閉60 min,加入鼠源角18蛋白抗體(購(gòu)自Abcam公司,200倍稀釋),4 ℃孵育60 min,PBS洗滌3次,加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的山羊抗鼠二抗IgG(1 000倍稀釋),室溫下避光孵育30 min,PBS洗滌3次后,利用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diaminyl-2-phenylindole,DAPI)避光孵育5 min,然后PBS洗滌3次。細(xì)胞爬片覆蓋到含有抗熒光淬滅劑的載玻片上,利用激光共聚焦顯微鏡觀察染色情況。

1.4.2 乳腺上皮細(xì)胞透射電鏡檢測(cè) 第9代奶牛乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同的處理后,利用2.5%電鏡固定液固定奶牛乳腺上皮細(xì)胞,4 ℃固定過(guò)夜后,采用梯度酒精和丙酮溶液脫水,丙酮樹(shù)脂混合溶液聚合48 h后,超薄切片機(jī)切片,利用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色,透射電鏡拍照。

1.4.3 小鼠組織病理學(xué)檢測(cè) 母鼠安樂(lè)死后,迅速收集各組乳腺組織并于室溫固定于10%中性福爾馬林溶液中12 h后,流水沖洗2 h,70%～95%梯度酒精脫水,二甲苯透化和石蠟包埋后切片。制備好的石蠟切片經(jīng)二甲苯透化、70%～95%梯度酒精脫水和蒸餾水脫蠟后進(jìn)行蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,染色后的切片用中性樹(shù)膠封片,在光學(xué)顯微鏡下觀察乳腺組織的病理學(xué)變化。

1.4.4 線粒體純度測(cè)定 嚴(yán)格按照線粒體提取試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)提取第9代奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺組織線粒體后,根據(jù)Caro等[12]的研究方法測(cè)定線粒體的純度,主要通過(guò)檢測(cè)線粒體和細(xì)胞質(zhì)組分內(nèi)ATP合成酶α亞基(ATP synthetase alpha subunit,ATP5A,一種線粒體標(biāo)記物)和乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH,一種細(xì)胞漿標(biāo)記物)的免疫印跡衡量線粒體的純度。嚴(yán)格按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型,購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū)測(cè)定線粒體勻漿和細(xì)胞質(zhì)組分蛋白濃度,標(biāo)準(zhǔn)品(0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1)和待測(cè)樣本中加入200 μL BCA工作液(50體積BCA試劑A與1體積BCA試劑B混勻),37 ℃孵育30 min,D(562 nm)檢測(cè)吸光光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品的蛋白濃度。線粒體勻漿和細(xì)胞質(zhì)組分分別加入上樣緩沖液,混勻100 ℃煮沸5 min制成蛋白樣品。選取30 μg蛋白樣品加入到丙烯酰胺凝膠(上層5%濃縮膠和下層10%分離膠)上樣孔內(nèi),80 V濃縮20 min后,120 V分離90 min,200 mA轉(zhuǎn)膜90 min,0.2 μm聚偏二氟乙烯膜于含有5%脫脂奶粉的Tris-HCl緩沖鹽溶液封閉液(含0.1%吐溫20)中封閉90 min后,ATP5A(購(gòu)自Abcam公司,稀釋1 000倍)、LDH(購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司,稀釋1 000倍)和β-actin(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,稀釋400倍)一抗4 ℃孵育過(guò)夜,含有5%脫脂奶粉的Tris-HCl緩沖鹽溶液封閉液(含0.1%吐溫20)清洗3次,每次10 min,加入山羊抗鼠(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,稀釋2 000倍)二抗,室溫孵育60 min,含有5%脫脂奶粉的Tris-HCl緩沖鹽溶液封閉液(含0.1%吐溫20)清洗3次,每次10 min,利用化學(xué)發(fā)光儀上曝光并采集圖像。

1.4.5 奶牛乳腺上皮細(xì)胞線粒體膜通透性檢測(cè) 第9代奶牛乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同的處理后,根據(jù)Halestrap[13]的研究方法測(cè)定奶牛乳腺上皮細(xì)胞線粒體膜通透性,主要通過(guò)檢測(cè)硫氰酸鉀緩沖液中線粒體腫脹程度判斷E.coli感染對(duì)線粒體的損傷。緩沖液主要含有150 mmol·L-1硫氰酸鉀、10 mmol·L-12-(N-嗎啡啉)乙磺酸、10 mmol·L-13-嗎啉丙磺酸、5 mmol·L-1Tris、1 μg·mL-1魚(yú)藤酮和1 μg·mL-1抗霉素A,經(jīng)HCl或KOH調(diào)節(jié)至所需pH 7.4。奶牛乳腺上皮細(xì)胞線粒體以2 mg·mL-1的蛋白質(zhì)加入到7.4 mL 硫氰酸鉀緩沖液中混勻,D(520 nm)檢測(cè)吸光光度值,根據(jù)吸光度的變化判定線粒體膜通透性的改變。若吸光度降低,表明奶牛乳腺上皮細(xì)胞線粒體膜通透性增加。

1.4.6 三磷酸腺苷(ATP)含量檢測(cè) 第9代奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺組織經(jīng)過(guò)不同的處理后,嚴(yán)格按照ATP含量檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)操作,檢測(cè)D(636 nm)各管吸光光度值,雙蒸水調(diào)零。

1.4.7 線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ活性測(cè)定 第9代奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺組織經(jīng)過(guò)不同的處理后,嚴(yán)格按照線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)操作,檢測(cè)D(340 nm)檢測(cè)0和5 min吸光光度值,樣品活性計(jì)算公式如下:

樣品活性=樣本容量(0.1 mL)×5.5(毫摩爾吸光系數(shù))×反應(yīng)時(shí)間/(樣本OD-背景OD)×體系容量(1 mL)×樣本稀釋倍數(shù)÷樣品蛋白濃度。

1.4.8 線粒體DNA非編碼區(qū)包含位移環(huán)區(qū)(D-Loop)基因表達(dá)量及線粒體質(zhì)量檢測(cè) 第9代奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺組織經(jīng)過(guò)不同的處理后,嚴(yán)格按照線粒體提取試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)提取線粒體后,再嚴(yán)格按照動(dòng)物組織/細(xì)胞線粒體DNA提取試劑盒(購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司)說(shuō)明書(shū)操作提取線粒體DNA,通過(guò)引物(D-Loop引物序列為F:TAGTGCTAATACCAACGGCC;R:AGGCATTTTCAGTGCCTTGC和β-actin引物序列為F:GTCCACCTTCCAGCAGAT;R:GCTAACAGTCCGCCTAGAA)進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增,反應(yīng)體系為20 μL,其中線粒體DNA 2 μL,上、下游引物各0.8 μL,SYBR Green染料10 μL和水6.4 μL。反應(yīng)條件:30次循環(huán),94 ℃變性6 min,94 ℃ 45 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,72 ℃ 10 min。通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算D-Loop基因表達(dá)量。

1.4.9 線粒體分裂與融合相關(guān)基因檢測(cè) 第9代奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺組織經(jīng)過(guò)不同的處理后,嚴(yán)格按照TRIzol試劑(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)提取奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺組織總RNA后,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)將總RNA反轉(zhuǎn)成DNA,通過(guò)NCBI Gene中基因序列合成引物(表1)進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增,反應(yīng)體系為25 μL,其中DNA模板2 μL,上、下游引物各1 μL,SYBR Green染料12.5 μL和水8.5 μL。反應(yīng)條件:35次循環(huán),95 ℃變性3 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min。通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞鑒定

對(duì)生長(zhǎng)至第9代的奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行角18蛋白免疫熒光檢測(cè),激光共聚焦顯微鏡拍照發(fā)現(xiàn),奶牛乳腺上皮細(xì)胞胞漿中角18蛋白染成綠色,均勻分布在細(xì)胞漿內(nèi),細(xì)胞核被DAPI染成藍(lán)色(圖1A),表明奶牛乳腺上皮細(xì)胞可用于后續(xù)試驗(yàn)。

A. 角18蛋白綠色染色,細(xì)胞核藍(lán)色染色。標(biāo)尺=50 μm。B. ATP5A在奶牛乳腺上皮細(xì)胞線粒體勻漿和細(xì)胞質(zhì)組分中的蛋白表達(dá)量。C. ATP5A和LDH在Control和E.coli組奶牛乳腺上皮細(xì)胞線粒體勻漿中的蛋白表達(dá)量。D. ATP5A在小鼠乳腺組織線粒體勻漿和細(xì)胞質(zhì)組分中的蛋白表達(dá)量。E. ATP5A和LDH在Control和E.coli組小鼠乳腺組織線粒體勻漿中的蛋白表達(dá)量。mito為線粒體勻漿,cyto為細(xì)胞質(zhì)組分A. Cytokeratin 18 was stained green and nuclear was stained blue. Scale bars=50 μm. B. The protein expression of ATP5A in the mitochondrial homogenate and cytoplasmic components of bovine mammary epithelial cells. C. The protein expressions of ATP5A and LDH in the mitochondrial homogenates of bovine mammary epithelial cells of Control and E. coli groups. D. The protein expression of ATP5A in the mitochondrial homogenate and cytoplasmic components of mouse mammary gland. E. The protein expressions of ATP5A and LDH in the mitochondrial homogenates of mouse mammary gland of Control and E. coli groups. moti is mitochondrial homogenate and cyto is cytoplasmic component

2.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺組織線粒體純度鑒定

相對(duì)于細(xì)胞質(zhì)部分,線粒體勻漿中高度表達(dá)了的線粒體的標(biāo)志物ATP5A(圖1B～D)。此外,為了確定線粒體勻漿的純度,在Control和E.coli組線粒體勻漿中高度表達(dá)了ATP5A乳酸脫氫酶,而低表達(dá)乳酸脫氫酶(LDH,一種細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記物;圖1C和E)。這些結(jié)果表明,奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺線粒體勻漿內(nèi)線粒體純度較高,可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 E.coli感染對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

利用透射顯微鏡觀察奶牛乳腺上皮細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)(圖2),正常培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞連接緊密(圖2A),而經(jīng)E.coli感染的奶牛乳腺上皮細(xì)胞間隙增大,線粒體腫脹,線粒體嵴缺失且部分模糊消失(圖2B)。這些結(jié)果表明,E.coli感染造成了奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷。

紅色箭頭標(biāo)示為細(xì)胞間隙增大;黃色箭頭標(biāo)示為E.coli;綠色箭頭標(biāo)示為線粒體腫脹;粉色箭頭標(biāo)示為線粒體嵴缺損,部分模糊消失Red arrow indicates increased intercellular space; The yellow arrow indicates Escherichia coli; The green arrows indicate mitochondrial swelling; The pink arrows indicate the mitochondrial crests′ defect and partial missing mitochondrial crests

2.4 E.coli感染對(duì)小鼠乳腺病理變化的影響

病理組織結(jié)果如圖3所示。Control組小鼠乳腺腺泡結(jié)構(gòu)清晰,并有散在的乳汁;E.coli組小鼠組織腺泡壁被破壞,腺泡內(nèi)有游離的中性粒細(xì)胞并有散在的淡染乳汁;LPS組小鼠組織腺泡內(nèi)有游離的中性粒細(xì)胞并有散在的淡染乳汁。

黑色箭頭標(biāo)示為乳汁;粉色箭頭標(biāo)示為中性粒細(xì)胞;綠色箭頭標(biāo)示被破壞的腺泡壁Black arrows indicate milk; The pink arrows indicate neutrophils; The green arrow indicates the damaged acinar walls

2.5 E.coli感染對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺線粒體膜通透性及線粒體電子傳遞鏈的影響

相較于Control組,E.coli感染或LPS極顯著降低了奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺組織內(nèi)線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ活性和ATP的含量以及奶牛乳腺上皮細(xì)胞D(520 nm)吸光值(圖4A～G,P<0.05或P<0.01)。E.coli感染分別降低了奶牛乳腺上皮細(xì)胞D(520 nm)吸光值、線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ活性和ATP含量的51.83%、40.22%、36.13%、60.67%、41.41%、57.48%和36.16%,LPS分別降低了奶牛乳腺上皮細(xì)胞D(520 nm)吸光值、線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ活性和ATP含量的45.40%、38.18%、27.91%、43.42%、32.57%、43.20%和25.15%。此外,E.coli感染分別降低了小鼠乳腺線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ活性和ATP含量的24.77%、71.45%、37.34%、39.38%、30.09%和27.38%,LPS分別降低了小鼠乳腺線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ活性和ATP含量的19.37%、58.18%、26.74%、31.24%、32.57%、25.80%和13.11%。這些結(jié)果表明E.coli感染或LPS均破壞了奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺線粒體結(jié)構(gòu)的完整性,膜通透性增加,膜的流動(dòng)性降低,進(jìn)一步降低了線粒體傳遞電子的效率,最終導(dǎo)致線粒體能量代謝紊亂。

*.P<0.05;**.P<0.01。下同*.P<0.05;**.P<0.01. The same as below

2.6 E.coli感染對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺線粒體融合/分裂的影響

相較于Control組,E.coli感染或LPS極顯著降低了奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺內(nèi)動(dòng)力蛋白相關(guān)蛋白1(Drp1)和線粒體分裂蛋白1(Fis1)調(diào)控。此外,線粒體融合蛋白1(Mfn1)、線粒體融合蛋白2(Mfn2)和蛋白質(zhì)視神經(jīng)萎縮1(OPA1)mRNA表達(dá)(圖5A～E,P<0.05或P<0.01)。E.coli感染分別降低了奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)Drp1、Fis1、Mfn1、Mfn2和OPA1 mRNA表達(dá)的38.00%、42.67%、35.00%、30.00%和44.00%,LPS分別降低了奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)Drp1、Fis1、Mfn1、Mfn2和OPA1 mRNA表達(dá)的32.00%、33.00%、32.67%、33.00%和35.33%。此外,E.coli感染分別降低了小鼠乳腺Drp1、Fis1、Mfn1、Mfn2和OPA1 mRNA表達(dá)的33.57%、32.20%、22.93%、31.37%和21.23%,LPS分別降低了小鼠乳腺Drp1、Fis1、Mfn1、Mfn2和OPA1 mRNA表達(dá)的23.70%、24.20%、23.73%、30.80%和24.97%。這些結(jié)果表明,E.coli感染或LPS均抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺內(nèi)線粒體的融合/分裂。

2.7 E.coli感染對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞線粒體生物發(fā)生的影響

相較于Control組,E.coli感染或LPS極顯著降低了奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺內(nèi)過(guò)氧化物酶增殖物激活受體γ共激活因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(NRF1)和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)和D-Loop的基因表達(dá)(圖6A～D,P<0.05或P<0.01)。E.coli感染分別降低了奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)PGC-1α、NRF1、TFAM和D-Loop的基因表達(dá)的25.93%、27.33%、31.67%和35.40%,LPS分別降低了奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)PGC-1α、NRF1、TFAM和D-Loop的基因表達(dá)的37.30%、24.33%、30.67%和43.07%。此外,E.coli感染分別降低了小鼠乳腺PGC-1α、NRF1、TFAM和D-Loop的基因表達(dá)的20.40%、28.50%、24.37%和40.13%,LPS分別降低了小鼠乳腺PGC-1α、NRF1、TFAM和D-Loop的基因表達(dá)的26.70%、26.60%、32.60%和28.27%。這些結(jié)果表明,E.coli感染或LPS均減少了奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺內(nèi)線粒體的生物發(fā)生。

A～E. 分別為PGC-1α、NRF1、TFAM和D-Loop mRNA表達(dá)水平A-E. The mRNA expression levels of PGC-1α, NRF1, TFAM and D-Loop mRNA expressions,respectively

3 討 論

奶牛乳腺上皮細(xì)胞在奶牛乳腺應(yīng)對(duì)細(xì)菌感染的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[14]。因此,奶牛乳腺上皮細(xì)胞已經(jīng)成為研究奶牛乳腺炎發(fā)病機(jī)制的體外模型[15]。角18蛋白是中間纖維蛋白家族中的一員,構(gòu)成多種上皮細(xì)胞骨架。因此,角18蛋白被認(rèn)為是上皮細(xì)胞特有的標(biāo)志物。本研究中,角18蛋白被用于鑒定奶牛乳腺上皮細(xì)胞系。研究結(jié)果表明,復(fù)蘇后的第9代奶牛乳腺上皮細(xì)胞角18蛋白染色陽(yáng)性,本研究與前期研究[16]一致,表明本研究中使用的細(xì)胞系為奶牛乳腺上皮細(xì)胞。此外,在本研究中,E.coli感染和LPS處理均可引起小鼠乳腺腺泡內(nèi)出現(xiàn)游離的中性粒細(xì)胞,這表明E.coli感染和LPS處理均可誘發(fā)乳腺炎。因此,本試驗(yàn)中小鼠乳腺炎的模型已成功建立,可用于后續(xù)試驗(yàn)。

A～E. 分別為Drp1、Fis1、OPA1、Mfn1和Mfn2mRNA表達(dá)水平A-E. The mRNA expression levels of Drp1, Fis1, OPA1,Mfn1 and Mfn2, respectively 圖5 E.coli感染或LPS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺線粒體融合/分裂的影響Fig.5 The effect of Escherichia coli infection or lipopolysaccharide on mitochondrial fusion/division in bovine mammary epithelial cells and mouse mammary gland

研究發(fā)現(xiàn),ATP5A和LDH分別是線粒體和細(xì)胞漿的典型標(biāo)志物[17]。本研究中,相對(duì)于細(xì)胞質(zhì)部分,線粒體勻漿中ATP5A高度表達(dá)。此外,為鑒定線粒體勻漿的純度,本研究檢測(cè)了線粒體勻漿中LDH蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)Control組和E.coli組奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺中ATP5A高度表達(dá),LDH也有部分表達(dá),這表明線粒體勻漿純度較高,僅有較少量的細(xì)胞質(zhì)組分污染,可用于后續(xù)試驗(yàn)。

線粒體是機(jī)體多種細(xì)胞儲(chǔ)存和供應(yīng)能量的細(xì)胞器,研究發(fā)現(xiàn)線粒體大小、線粒體形態(tài)變化以及線粒體膜通透性可被用于衡量線粒體損傷及降解程度[18]。本研究中,E.coli感染的奶牛乳腺上皮細(xì)胞間隙增大,線粒體腫脹,線粒體嵴缺失且部分模糊消失。此外,E.coli感染顯著降低了D(520 nm)吸光值。這些結(jié)果表明,E.coli感染破壞了奶牛乳腺上皮細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的完整性,膜通透性增加,膜的流動(dòng)性降低,從而導(dǎo)致了線粒體損傷。

線粒體主要通過(guò)涉及電子傳遞鏈的氧化磷酸化產(chǎn)生ATP,且能量代謝產(chǎn)物和標(biāo)志酶可以用于判定線粒體的損傷程度[19]。線粒體電子傳遞鏈中電子的傳遞和氧化磷酸化等產(chǎn)能反應(yīng)均發(fā)生在線粒體膜中,因此線粒體膜的損傷會(huì)造成能量代謝紊亂。在線粒體內(nèi),電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ通過(guò)催化還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化脫氫生成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸[20]。電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅱ通過(guò)催化琥珀酸氧化為延胡索酸,進(jìn)一步使輔酶Q還原成2,6-二氯吲哚酚,最終導(dǎo)致O2減少[21]。電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅲ是線粒體氧化磷酸化的必需物質(zhì),也是活性氧的主要來(lái)源,通過(guò)將還原型輔酶Q的氫傳遞給細(xì)胞色素c,生成還原型細(xì)胞色素c。電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅳ是線粒體電子傳遞鏈的終端受體,主要通過(guò)氧化細(xì)胞色素c將O2轉(zhuǎn)化為水[22]。電子傳遞鏈復(fù)合物V主要是促進(jìn)產(chǎn)生細(xì)胞所需要的ATP能量[17]。本研究中,E.coli感染極顯著降低了奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺內(nèi)線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ活性和ATP的含量,與LPS處理的結(jié)果一致,說(shuō)明E.coli感染主要通過(guò)LPS誘導(dǎo)線粒體膜損傷,進(jìn)而干擾了線粒體的電子傳遞鏈,最終造成奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺能量代謝紊亂。

線粒體通過(guò)調(diào)控自身的分裂與融合來(lái)改變形態(tài)以滿足細(xì)胞的需求。線粒體的分裂過(guò)程發(fā)生在線粒體外膜上,主要由Drp1和Fis1調(diào)控[23]。此外,Mfn1、Mfn2和OPA1共同介導(dǎo)線粒體內(nèi)膜的融合[24]。在本研究中,E.coli感染極顯著降低了奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺內(nèi)Drp1、Fis1、Mfn1、Mfn2和OPA1 mRNA表達(dá),與LPS的作用一致,表明E.coli感染主要通過(guò)LPS抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺線粒體的融合/分裂。

線粒體生物發(fā)生是機(jī)體和細(xì)胞對(duì)能量需求作出的反應(yīng),能夠顯著增加線粒體的質(zhì)量。線粒體內(nèi)表達(dá)的蛋白多數(shù)由線粒體DNA轉(zhuǎn)錄和翻譯。線粒體DNA僅包含兩個(gè)非編碼區(qū),無(wú)內(nèi)含子,非編碼區(qū)包含位移環(huán)區(qū)(D-Loop)[25]。因此,D-Loop可以用于衡量線粒體DNA的總量。PGC-1α通過(guò)激活NRF1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)TFAM的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)線粒體蛋白的合成、線粒體DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄以及新線粒體的生物發(fā)生,提高線粒體的質(zhì)量,以適應(yīng)組織、器官增加的能量需求[26]。本研究中,E.coli感染極顯著降低了奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺內(nèi)PGC-1α、NRF1、TFAM和D-Loop的基因表達(dá),與LPS的作用一致,這些結(jié)果表明,E.coli感染通過(guò)LPS減少了奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺內(nèi)線粒體的生物發(fā)生。

4 結(jié) 論

本研究證明了E.coli感染主要通過(guò)LPS造成奶牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺線粒體能量代謝紊亂、抑制線粒體的分裂與融合以及減少線粒體的生物發(fā)生,進(jìn)而造成線粒體損傷。因此,E.coli感染是通過(guò)誘導(dǎo)線粒體損傷造成奶牛乳腺炎,且線粒體損傷是造成乳腺損傷的重要原因之一。