閆文倩,侯 景,楊金柯,郝 雨,楊 行,史喜絹,張大俊,別鑫恬,陳國輝,陳玲玲,何 路,趙美玉,趙思越,鄭海學(xué)*,張克山*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 蘭州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)與生物安全學(xué)院 動(dòng)物疫病防控全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730000;2.甘肅省病原生物學(xué)基礎(chǔ)學(xué)科研究中心,蘭州 730046)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是一種影響家豬和野豬的急性出血性疾病,由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起,以高發(fā)病率和高致死率為特征[1-2]。ASF于1921年在肯尼亞首次被報(bào)道,之后不斷蔓延到歐洲和亞洲的其他國家,迄今為止,還沒有公認(rèn)有效的商業(yè)疫苗可用于ASF,對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成了毀滅性打擊[3-4]。ASFV是一種大型的雙鏈DNA病毒,是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員,亦是唯一已知的DNA蟲媒病毒,可以編碼150～200種蛋白質(zhì),其中被預(yù)測(cè)和確定的解旋酶有5種,分別命名為A859L、B962L、D1133L、Q706L、Qp509L[5-8],但對(duì)它們的研究仍較少。

D1133L是ASFV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白,其基因位于病毒基因組的中央?yún)^(qū)域,屬于晚期表達(dá)基因,高度保守[9-10]。D1133L類似于牛痘病毒的D6R蛋白,含有表征超家族Ⅱ解旋酶的氨基酸序列,因此推測(cè)其屬于超家族Ⅱ解旋酶[11],在ASFV復(fù)制中發(fā)揮著重要作用[12-14]。單克隆抗體在診斷和治療方面發(fā)揮著重要的作用,在前期的研究中,針對(duì)D1133L制備的單克隆抗體7D12具有良好的特異性,但是其功能活性還未被驗(yàn)證。在本研究中,作者探討了D1133L單克隆抗體對(duì)ASFV復(fù)制的影響,以期對(duì)ASFV 靶向藥物和疫苗的研發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與病毒 豬肺泡巨噬細(xì)胞 (porcine alveolar macrophages,PAMs)由本實(shí)驗(yàn)室參考文獻(xiàn)[15]分離制備,ASFV野生病毒(ASFV-CN/GS/2018)及 ASFV-GFP重組病毒(在ASFV-CN/GS/2018分離株中重組插入GFP標(biāo)簽)均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒?yàn)室提供。

1.1.2 試劑與抗體 胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基均購自美國 Gibco 公司;PBS 緩沖液購自北京索萊寶公司;β-actin小鼠單克隆抗體購自Proteintech公司;HRP標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG(H+L)二抗購自 Abbkine 公司;小鼠IgG購于碧云天有限公司,RNA 抽提試劑 Trizol 購自美國 Invitrogen 公司;TB GreenTMPremix ExTaq、PrimeScriptTMRT Master Mix、2×Pro Taq HS Probe Premix購自TaKaRa公司;D1133 L單克隆抗體[16]和 p72多克隆抗體均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 細(xì)胞總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反轉(zhuǎn)錄體系20 μL:5×PrimeScriptTMRT Master Mix 4 μL,RNA模板10 μL,DEPC水6 μL。反轉(zhuǎn)錄程序:37 ℃反轉(zhuǎn)擴(kuò)增 15 min;85 ℃變性 5 s,獲得cDNA,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)

相對(duì)定量:將反轉(zhuǎn)錄成的cDNA,以ASFV p72基因?yàn)榘悬c(diǎn)進(jìn)行PCR,引物序列見表1。反應(yīng)體系(20 μL):TB GreenTMPremix ExTaq10 μL,10 μmol·L-1上、下游引物各0.4 μL,DEPC水5.4 μL,cDNA3 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 2 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 34 s,共40 個(gè)循環(huán),利用 2-ΔΔCt方法對(duì)其進(jìn)行分析。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)引物信息

絕對(duì)定量:反應(yīng)體系(25 μL):12.5 μL 2×Pro Taq HS Probe Premix,1 μL 上下游引物,1 μL 探針,3 μL DNA,6.5 μL DEPC水。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)熱2 min;95 ℃預(yù)熱7 s,60 ℃預(yù)熱12 s,4次循環(huán);95 ℃預(yù)熱6 s,58 ℃預(yù)熱11 s,40次循環(huán)。引物和探針序列見表 1。

1.4 紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)(HAD50)

采取健康豬抗凝血清,用10倍體積的含有3%雙抗的PBS(pH=7.4)清洗至上清無色透明,最后使用PBS配成體積分?jǐn)?shù)為1%的豬紅細(xì)胞。將PAMs鋪入96孔板,加入1%的紅細(xì)胞懸液20 μL和倍比稀釋(10-1～10-8)的樣品100 μL,設(shè)置8個(gè)重復(fù),連續(xù)培養(yǎng)7 d,每天觀察紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。按照 Reed-Muench法計(jì)算 HAD50。

1.5 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)

在收取的細(xì)胞中加入1×loading buffer,100 ℃變性10 min,12 000 r·min-1離心5 min,進(jìn)行SDS-PAGE和轉(zhuǎn)移至NC膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入一抗于4 ℃搖床孵育過夜,二抗室溫孵育2 h,最后,加入Western Bright ECL化學(xué)發(fā)光顯色,使用化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)曝光。

1.6 病毒生長曲線

在PAMs上分別接種MOI=0.1的ASFV和ASFV-GFP重組病毒,在感染后指定時(shí)間將感染細(xì)胞與培養(yǎng)上清一起收集,反復(fù)凍融3次后,采用 QIAamp DNA Mini Kits試劑盒提取樣品DNA,通過絕對(duì)定量 PCR 測(cè)定 ASFV 拷貝數(shù)。

1.7 熒光顯微鏡觀察熒光數(shù)量

在熒光顯微鏡下觀察熒光數(shù)量及強(qiáng)弱的變化,并選取多個(gè)視野進(jìn)行拍照記錄,并使用Image J軟件對(duì)選取的視野里的綠色熒光數(shù)量進(jìn)行定量分析。

1.8 數(shù)據(jù)分析

用 GraphPad Prism 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析(*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001)。

2 結(jié) 果

2.1 D1133 L單克隆抗體抑制ASFV的基因轉(zhuǎn)錄水平和病毒效價(jià)

PAMs同時(shí)接種ASFV(MOI=0.1)和不同濃度的單克隆抗體,分別培養(yǎng)12、24和36 h,分別通過RT-qPCR和HAD50測(cè)定ASFV 的轉(zhuǎn)錄水平和病毒效價(jià)。結(jié)果顯示,加入不同濃度的單克隆抗體后,ASFVp72的轉(zhuǎn)錄水平(圖1A)和病毒效價(jià)(圖1B)均顯著降低,并且呈劑量依賴性。

A. ASFV p72轉(zhuǎn)錄水平;B. ASFV病毒效價(jià)。ns. P>0.05;*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001A. Transcription level of ASFV p72; B. Virus titer of ASFV. ns. P>0.05; *.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001

2.2 D1133 L單克隆抗體抑制ASFV的蛋白表達(dá)

PAMs同時(shí)接種ASFV(MOI=0.1)和不同濃度的單克隆抗體,分別培養(yǎng)12、24和36 h,用Western blot測(cè)定ASFV D1133 L和p72蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,加入不同濃度的單克隆抗體后,ASFV D1133 L和p72蛋白的表達(dá)水平均顯著降低,并呈劑量依賴性(圖2)。

圖2 D1133L單克隆抗體抑制病毒蛋白表達(dá)Fig.2 D1133L monoclonal antibody inhibits the expression of ASFV proteins

2.3 D1133 L單克隆抗體抑制ASFV-GFP熒光蛋白的表達(dá)

為了通過ASFV-GFP重組病毒產(chǎn)生的綠色熒光蛋白的表達(dá)水平來驗(yàn)證D1133 L單克隆抗體對(duì)ASFV復(fù)制的影響,首先在PAMs上接種了 ASFV和ASFV-GFP重組病毒,比較兩種毒株的生長曲線,結(jié)果表明,兩種毒株的生物學(xué)特性沒有差異(圖3A)。接著在PAMs同時(shí)接種ASFV-GFP重組病毒(MOI=0.1)和不同濃度的單克隆抗體,分別培養(yǎng)24、36和48 h,用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明,加入不同濃度的單抗后,綠色熒光蛋白的表達(dá)水平明顯降低,并且呈明顯的劑量依賴性(圖3B、C)。

A. ASFV和ASFV-GFP的生長曲線;B. ASFV-GFP綠色熒光蛋白的表達(dá)水平;C. Image J對(duì)綠色熒光的定量分析。ns. P>0.05;*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001A. Growth curve of ASFV and ASFV-GFP; B. Expression of ASFV-GFP green fluorescent protein; C. Quantitative analysis of green fluorescence by Image J. ns. P>0.05;*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001

以上結(jié)果表明,D1133 L單克隆抗體可以抑制ASFV的復(fù)制,且抗體濃度越弱,其抑制作用越弱。

3 討 論

關(guān)于ASFV單克隆抗體的研究中,一方面,結(jié)構(gòu)蛋白p30、p54和p72因其很好的抗原性,基于其制備的單克隆抗體的ASFV檢測(cè)方法被陸續(xù)地研發(fā)和報(bào)道[17-20],在ASFV的診斷中發(fā)揮作用。另一方面,針對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白MGF360-9 L制備的多克隆抗體被證明可以顯著抑制ASFV的復(fù)制[21];ASFV E165R基因編碼的dUTPase,作為病毒復(fù)制的關(guān)鍵酶,針對(duì)其制備的單克隆抗體可以抑制E165R本身的酶活性,可能因而影響ASFV的復(fù)制[22]。ASFVpB602 L基因在 ASFV 組裝中發(fā)揮重要作用,針對(duì)其制備的單克隆抗體可能會(huì)通過抑制pB602 L 的功能,從而干擾病毒顆粒的產(chǎn)生[23],在調(diào)控ASFV復(fù)制方面發(fā)揮作用。前期制備的D1133 L單克隆抗體具有良好的特異性,因此在本研究中,作者探索了單克隆抗體對(duì) ASFV 復(fù)制的影響,以期探究D1133 L蛋白在病毒復(fù)制過程中的作用。

在PAMs上同時(shí)接種不同濃度的D1133 L單克隆抗體和ASFV(MOI=0.1),發(fā)現(xiàn)不同濃度的抗體在不同的感染時(shí)間均能抑制ASFV在PAMs中的復(fù)制,并且隨著抗體的濃度降低,抑制作用減弱。推測(cè)D1133 L單克隆抗體可能影響D1133 L的功能,起到抑制ASFV復(fù)制的作用,但想要精確驗(yàn)證的抑制功能,還需要在體內(nèi)評(píng)估其抗病毒功效。因此 D1133 L單抗發(fā)揮其抑制作用的機(jī)制仍需要進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

本研究明確了D1133 L單克隆抗體在體外對(duì)ASFV復(fù)制的抑制作用,但是單克隆抗體發(fā)揮抑制作用的機(jī)制暫不清楚,還需進(jìn)一步探索。本研究有助于進(jìn)一步探究D1133 L在ASFV復(fù)制過程中發(fā)揮的作用,在ASF疫苗開發(fā)和抗病毒藥物靶點(diǎn)的選擇上提供一定的參考。