王娜娜,李頎菡,馬 媛,金昊延,胡亞美,馬 云,張令鍇

(寧夏大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 寧夏回族自治區(qū)反芻動(dòng)物分子與細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,銀川 750021)

家畜性別控制技術(shù)是通過(guò)對(duì)家畜正常生殖過(guò)程的人為干預(yù),使雌性動(dòng)物生產(chǎn)出符合人類所期望的性別后代的技術(shù)手段,在畜牧生產(chǎn)實(shí)踐中有著重要的意義[1-5]。在畜牧生產(chǎn)實(shí)踐中,通過(guò)家畜的性別控制可極大地加強(qiáng)良種選育的強(qiáng)度,加快育種進(jìn)程。同時(shí),對(duì)特定畜產(chǎn)品的需求往往會(huì)導(dǎo)致對(duì)動(dòng)物后代性別控制的需求偏向[6],例如,在實(shí)際生產(chǎn)中往往會(huì)使雌性家畜充分發(fā)揮繁殖和泌乳性能,而雄性家畜發(fā)揮其肉用或種用性能,使得公母畜最大限度產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益[3]。

性控技術(shù)主要分為受精前的X/Y精子分離和受精后早期胚胎鑒定兩大類,家畜育種主要聚焦于受精前的X/Y精子分離技術(shù)。目前,常用的受精前X/Y精子分離技術(shù)主要有離心分離法、免疫學(xué)分離法和流式細(xì)胞儀分離法等,其中流式細(xì)胞儀分離法應(yīng)用范圍最廣、分離效果最好;常用的受精后早期胚胎性別鑒定主要依靠SRY-PCR 法、免疫學(xué)法和細(xì)胞遺傳學(xué)方法等,其中最常用的是SRY-PCR法[7]。但以上方法在實(shí)際應(yīng)用中均有所限制,Umehara等[8]基于抗原抗體反應(yīng)報(bào)道了新的X/Y精子分離方法——激活TLR7和TLR8受體以分離X/Y精子。將TLR7和TLR8與共同配體R848共孵育,通過(guò)抑制糖酵解途徑以降低X精子ATP產(chǎn)生,影響X精子活力,從而分離X/Y精子。目前對(duì)該方法的作用機(jī)制及應(yīng)用前景的研究,將為畜產(chǎn)品發(fā)展提供巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

1 傳統(tǒng)性別控制技術(shù)

1.1 受精前X/Y精子分離技術(shù)

受精前的性別控制技術(shù)基于 X/Y 精子分離技術(shù),在畜牧業(yè)發(fā)展中起到重要作用。通過(guò)受精前的性別控制技術(shù)可以大幅提高家畜育種的選擇強(qiáng)度、縮短育種周期,從而提高育種效率。該技術(shù)是基于哺乳動(dòng)物 X/Y 精子的理化差異,利用物理或化學(xué)方法使得 X/Y 精子分離[9-12],然后使卵母細(xì)胞受精,是目前干預(yù)和選擇后代的最直接方法。研究發(fā)現(xiàn),X 精子和 Y 精子之間存在差異,包括體積大小、DNA 含量、游動(dòng)速度、表面電荷以及耐凍性[13]。早期的精子分離方法大多以 X/Y 精子之間存在的物理差異——精子的密度、形態(tài)、大小、活力、質(zhì)量、表面電荷等特性為依據(jù)進(jìn)行分離,這類方法缺乏試驗(yàn)的可靠性和重復(fù)性,未能在生產(chǎn)上得到有效推廣和應(yīng)用[14]。近年來(lái),隨著精子差異蛋白的深入研究,流式細(xì)胞儀分離技術(shù)成為目前最為成熟和科學(xué)可靠的精子分離方法[15]。此外,利用 CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)對(duì)精子進(jìn)行改造,實(shí)現(xiàn) X/Y 精子分離的研究也不斷涌現(xiàn)[16-17]。雖然這些技術(shù)還需要進(jìn)一步完善和驗(yàn)證,但它們具有非常大的應(yīng)用潛力,有望推動(dòng)受精前性別控制技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用。

1.1.1 離心分離法 研究表明,哺乳動(dòng)物 X/Y 精子的DNA含量不同,如牛、馬、羊、豬等的X精子染色體DNA含量分別比Y精子高3.8%、4.1%、4.2%、3.6%,X精子染色體DNA含量高于Y精子,使得X精子的密度及重量大于Y精子,在離心時(shí)X精子的沉降速度比Y精子快,從而使X精子和Y精子得到有效的分離[18]。曹世禎等[19]通過(guò)Percoll溶液將人的精液進(jìn)行離心,獲得了純度高達(dá)90% 以上的X精子。除此之外,曹世禎等[19]還利用該方法處理牛的精液,所得后代中雌性動(dòng)物比例超過(guò)50% 。使用該方法分離X/Y精子的操作時(shí)間短,對(duì)精子的損害小,但是分離X/Y精子缺乏重復(fù)性,其中的原因有待進(jìn)一步研究。

1.1.2 免疫學(xué)分離法 X/Y精子免疫學(xué)分離的關(guān)鍵是挖掘X 精子和Y精子的根本差異,X/Y精子基因差異表達(dá)會(huì)導(dǎo)致兩類精子表型發(fā)生變化,從而將二者進(jìn)行分離。X染色體上存在大量蛋白質(zhì)編碼基因,基因密度約為所有常染色體平均值的一半,大多數(shù)為編碼拷貝基因。相比之下,Y染色體只保留了常染色體3%的基因,且Y染色體上的雄性特異區(qū)域MSR共包含156個(gè)轉(zhuǎn)錄本,幾乎所有基因都與睪丸發(fā)育和精子形成有關(guān)。X/Y染色體的特異基因構(gòu)成了 X/Y 兩類精子間蛋白表達(dá)差異的遺傳基礎(chǔ),從而利用X/Y精子的蛋白表達(dá)差異分離出X/Y精子[20]。

H-Y抗原是哺乳動(dòng)物中最早發(fā)現(xiàn)的雄性特異性組織相容性抗原,免疫學(xué)分離法(immunomagnetic method)是利用H-Y抗體檢測(cè)Y精子質(zhì)膜上存在的H-Y型抗原(histocompatibility-y-antigen),根據(jù)抗原抗體反應(yīng)來(lái)分離家畜的X精子和Y精子[21],再選擇X精子或Y精子進(jìn)行人工授精從而得到所需性別后代的方法[14]?；谝陨显?羅承浩等[22]應(yīng)用生殖免疫技術(shù)制作性別化冷凍精液,配種受胎試驗(yàn)結(jié)果表明,性別化冷凍精液與正常凍精情期受胎率相似,且奶牛產(chǎn)母犢率可達(dá)60.7%。雖然利用此方法分離 X/Y 精子效率較高,但需要制備高效價(jià)的 H-Y抗體,且經(jīng)處理后的精子數(shù)目少、活力低,在實(shí)際生產(chǎn)中很難得到廣泛應(yīng)用[23]。SRY基因位于Y染色體短臂(Yp)上,是目前公認(rèn)的睪丸決定因子,在哺乳動(dòng)物的性別決定中至關(guān)重要[24]。為降低免疫分離方法的應(yīng)用成本,李蓉和華松[3]通過(guò)單克隆抗體技術(shù)制作針對(duì)關(guān)中奶山羊SRY的抗體,制備負(fù)載SRY抗體的磷酸鈣納米顆粒,注射到性成熟前的雄性羔羊的睪丸,阻礙Y精子的成熟分化,在體成熟后進(jìn)行采精,通過(guò)離心去除Y精子,能得到高比例的X精子。該技術(shù)具有低成本、簡(jiǎn)便、快速、易操作等優(yōu)勢(shì),有望在將來(lái)取代流式細(xì)胞儀分選法,廣泛應(yīng)用于家畜生產(chǎn)。

1.1.3 流式細(xì)胞儀分選法 研究表明,哺乳動(dòng)物X精子的DNA含量高于Y精子。Hochest33342作為一種廣泛應(yīng)用于核酸染色的熒光染料,可以通過(guò)與細(xì)胞或精子中的DNA結(jié)合,在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞核的形態(tài)和數(shù)量。在細(xì)胞活體染色的應(yīng)用中,Hoechst 33342也被稱為“活染劑”。其結(jié)合原理是通過(guò)靜電相互作用和氫鍵相互作用與DNA中的GC互補(bǔ)堿基對(duì)結(jié)合。將Hochest33342與精子核DNA 結(jié)合后,會(huì)發(fā)出藍(lán)色的熒光信號(hào),捕捉到的藍(lán)色熒光信號(hào)與核酸含量成正比例,從而使熒光染料在X/Y精子上的染色程度不同[25]。因此,在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行分離時(shí),在紫外激光的照射下,熒光標(biāo)記的X精子和Y精子會(huì)發(fā)出不同的熒光信號(hào)強(qiáng)度,可以通過(guò)檢測(cè)精子中的熒光信號(hào)來(lái)區(qū)分X精子和Y精子,從而使它們能夠被區(qū)分并分離出來(lái)[25-26]。目前,通過(guò)流式細(xì)胞儀分離動(dòng)物精子的準(zhǔn)確率已高達(dá)95%以上,生產(chǎn)的商業(yè)化性控精子已廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)中,尤其在奶牛、奶山羊的生產(chǎn)中應(yīng)用較多[27]。然而,據(jù)曾有權(quán)等[28]研究表明,利用流式細(xì)胞儀分離X/Y精子,精子分離的純度與活力及產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,并且在分離過(guò)程中對(duì) Y 精子的活力損失較大。此外,流式細(xì)胞儀分選成本高,對(duì)操作技術(shù)要求非常嚴(yán)格,使得該技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中受到一定的限制[28-29]。

1.1.4 基于基因編輯的X/Y精子分離方法 在精子發(fā)生過(guò)程中干擾Y染色體的生成是性別控制技術(shù)的一種新的發(fā)展方向[30]。從Y染色體中分離出的Y 染色體相關(guān)鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子(Y chromosome linked zinc-finger protein transcriptional factor,Zfy)被認(rèn)為是睪丸的決定基因,參與調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá),在精子發(fā)生過(guò)程中起著重要作用[31-32]。研究表明,在精子發(fā)生過(guò)程中,采用RNAi技術(shù)干擾與精子發(fā)生相關(guān)的特異性基因Zfy,Zfy基因的沉默會(huì)導(dǎo)致在精子形成過(guò)程中限制或損壞Y精子的功能發(fā)育,從而影響Y精子的形成,最終引起后代性別比例的改變[30-33]。目前,該方法在綿羊、馬鹿、豬及小鼠等動(dòng)物上取得了一定的性別控制效果[34-38],并且不會(huì)影響胚胎發(fā)育,具有極大的研究前景[30]。

上述方法中,流式細(xì)胞儀分選法是目前最常用、最成熟的X/Y精子分離方法,也是迄今為止唯一公認(rèn)的家畜性別控制方法,相較于其他方法,流式細(xì)胞儀分選的X/Y精子純度較高,可達(dá)到75%～90%[39]。然而,利用該方法分離X/Y精子依然存在儀器成本價(jià)格過(guò)高和專利費(fèi)昂貴等問(wèn)題,同時(shí),與普通精液相比,使用流式細(xì)胞儀獲取性控精液的效率較低(每小時(shí)僅7～12根細(xì)管),且每根細(xì)管的有效精子數(shù)量較少(200萬(wàn)～400萬(wàn)),極大限制了其在畜牧業(yè)中的應(yīng)用[40-41]。此外,利用流式細(xì)胞儀分選后的精子活率和質(zhì)膜完整性較低,從而影響受精率和胚胎發(fā)育[42]。因此,研究人員致力于挖掘X/Y 精子的差異表達(dá)基因或者蛋白,特別是尋找 X/Y 精子間的差異膜蛋白,以期發(fā)現(xiàn)分離X/Y 精子的新方法。近年來(lái),在根據(jù)X和Y精子之間的蛋白表達(dá)差異來(lái)分離 X/Y 精子方面取得了新的進(jìn)展。研究表明,精子具有一些先天的免疫細(xì)胞功能,發(fā)揮該功能的TLR 家族成員(Toll-like receptors,TLRs)可識(shí)別特定病原體,在哺乳動(dòng)物精子中表達(dá),且相關(guān)基因表達(dá)較高,能通過(guò)降低精子的運(yùn)動(dòng)性和受精能力來(lái)響應(yīng)細(xì)菌內(nèi)毒素LPS和肽聚糖[43],在精液或子宮感染細(xì)菌和/或病毒時(shí)通過(guò)改變精子獲能和過(guò)度活化運(yùn)動(dòng)來(lái)?yè)p害受精[43-44]。在此基礎(chǔ)上,Umehara等[8]報(bào)道了兩種膜相關(guān)受體蛋白:Toll樣受體7(Toll-like receptor 7,TLR7)和Toll樣受體8(Toll-like receptor 8,TLR8)。TLR7和TLR8均定位于細(xì)胞內(nèi)膜,在哺乳動(dòng)物先天免疫和炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[45]。TLR7和TLR8可被RNA病毒釋放的單鏈RNA激活,RNA介導(dǎo)的生殖道中TLR7和TLR8的激活可能會(huì)增加X(jué)Y胚胎與XX胚胎的比例[46]。雷西莫特(R848)是咪唑喹啉的小分子化合物,也是TLR7和TLR8的激動(dòng)劑,目前臨床上用于治療感染性病毒性疾病和腫瘤[47-48],可用于分離小鼠附睪中的X精子或Y精子。由于在X染色體上編碼的TLR7和TLR8在精子中表達(dá)并且兩者都具有共同的配體,將精子與 TLR7和TLR8的配體R848一起進(jìn)行孵育后,TLR7和TLR8的配體會(huì)選擇性地抑制攜帶X染色體的 X 精子的運(yùn)動(dòng)能力,而Y精子不受影響,且不會(huì)改變精子的質(zhì)膜和頂體完整性,從而利用X/Y精子運(yùn)動(dòng)能力差異分離 X 和 Y 精子,使用該方法分離 X/Y 精子的準(zhǔn)確性達(dá)到了80% 以上[40]。Umehara等[8]的工作為研究精子表面特異性蛋白差異和進(jìn)一步控制哺乳動(dòng)物的后代性別提供了新的技術(shù)手段[49]。迄今為止,激活精子中TLR7和TLR8受體的生理相關(guān)性尚未得到徹底探索,該方法仍需在其他哺乳動(dòng)物上進(jìn)一步研究與驗(yàn)證,并探索其作用的相關(guān)生理機(jī)制。解決這一難題后,該方法有望取代流式細(xì)胞分選技術(shù)用于高效率制備家畜性控精液[8,50]。

1.2 受精后早期胚胎性別鑒定

隨著精卵結(jié)合形成胚胎,胚胎的性別已經(jīng)確定,因而在胚胎移植前,通過(guò)對(duì)胚胎進(jìn)行性別鑒定,可以人為篩選出所需性別的胚胎進(jìn)行移植,從而生產(chǎn)出符合預(yù)期性別的家畜后代。目前,常用的胚胎性別鑒定方法主要有 SRY-PCR 法、免疫學(xué)法和細(xì)胞遺傳學(xué)方法。

1.2.1 SRY-PCR法 SRY-PCR 法的原理是針對(duì)Y精子的特異性SRY基因,設(shè)計(jì)特異性引物后進(jìn)行 PCR 鑒定。近年來(lái),隨著 PCR 技術(shù)的快速發(fā)展和普及,SRY-PCR 因其靈敏度高、速度快和可重復(fù)性好等特點(diǎn),而被廣泛應(yīng)用于早期胚胎性別鑒定,是目前最常用的早期胚胎性別鑒定方法[3]。劉俊平等[51]采用 PCR技術(shù)對(duì)牛體內(nèi)胚胎和體外胚胎的性別進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示,兩種胚胎移植后母牛的妊娠率無(wú)顯著差異,后代犢牛的性別與鑒定結(jié)果符合率則高達(dá) 100% 。目前,SRY-PCR 性別鑒定技術(shù)已成功應(yīng)用于小鼠、兔、豬、牛和羊等哺乳動(dòng)物的早期胚胎鑒定,通過(guò)使用PCR方法檢測(cè)胚胎的SRY基因是否存在,進(jìn)行早期胚胎的性別鑒定,胎兒出生后的性別符合率可高達(dá)100%[3,7,27,52],使用該方法鑒定早期胚胎性別的操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確率高,但由于需從胚胎分離部分細(xì)胞,可能會(huì)對(duì)胚胎后期發(fā)育造成損傷。此外,由于該方法主要使用胚胎作為樣品,導(dǎo)致起始樣品量少,擴(kuò)增量大,容易造成污染產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果,從而影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[27,53]。

1.2.2 免疫學(xué)法 采用免疫學(xué)法檢測(cè)早期胚胎性別是利用雄性胚胎有特異性的H-Y抗原,采用H-Y抗血清或 H-Y單克隆抗體進(jìn)行鑒定,目前最常用的免疫學(xué)法主要是指間接免疫熒光法。間接免疫熒光法是將胚胎移入含有 H-Y 抗血清或 H-Y單克隆抗體的液體中,再添加熒光素標(biāo)記的二抗,以胚胎呈現(xiàn)的特異熒光為標(biāo)記,熒光陽(yáng)性則為雄性胚胎,否則為雌性胚胎。該鑒定方法在豬、牛、綿羊等家畜上已有成功示范,準(zhǔn)確率均在85% 左右。但是由于 H-Y 抗原的特異性弱,熒光強(qiáng)度的判斷易受主觀性影響,從而容易導(dǎo)致該鑒定方法的準(zhǔn)確性偏低[3]。

1.2.3 細(xì)胞遺傳學(xué)方法 由于雌性胚胎有一條失活的特異性X染色體即巴氏小體,而雄性胚胎沒(méi)有,因而可以通過(guò)有無(wú)巴氏小體來(lái)判斷早期胚胎的性別。但該方法首先要用秋水仙素處理胚胎后再進(jìn)行核型分析,因而會(huì)對(duì)胚胎造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷,所以不適用于家畜的生產(chǎn),目前僅僅用于驗(yàn)證其他性別篩選方法的準(zhǔn)確性[3]。

2 TLR7和TLR8在性控技術(shù)中的研究進(jìn)展

2.1 TLR7和TLR8受體在小鼠及家畜睪丸和精子中的定位表達(dá)

2019年,Umehara等[8]通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡分析(Western blot)、流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)和免疫熒光染色(immunofluorescence,IF)分析了TLR7和TLR8在小鼠睪丸、附睪及精子中的表達(dá),發(fā)現(xiàn) TLR7和TLR8存在于小鼠附睪精子、睪丸精子細(xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞(leydig cell)中,但在睪丸支持細(xì)胞(sertoli cell)中表達(dá)較弱。通過(guò)從附睪尾部收集的小鼠成熟精子中研究發(fā)現(xiàn)TLR7和TLR8是小鼠 X 染色體編碼的蛋白,在小鼠X精子中特異性表達(dá),并定位于小鼠精子中段和鞭毛部分,且陽(yáng)性精子的比例接近50%[8]。Ren 等[54]研究發(fā)現(xiàn),TLR7和TLR8也是關(guān)中奶山羊X染色體的編碼基因,通過(guò)對(duì)奶山羊睪丸組織和附睪組織進(jìn)行PNA染色,發(fā)現(xiàn)TLR8+信號(hào)主要定位在奶山羊精子中段及尾部的連接部分,而TLR7+信號(hào)主要定位在奶山羊精子的整個(gè)尾部。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),TLR7和TLR8蛋白在睪丸圓形精子細(xì)胞、附睪精子和成熟精子中均有表達(dá),且TLR7和TLR8陽(yáng)性精子比例接近50%[50,54]?；?Umehara等[55]的研究結(jié)果:TLR7和TLR8蛋白在公牛X精子中均定位于精子尾部。劉偉東[40]推測(cè),TLR7和TLR8在秦川牛X精子中特異表達(dá),通過(guò)對(duì)秦川牛睪丸圓形精子、附睪精子和成熟精子分別進(jìn)行TLR7和TLR8免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)TLR7和TLR8在秦川牛的睪丸圓形精子、附睪精子和成熟精子中均有表達(dá),且TLR7和TLR8陽(yáng)性精子比例接近50% 。與上述研究有所不同的是,吳昌華等[56]利用免疫組化檢測(cè)公豬睪丸和附睪中的TLR7和TLR8的定位表達(dá),發(fā)現(xiàn)TLR7和TLR8 mRNA在公豬睪丸、附睪頭、附睪體、附睪尾組織以及精子中均有表達(dá)。然而,通過(guò)細(xì)胞免疫熒光驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)TLR7和TLR8蛋白在公豬X精子和Y精子中均有表達(dá)且表達(dá)模式無(wú)顯著差異:TLR7蛋白主要表達(dá)于豬精子頭部頂體區(qū)域,TLR8蛋白主要表達(dá)于豬精子尾部。上述研究表明,小鼠、牛和奶山羊TLR7和TLR8在精子中的定位表達(dá)相似,均在X染色體上特異性表達(dá)。但在豬中的定位表達(dá)并未表現(xiàn)出與前者的一致性,且未有特異性表達(dá)結(jié)果。

2.2 TLR7和TLR8激動(dòng)劑R848對(duì)小鼠及家畜精子活力及運(yùn)動(dòng)性能的影響

Umehara 等[8,55]研究發(fā)現(xiàn),在X染色體上的TLR7和TLR8在小鼠精子中表達(dá)且具有相同的配體雷西莫特(R848),通過(guò)將小鼠精子與R848或TLR7的特異性配體咪喹莫特(R837)共同孵育后,使用精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)分析(CASA),結(jié)果表明,用TLR7和TLR8特異性配體(R848/R837)處理小鼠精子后顯著降低了小鼠X精子的運(yùn)動(dòng)速度而不影響Y精子的運(yùn)動(dòng)速度,導(dǎo)致下層 X 精子百分比顯著降低(P<0.05),上層 Y 精子的百分比顯著增加(P<0.05)。并通過(guò)試驗(yàn)證明,在去除R848后小鼠精子活力恢復(fù),即R848對(duì)精子活力的抑制是可逆的[40,54-55],R848處理后的小鼠精子保持受精能力[8]。由于平均路徑速度(average path velocity,VAP)與頂體反應(yīng)精子的數(shù)量之間存在顯著相關(guān)性[57];VAP和平均直線運(yùn)動(dòng)速率(average straight line velocity,VSL)與生育率呈正相關(guān)[58];平均曲線運(yùn)動(dòng)速率(average curve line velocity,VCL)與精子濃度相關(guān)并影響生育能力[59],Ren等[54]向奶山羊精液中加入 TLR7和TLR8 的配體(激活劑)R848,探究其對(duì)奶山羊精子運(yùn)動(dòng)性能的影響,試驗(yàn)表明,在添加R848孵育后,奶山羊的下層精子活力以及VAP、VSL和VCL等精子運(yùn)動(dòng)相關(guān)參數(shù)均顯著下降(P<0.05),而上下層精子的質(zhì)膜完整率和頂體完整率均無(wú)顯著變化(P>0.05)。與該研究結(jié)果相似的是,劉偉東[40]為探究TLR7和TLR8激動(dòng)劑R848對(duì)牛精子運(yùn)動(dòng)性能的影響,將不同濃度TLR7和TLR8激動(dòng)劑R848與秦川牛精子共同孵育,分析上游精子的比例,結(jié)果顯示,R848處理組處理后上層 X 精子比例顯著低于對(duì)照組 (P<0.05),此外,下層 X 精子 VAP 、 VSL 和 VCL 均顯著低于上層 Y 精子和對(duì)照組(P<0.05),且下層X(jué)精子運(yùn)動(dòng)軌跡變短;同時(shí)下層 X 精子的活力較上層Y精子和對(duì)照組有顯著下降(P<0.05),而上、下層精子的質(zhì)膜完整率和頂體完整率與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化(P>0.05),表明TLR7和TLR8激動(dòng)劑R848抑制了下層 X 精子的運(yùn)動(dòng)性能,但對(duì)上、下層的精子質(zhì)量無(wú)明顯影響。與上述研究結(jié)果不同,吳昌華等[56]用TLR7和TLR8配體R848孵育豬精子后,精子活力降低,但上層兩種性別精子的比例沒(méi)有顯著變化且與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。究其原因,可能是精子的糖酵解途徑被抑制,產(chǎn)生的ATP減少,影響了精子運(yùn)動(dòng),從而使處理后的精子活力降低。由于TLR7和TLR8在豬的X/Y精子中均有表達(dá),使 R848 孵育豬 X/Y 精子后兩種精子的活力均受到影響,但X/Y 精子無(wú)法分離?；谪i不同于小鼠、奶山羊、秦川牛的特點(diǎn),印證了TLR7和TLR8激動(dòng)劑分離其他家畜 X/Y 精子的可能性。

2.3 TLR7和TLR8激動(dòng)劑R848對(duì)小鼠及家畜精子活力及運(yùn)動(dòng)的作用機(jī)制

由于精子運(yùn)動(dòng)速度受精子細(xì)胞內(nèi)ATP水平的調(diào)節(jié),Umehara等[8]探究了TLR7和TLR8 配體對(duì)精子中 ATP 產(chǎn)生的影響,用兩種TLR7和TLR8配體(R848、R837)孵育小鼠精子后,精子中的ATP水平顯著降低[8,60]。由于ATP的產(chǎn)生受線粒體三羧酸循環(huán)、β氧化和/或細(xì)胞質(zhì)糖酵解的調(diào)節(jié)[61-62],Umehara等[8]對(duì)小鼠精子的線粒體活性和糖酵解活性進(jìn)行了測(cè)定。試驗(yàn)表明,定位在小鼠X精子中段的TLR8的激活抑制了精子線粒體活性,而定位在小鼠X精子尾部的TLR7的激活抑制了精子細(xì)胞質(zhì)的糖酵解。此外,該研究還表明R848能促進(jìn)核因子κB(NF-κB)和糖原合成酶激酶3α/β(glycogen synthase kinase 3α/β,GSK 3α/β)的磷酸化,通過(guò)GSK 3α/β-己糖激酶途徑抑制X精子產(chǎn)生ATP,從而降低 X 精子運(yùn)動(dòng)性能[8]。

基于TLR7和TLR8激活劑影響奶山羊下層精子(X精子)活力且對(duì)精子的質(zhì)膜和頂體完整率無(wú)顯著影響的研究結(jié)果,Ren等[54]進(jìn)一步探究了R848對(duì)奶山羊精子ATP水平和線粒體活性的影響,結(jié)果表明,添加 TLR7和TLR8 激活劑(R848)孵育奶山羊精子后,精子ATP水平和線粒體活性均顯著降低(P<0.05)。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),R848處理奶山羊精子后,精子中的NF-κB和GSK 3α/β的磷酸化水平顯著增加(P<0.05);并且下層精子(X精子)的NF-κB和GSK 3α/β的磷酸化水平相較于上層精子(Y精子)有顯著增加(P<0.05)。此外,任發(fā)[50]利用流式細(xì)胞儀對(duì)分選后的上、下層精子分別進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)上層中Y精子和下層中X精子所占比例均在80% 以上。該結(jié)果進(jìn)一步證明了TLR7和TLR8在奶山羊X精子中特異性表達(dá),且R848通過(guò)特異性激活TLR7和TLR8信號(hào)通路影響奶山羊精子的己糖激酶途徑,從而抑制了X精子的運(yùn)動(dòng)性能。該研究通過(guò)鑒定出特異表達(dá)在奶山羊X精子上的TLR7和TLR8蛋白,初步建立了一種奶山羊精子分離的方法,為奶山羊性別控制技術(shù)提供了理論參考,同時(shí)也為家畜的性控技術(shù)提供了新的理論技術(shù)參考。

與上述研究結(jié)果相似,劉偉東[40]在確定TLR7和TLR8激動(dòng)劑 R848 可以抑制 X精子運(yùn)動(dòng)性能后,將牛精子與TLR7和TLR8激動(dòng)劑R848共孵育后,檢測(cè)上、下層精子 ATP 、線粒體膜電位后發(fā)現(xiàn),下層 X 精子的 ATP 和線粒體膜電位均顯著低于上層 Y 精子和對(duì)照組(P<0.05);對(duì)上層精子和下層精子進(jìn)行Western blot檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),下層X(jué)精子NF-κB和GSK3α/β的磷酸化水平相較于上層Y精子有顯著增加(P<0.05)。劉偉東[40]推測(cè),R848通過(guò)與X精子TLR7和TLR8受體結(jié)合后,可分別通過(guò)GSK 3α/β 和NF-κB信號(hào)通路提高GSK 3α/β和NF-κB蛋白磷酸化水平,進(jìn)而抑制精子線粒體和己糖激酶活性,降低 X 精子的ATP水平和線粒體膜電位,從而導(dǎo)致 X 精子的活力降低。但其具體的分子調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。同樣,劉偉東[40]同樣驗(yàn)證了分選后 X 精子和 Y 精子的純度,發(fā)現(xiàn)上層的 Y 精子百分比為88.6% ,而下層的 X 精子百分比為72.5% 。由該研究結(jié)果可知,用 TLR7和TLR8 特異蛋白激活分選技術(shù)能夠有效分離牛的X精子和Y精子,為研發(fā)性控精液新技術(shù)提供理論參考。同時(shí)有助于促進(jìn)我國(guó)肉牛種業(yè)發(fā)展,加速良種肉牛繁育進(jìn)程。

上述研究分別發(fā)現(xiàn),TLR7和TLR8 激活劑可通過(guò)調(diào)控小鼠、關(guān)中奶山羊和秦川牛X精子的線粒體活性和ATP水平抑制X精子的運(yùn)動(dòng)性能,激活TLR信號(hào)通路,通過(guò)GSK 3α/β-己糖激酶途徑增加NF-κB和GSK 3α/β磷酸化,從而降低精子活力,但對(duì)Y精子無(wú)影響[40]。然而,對(duì)于TLR7和TLR8調(diào)節(jié)精子中己糖激酶活性的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究[55]。

3 總結(jié)與展望

在精子分離技術(shù)的研究中,上游法是一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的精子分離方法,可使高活力精子上游而聚集在上層,低活力精子或死精子則留于下層,上游法分離出的精子具有更高的活力[63]。然而,該方法的分離結(jié)果在物種上存在一定差異[64]。在Umehara等[55]和 Ren等[54]研究的基礎(chǔ)上,劉偉東[40]通過(guò)改進(jìn)上游法,并加入TLR7和TLR8激動(dòng)劑R848,與牛精子共孵育使得上層精子比例顯著降低,從而使X/Y精子分離。該方法利用TLR7和TLR8激動(dòng)劑激活TLR7和TLR8受體,使 X 精子的活力及運(yùn)動(dòng)性能降低,從而分離出X/Y精子。這使得激活TLR7和TLR8成為分離出家畜X/Y精子的一種可能,有望為家畜的性控技術(shù)提供新方法。該方法目前在牛、奶山羊及豬中有進(jìn)一步的研究,發(fā)現(xiàn)該方法在家畜生產(chǎn)中可能適用于牛和羊的X/Y精子分離,但并不適用于豬的X/Y精子分離。吳昌華等[56]研究結(jié)果表明,TLR7和TLR8蛋白在豬的兩種性別精子中都有表達(dá),說(shuō)明在精子發(fā)生過(guò)程中,由 X 染色體編碼的TLR7和TLR8蛋白在兩種性別精子中可能得到了共享,從而使二者對(duì)TLR7和TLR8的定位表達(dá)表現(xiàn)出相似性。另外,將豬精子經(jīng)R848孵育后,X/Y精子的活力均降低,但上層兩種性別精子的比例沒(méi)有顯著變化[56]。李志強(qiáng)[65]關(guān)于豬X精子和Y精子蛋白質(zhì)組學(xué)的研究顯示,在公豬的X/Y精子差異蛋白中并未發(fā)現(xiàn) TLR7和TLR8蛋白,即TLR7和TLR8在豬的兩種性別精子中都有表達(dá),因此使得R848孵育后 X/Y精子活力都受到影響而無(wú)法將其分離[56]。豬精子的TLR7和TLR8蛋白表達(dá)模式與小鼠、牛和奶山羊精子存在著很大的差異,這可能是不同物種間的差異性導(dǎo)致同一蛋白表達(dá)模式差異的結(jié)果,因而使得該方法在不同物種之間的應(yīng)用有所差異。因此,利用該方法分離 X/Y 精子目前有待進(jìn)一步研究,在不同家畜中的應(yīng)用仍具有較高的研究?jī)r(jià)值。由于TLR7和TLR8基因的表達(dá)在哺乳動(dòng)物 X 染色體上高度保守[66],因此使用TLR7和TLR8配體活化的新型方案有望適應(yīng)哺乳動(dòng)物生殖技術(shù),以便在短時(shí)間內(nèi)分離X/Y精子,且無(wú)需使用昂貴、有害和耗時(shí)的細(xì)胞分選系統(tǒng)。

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和人類對(duì)畜產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)效益追求的提升,人們對(duì)特定性別家畜的需求量不斷增加,將來(lái),對(duì)X/Y精子進(jìn)行準(zhǔn)確、完全、無(wú)損害的分離和對(duì)家畜進(jìn)行簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、安全、快速的性別篩選將會(huì)成為動(dòng)物生產(chǎn)的未來(lái)趨勢(shì)。因此,研究和發(fā)展性控技術(shù)將為高效、快速培養(yǎng)新的優(yōu)良品種和高效的動(dòng)物生產(chǎn)提供更有力的技術(shù)手段。后續(xù),課題組將展開(kāi)對(duì)激活TLR7和TLR8受體分離灘羊X/Y精子后X精子的代謝途徑以及 X/Y 精子染色質(zhì)開(kāi)放性研究,以期取得進(jìn)一步研究成果,為TLR7和TLR8分離 X/Y 精子的進(jìn)一步研究做出貢獻(xiàn)。目前,利用TLR7和TLR8進(jìn)行X/Y精子分離成為具有極大前景的研究方向。本綜述將為接下來(lái)在家畜中激活TLR7和TLR8進(jìn)行精子分離技術(shù)提供更多的理論參考,以促進(jìn)現(xiàn)代畜牧產(chǎn)業(yè)快速高質(zhì)量發(fā)展。