張煜杭, 鄭維豪, 姬格金, 葛佳儀, 鮮思美

(1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025;2. 貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550025)

半乳糖凝集素1(LGALS1/Galectin-1)是 Galectins家族的 15 個(gè)成員之一,大小約15 ku,是第1個(gè)被研究并報(bào)道的哺乳動(dòng)物半乳糖凝集素,能在多種免疫細(xì)胞中表達(dá),如:樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等[1]。LGALS1是1種β-半乳糖苷結(jié)合蛋白,可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)等過(guò)程,還可通過(guò)結(jié)合病毒蛋白或調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)途徑從而介導(dǎo)宿主與病毒的相互作用,對(duì)病毒感染有抑制作用[2]。例如:LGALS1與豬繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)的E蛋白相互作用可抑制PRRSV的復(fù)制[3];LGALS1特異性結(jié)合尼帕病毒(NiV)糖蛋白NiV-F和NiV-G(促進(jìn)細(xì)胞間融合和合胞體形成),從而阻斷病毒感染[4];LGALS1與塞卡病毒E蛋白結(jié)合時(shí)下調(diào)LGALS1表達(dá)量,可減少塞卡病毒的吸附與侵入等[5]。為進(jìn)一步了解LGALS1基因的遺傳進(jìn)化情況,本試驗(yàn)以山羊?yàn)檠芯繉?duì)象,從山羊睪丸細(xì)胞中克隆得到LGALS1基因,并對(duì)LGALS1基因的遺傳進(jìn)化進(jìn)行初步分析,以期為進(jìn)一步研究羊源LGALS1基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Trizol試劑、PrimeSTAR Max Premix(2×)、pMD19-T載體、DNA 連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ(購(gòu)自 TaKaRa 公司),Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自翌圣生物科技有限公司),DH5a感受態(tài)細(xì)胞、2×PCR Master Mix、SanPrep 柱式 DNA 膠回收試劑盒[購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司],DNA Marker DL 2 000、DL 5 000(購(gòu)自Vazyme公司)。

1.2 主要儀器

PCR儀[型號(hào):TC-96/G/H(b)B,BIOER公司]、電泳儀(型號(hào):EPS300,Tanon公司)、凝膠成像儀(型號(hào):Tanon-1600,Tanon公司)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(型號(hào):ScanSpeed 1730R,LA-BOGENE公司)、分光光度計(jì)(型號(hào):NanoDrop One,Thermo Fisher公司)。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Genbank中登錄的山羊LGALS1基因序列(登錄號(hào):XM_018048739.1),應(yīng)用Primer Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)帶酶切位點(diǎn)的特異引物[生工生物工程(上海)股份有限公司合成],下劃線部分分別為BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)。引物信息見表1。

1.4 山羊睪丸細(xì)胞總RNA提取及cDNA第一鏈合成

采用Trizol法提取山羊睪丸細(xì)胞的總RNA,使用分光光度計(jì)測(cè)定其濃度與純度并記錄數(shù)值,將A260 nm/A280 nm比值在1.8～2.1間的RNA使用Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄體系20 μL:5×gDNA digester Mix 3 μL,RNA模板2 μL,RNase-Free H2O 10 μL,4× Hifair?Ⅲ SuperMix plus 5 μL。反應(yīng)程序:25 ℃孵育5 min,55 ℃孵育15 min,85 ℃孵育5 min。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物于 -20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 山羊睪丸細(xì)胞LGALS1基因PCR擴(kuò)增

將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50 μL:PrimeSTAR Max Premix(2×)25 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL,模板cDNA 1 μL,ddH2O 20 μL。PCR擴(kuò)增條件:98 ℃ 變性10 s,60 ℃退火5 s,72 ℃延伸60 s,共35個(gè)循環(huán)。取擴(kuò)增產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠中電泳,凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.6 山羊睪丸細(xì)胞LGALS1基因的克隆與鑒定

采用SanPrep 柱式 DNA 膠回收試劑盒對(duì)LGALS1目的基因進(jìn)行膠回收,將目的基因與pMD19-T載體連接,在PCR反應(yīng)管中建立連接體系20 μL:pMD19-T載體2 μL,SolutionⅠ10 μL,回收目的DNA 8 μL。充分混勻,置于金屬恒溫儀16 ℃連接過(guò)夜。將重組質(zhì)粒pMD19-T-LGALS1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞,步驟如下:(1)取出大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞100 μL,冰上溶解后加入連接產(chǎn)物10 μL(連接產(chǎn)物不超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞的1/10),輕搖混勻后冰上放置30 min,每10 min輕彈1次,42 ℃熱擊90 s冰上放置1 min。(2)加入預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基900 μL,混勻后37 ℃搖床培養(yǎng)1 h。(3)將菌液4 ℃ 8 000 r/min離心2 min,棄去上清800 μL。(4)重懸菌體沉淀,將其涂布于含有氨芐西林(終濃度100 μg/mL)的LB平板培養(yǎng)基,正面放置,待完全吸收后倒置培養(yǎng)皿,37 ℃恒溫培養(yǎng)12～16 h,進(jìn)行陽(yáng)性克隆挑選。(5)挑選菌進(jìn)行質(zhì)粒PCR驗(yàn)證(方法同1.4),并使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證(陽(yáng)性重組質(zhì)粒約3 110 bp,pMD19-T空載體約2 700 bp,目的基因約400 bp),在PCR反應(yīng)管中建立酶切體系50 μL:BamHⅠ1 μL,XhoⅠ1 μL,緩沖液25 μL,pMD19-T-LGALS15 μL,ddH2O 18 μL。輕輕混勻后瞬時(shí)離心,37 ℃保溫15 min。將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.7 山羊睪丸細(xì)胞LGALS1基因序列分析

使用DNAStar的MEGA 5.0軟件將克隆的山羊LGALS1基因與Genbank中其他14個(gè)物種(見表2)的LGALS1基因序列進(jìn)行核苷酸同源性分析并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊睪丸細(xì)胞LGALS1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,對(duì)LGALS1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析,得到長(zhǎng)度為408 bp的片段,與預(yù)期相符(見圖1)。

M:DL 5 000 Marker;1:空白對(duì)照;2～4:LGALS1基因PCR產(chǎn)物

2.2 山羊睪丸細(xì)胞LGALS1基因重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

對(duì)克隆重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到長(zhǎng)度為408 bp的特異片段,與預(yù)期相符(見圖2)。

M:DL 5 000 Marker;1:空白對(duì)照;2～3:pMD-19T-LGALS1質(zhì)粒PCR產(chǎn)物

2.3 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切,酶切產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為2 700 bp的pMD-19T載體和408 bp目的條帶,與預(yù)期相符,表明LGALS1基因成功插入克隆載體(見圖3)。

M:DL 5 000 Marker;1:空白對(duì)照;2～3:pMD-19T-LGALS1 雙酶切產(chǎn)物

2.4 山羊睪丸細(xì)胞LGALS1基因序列分析

測(cè)序結(jié)果表明,克隆的LGALS1基因與GenBank中登錄的山羊LGALS1編碼區(qū)序列(XM_018048739.1)相似性達(dá)100%。相似性比對(duì)結(jié)果顯示,克隆山羊LGALS1基因與綿羊、羚羊、牛的同源性最高,核苷酸相似性均大于96%,與其他物種的核苷酸相似性介于54.6%～90.9%之間,其中與斑馬魚相似性最低(54.6%)(見圖4)。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,LGALS1基因在山羊、綿羊、羚羊中為同一分支且親緣關(guān)系最近,與斑馬魚的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(見圖5)。

圖4 LGALS1基因核苷酸序列比對(duì)結(jié)果

圖5 LGALS1基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 結(jié)論

試驗(yàn)成功克隆了山羊睪丸細(xì)胞LGALS1基因;經(jīng)核苷酸序列同源性比對(duì)及遺傳進(jìn)化樹分析,山羊LGALS1基因種內(nèi)高度保守,與綿羊、羚羊親緣關(guān)系最近,與斑馬魚親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

4 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明,LGALS1基因CDS區(qū)長(zhǎng)度為408 bp,共編碼135個(gè)氨基酸,與張凱等[6]、趙志峰等[7]對(duì)白來(lái)航雞和梅花鹿的LGALS1基因研究結(jié)果一致。相似性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,山羊LGALS1基因與同屬動(dòng)物的核苷酸一致性都在99%以上,與斑馬魚相似性最低(54.6%),與遺傳距離結(jié)果一致,表明LGALS1基因具有較強(qiáng)的種屬進(jìn)化特異性和多樣性,不同物種之間同源性越高,其進(jìn)化關(guān)系越近。本試驗(yàn)克隆的山羊睪丸細(xì)胞LGALS1基因可為后續(xù)的抗羊LGALS1抗體制備和羊源LGALS1蛋白功能研究奠定基礎(chǔ)。