張旭山, 脫浩亮, 芮 弦, 石正發(fā), 崔慧雅

(中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠,甘肅 蘭州 730040)

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄動(dòng)物的急性、熱性、高度接觸性傳染病,完整的病毒粒子(146S)是口蹄疫疫苗有效成分的重要組成部分,其含量直接決定疫苗的質(zhì)量[1]。目前中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所出具的獸用生物制品生產(chǎn)與檢驗(yàn)報(bào)告已將146S列為必檢項(xiàng)目,作為評(píng)價(jià)疫苗質(zhì)量最重要的參數(shù)之一,并逐步替代PD50值檢測(cè),這對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。完整的病毒顆粒是疫苗的主要成分,其完整性對(duì)于疫苗效力至關(guān)重要,能夠更好地模擬天然病毒,從而激發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)研究表明,完整的病毒顆粒能夠更有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和細(xì)胞免疫,從而提高疫苗的保護(hù)效果。如果病毒顆粒的完整性受損,其免疫原性將會(huì)降低,導(dǎo)致疫苗效力下降。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明,離心濁度和次數(shù)對(duì)病毒顆粒回收具有顯著影響:在一定范圍內(nèi),隨著離心濁度增加和排渣次數(shù)減少,病毒顆粒的回收率提高。然而過高的離心濁度則會(huì)直接影響后續(xù)的滅活和濃縮純化。此外,過度頻繁排渣會(huì)造成合格料液及完整病毒顆粒大量浪費(fèi),導(dǎo)致回收率下降。在口蹄疫免疫中,能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細(xì)胞的主要是完整病毒顆?？乖?該抗原基本含有口蹄疫病毒所有的中和位點(diǎn),是口蹄疫病毒主要的有效抗原成分[2]。本試驗(yàn)通過對(duì)離心機(jī)設(shè)置不同的離心參數(shù)對(duì)口蹄疫病毒有效抗原成分回收率進(jìn)行檢測(cè),為疫苗生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

口蹄疫(Re-A/WH/09株)病毒液(中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠提供)、146S檢測(cè)試劑盒(賽諾利康生物技術(shù)有限公司)。

1.2 主要儀器

高速連續(xù)流離心機(jī)[型號(hào):BTPX710,阿法拉伐(上海)有限公司]、在線濁度儀[型號(hào):CONTROL 4000,奧普士樂利(中國)有限公司]、便攜式濁度儀(型號(hào):HACH 2100Q,美國哈希公司)、紫外分光光度計(jì)(型號(hào):X-6,上海元析儀器有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 離心機(jī)完整性測(cè)試

在試驗(yàn)前1天用純化水對(duì)離心機(jī)水濾器進(jìn)行30 min沖洗浸潤(rùn),然后加壓至0.2 MPa進(jìn)行氣泡點(diǎn)試驗(yàn),檢測(cè)合格后連通離心滅活系統(tǒng)進(jìn)行121 ℃、40 min 高壓滅菌。

1.3.2 排渣時(shí)間設(shè)定

將培養(yǎng)的懸浮口蹄疫Re-A/WH/09病毒液用設(shè)定值按固定時(shí)間排渣,時(shí)間分別設(shè)定為10、15、20、25、30 min進(jìn)行自動(dòng)排渣,通過離心相同體積(3 000 L)病毒液,收集離心樣的體積和渣液的體積,計(jì)算料液的回收率。

1.3.3 排渣濁度設(shè)定

使用在線濁度儀根據(jù)下游工藝要求的料液濁度進(jìn)行排渣,濁度分別設(shè)定為30、40、50、60、80 NTU進(jìn)行排渣,通過離心相同體積(3 000 L)病毒液,收集離心樣的體積和渣液的體積,計(jì)算料液的回收率,分析不同濁度對(duì)料液的損失情況。

1.3.4 離心回收病毒液

用離心機(jī)將病毒液離心結(jié)束后,用滅菌磷酸鹽緩沖液對(duì)離心機(jī)內(nèi)殘留的病毒液進(jìn)行循環(huán)回收,將殘留在離心機(jī)腔體里的料液置換出來,進(jìn)一步提高料液有效成分的回收率。

1.3.5 損失料液146S含量測(cè)定

實(shí)際生產(chǎn)中最常用的146S定量方法主要是蔗糖密度梯度離心法:將病毒樣品置于蔗糖密度梯度儀中離心,在離心力的作用下,樣品中的病毒顆粒沉降到相應(yīng)密度梯度層內(nèi),用紫外分光光度計(jì)(259 nm)檢測(cè)最高吸收峰(其他級(jí)份層上沒有吸收峰),收集146S吸收峰級(jí)份,對(duì)146S含量進(jìn)行定量[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 排渣時(shí)間

隨著離心時(shí)間的增加,料液損失量相應(yīng)降低。離心時(shí)間設(shè)定在20 min時(shí)料液損失相對(duì)較少(見表1)。

2.2 排渣濁度

隨著濁度的增加,料液損失量相應(yīng)降低。濁度設(shè)定在50 NTU時(shí)料液損失相對(duì)較少(見表2)。

2.3 損失料液的146S含量

用蔗糖密度梯度離心法檢測(cè)生產(chǎn)過程中病毒146S的收獲量及離心過程中損失料液的146S含量。D230610號(hào)樣品(離心時(shí)間20 min、濁度50 NTU)的料液損失量及146S含量相對(duì)較少(見表3)。

3 討論

3.1通過對(duì)固定時(shí)間排渣的統(tǒng)計(jì)分析,排渣時(shí)間過短、次數(shù)過頻會(huì)造成合格料液及其有效成分大量浪費(fèi);而排渣時(shí)間過長(zhǎng)、次數(shù)過少則料液濁度較高,影響料液品質(zhì)。收集離心樣的體積排渣時(shí)間為10 min時(shí)料液損失量最大,收集到的離心樣體積最小;排渣時(shí)間為20 min時(shí)收集到的離心樣體積及離心濁度最佳。排渣時(shí)間為30 min時(shí)料液損失量最小,收集到的離心樣體積最大。排渣時(shí)間設(shè)定較長(zhǎng),離心機(jī)腔體渣液過多,渣液反流到離心樣里,收集到的離心樣體積增多,但是離心樣的濁度增高,給下游抗原濃縮純化工藝生產(chǎn)增加了處理難度,造成料液有效成分損失和生產(chǎn)成本上升,因此排渣時(shí)間設(shè)定為 30 min 不符合生產(chǎn)工藝要求。

3.2通過使用在線濁度儀根據(jù)下游工藝要求的料液濁度進(jìn)行排渣分析,排渣濁度過小會(huì)造成合格料液及其有效成分的大量浪費(fèi),排渣濁度過高則直接影響料液品質(zhì)。收集離心樣體積排渣濁度在30 NTU時(shí)排渣較頻繁,料液損失最大;排渣濁度在80 NTU時(shí)排渣次數(shù)較少,料液損失最小;排渣濁度在50 NTU時(shí)排渣次數(shù)及料液品質(zhì)較穩(wěn)定。排渣濁度在30 NTU時(shí)收集到的離心樣濁度較低,但由于排渣次數(shù)過于頻繁,病毒液中大量146S在離心排渣過程中隨渣液一同被排出,造成生產(chǎn)成本大幅上升;同時(shí)由于離心樣濁度過低,在下游抗原的濃縮純化工藝過程中會(huì)降低攔截效率,增加抗原濃縮純化難度,因此排渣濁度設(shè)定為30 NTU 不符合生產(chǎn)工藝要求。

4 結(jié)論

綜合分析比較,在Re-A/WH/09病毒液離心過程中排渣時(shí)間設(shè)定為20 min,排渣濁度在50 NTU時(shí)得到的離心樣體積及濁度最佳,批間差最小,完整病毒顆粒(146S)的回收率最高,可降低生產(chǎn)成本,為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高效的口蹄疫疫苗奠定基礎(chǔ)。