尹波 黃海 劉勇 張金紅 李俊 吳灃

肺癌是原發(fā)于氣管、支氣管和肺的惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率正迅速上升,且呈世界性趨勢(shì)[1-2]。此病發(fā)病隱匿,早期并無特異性癥狀,多數(shù)患者病情進(jìn)展至晚期才確診[3]。對(duì)于晚期肺癌患者,臨床常用根治術(shù)聯(lián)合術(shù)后化療進(jìn)行治療,但術(shù)后產(chǎn)生腫瘤耐藥嚴(yán)重影響化療效果,不利于患者預(yù)后[4]。和厚樸酚分離自中藥材厚樸,具有廣泛的抗腫瘤活性,對(duì)肝癌、肺癌、胃腸道腫瘤等多種腫瘤均有抑制作用[5-6]。還有研究[7]報(bào)道,和厚樸酚可增加傳統(tǒng)抗腫瘤藥物的抗腫瘤作用,如紫杉醇、順鉑、多柔比星等。Notch信號(hào)通路不僅在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及凋亡中發(fā)揮重要的作用,而且持續(xù)激活可使得腫瘤細(xì)胞獲得耐藥性[8]?；诖?本研究擬探究和厚樸酚對(duì)肺癌細(xì)胞紫杉醇耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及對(duì)Notch信號(hào)通路的影響,以期為提高肺癌治療效果提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、一般材料

1. 細(xì)胞株 紫杉醇耐藥的肺癌細(xì)胞株A549/Taxol,上皮細(xì)胞樣,貼壁生長(zhǎng),經(jīng)STR鑒定,購自武漢普諾賽公司。

2. 主要儀器 Synergy HT多功能酶標(biāo)儀購自美國伯騰公司;FACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

3. 藥品與試劑 和厚樸酚純度≥98%,購自成都徳思特公司;紫杉醇,國藥準(zhǔn)字H20057065,購自海南中化聯(lián)合制藥公司;1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司;MTT試劑、Annecin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司;c-核蛋白類基因(c-Myc)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、切割后半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、cleaved Caspase-9、E鈣黏附蛋白(E-cadherin)、N鈣黏附蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Notch1、Jagged1和Hes1抗體,購自美國Cell Signaling Technology公司。

二、方法

1. 細(xì)胞分組與處理 (1)以不同濃度和厚樸酚(0、10、20、30、40、50 μmol/L)聯(lián)合5 nmol/L紫杉醇[9]處理A549/Taxol細(xì)胞,篩選試驗(yàn)濃度。(2)將A450/Taxol細(xì)胞分為對(duì)照組(含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基正常培養(yǎng))、紫杉醇組(5 nmol/L 紫杉醇處理24 h)、和厚樸酚+紫杉醇組(試驗(yàn)濃度和厚樸酚+5 nmol/L紫杉醇處理24 h)和Notch信號(hào)通路激活劑組(Jagged1/FC)(試驗(yàn)濃度和厚樸酚+5 nmol/L紫杉醇+500 μg/L Jagged1/FC處理24 h)。

2. MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A450/Taxol細(xì)胞,以1×105個(gè)/孔接種于96孔板,按分組給予相應(yīng)處理24 h,再添加含有10%MTT試劑的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去上清液,加入100 μL二甲基亞砜溶液溶解,放入多功能酶標(biāo)儀,570 nm下測(cè)定各孔吸光度值,計(jì)算實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100%,表示細(xì)胞存活率。

3. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A450/Taxol細(xì)胞,以2×105個(gè)/孔接種于6孔板,按分組給予相應(yīng)處理24 h,收集各組細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS溶液洗滌3次,分別加入Annecin V-FITC、PI染液,暗室中反應(yīng)30 min,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀態(tài)。

4. 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A450/Taxol細(xì)胞,以2×105個(gè)/孔接種于6孔板,待細(xì)胞融合至80%左右時(shí),用1 mL槍頭垂直培養(yǎng)孔底部劃線,再按分組給予相應(yīng)處理24 h,光鏡下觀察并記錄劃痕寬度的變化,反映細(xì)胞遷移能力。

5. Western Blotting法檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A450/Taxol細(xì)胞,以2×105個(gè)/孔接種于6孔板,按分組給予相應(yīng)處理24 h,收集各組細(xì)胞,加入RIPA裂解液冰上反應(yīng)40 min,收集上清液測(cè)定蛋白濃度,上樣電泳后再電轉(zhuǎn),取出PVDF膜用5%脫脂牛奶液,室溫下封閉2 h,4℃下分別孵育c-Myc、Cyclin D1、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Notch1、Jagged1和Hes1抗體(1 ∶1 000)過夜,在37℃下孵育辣根標(biāo)記的山羊抗兔/鼠IgG二抗30 min,最后滴加ECL發(fā)光劑顯影,計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、不同濃度和厚樸酚對(duì)A450/Taxol細(xì)胞增殖的影響

與0 μmol/L和厚樸酚組比較,30 μmol/L和厚樸酚組處理后細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05);而5 nmol/L紫杉醇與20、30、40、50 μmol/L和厚樸酚聯(lián)用時(shí),細(xì)胞存活率較同組和厚樸酚組明顯降低(P<0.05),其中30 μmol/L和厚樸酚抑制效果最佳,選用此濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(見圖1)。

圖1 不同濃度和厚樸酚對(duì)A450/Taxol細(xì)胞增殖的影響

二、和厚樸酚聯(lián)合紫杉醇對(duì)A450/Taxol細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較,紫杉醇組細(xì)胞存活率降低,c-Myc、Cyclin D1表達(dá)下調(diào)(P<0.05);與紫杉醇組比較,和厚樸酚+紫杉醇組細(xì)胞存活率降低,c-Myc、Cyclin D1表達(dá)下調(diào)(P<0.05);與和厚樸酚+紫杉醇組比較,Jagged1/FC組細(xì)胞存活率升高,c-Myc、Cyclin D1表達(dá)上調(diào)(P<0.05,見圖2)。

圖2 和厚樸酚聯(lián)合紫杉醇對(duì)A450/Taxol細(xì)胞增殖的影響

三、和厚樸酚聯(lián)合紫杉醇對(duì)A450/Taxol細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較,紫杉醇組細(xì)胞凋亡率升高,cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9表達(dá)上調(diào)(P<0.05);與紫杉醇組比較,和厚樸酚+紫杉醇組細(xì)胞凋亡率升高,cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9表達(dá)上調(diào)(P<0.05);與和厚樸酚+紫杉醇組比較,Jagged1/FC組細(xì)胞凋亡率降低,cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9表達(dá)下調(diào)(P<0.05,見圖3)。

圖3 和厚樸酚聯(lián)合紫杉醇對(duì)A450/Taxol細(xì)胞凋亡的影響

四、和厚樸酚聯(lián)合紫杉醇對(duì)A450/Taxol細(xì)胞遷移的影響

與對(duì)照組比較,紫杉醇組細(xì)胞遷移能力降低,E-cadherin表達(dá)上調(diào),N-cadherin、Vimentin表達(dá)下調(diào)(P<0.05);與紫杉醇組比較,和厚樸酚+紫杉醇組細(xì)胞遷移能力降低,E-cadherin表達(dá)上調(diào),N-cadherin、Vimentin表達(dá)下調(diào)(P<0.05);與和厚樸酚+紫杉醇組比較,Jagged1/FC組細(xì)胞遷移能力升高,E-cadherin表達(dá)下調(diào),N-cadherin、Vimentin表達(dá)上調(diào)(P<0.05,見圖4)。

圖4 和厚樸酚聯(lián)合紫杉醇對(duì)A450/Taxol細(xì)胞遷移的影響

五、和厚樸酚聯(lián)合紫杉醇對(duì)A450/Taxol細(xì)胞Notch信號(hào)通路的影響

與對(duì)照組比較,紫杉醇組Notch1、Jagged1和Hes1表達(dá)下調(diào)(P<0.05);與紫杉醇組比較,和厚樸酚+紫杉醇組Notch1、Jagged1和Hes1表達(dá)下調(diào)(P<0.05);與和厚樸酚+紫杉醇組比較,Jagged1/FC組Notch1、Jagged1和Hes1表達(dá)上調(diào)(P<0.05,見圖5)。

圖5 和厚樸酚聯(lián)合紫杉醇對(duì)A450/Taxol細(xì)胞Notch信號(hào)通路的影響

討 論

紫杉醇是肺癌化療中的常用藥物,主要通過促進(jìn)微管蛋白聚合,維持微管蛋白的穩(wěn)定,抑制細(xì)胞有絲分裂,若出現(xiàn)耐藥性提示紫杉醇治療失敗[10]。因此,臨床亟需尋找可逆轉(zhuǎn)紫杉醇耐藥的方法,以提高療效,改善患者預(yù)后。

聯(lián)合用藥是惡性腫瘤治療的主要方式,生化調(diào)節(jié)劑通過作用于特定靶點(diǎn)或代謝環(huán)節(jié),增強(qiáng)抗腫瘤藥物療效或降低不良反應(yīng),而且可逆轉(zhuǎn)耐藥性[11]。已有研究[12]報(bào)道,和厚樸酚與紫杉醇聯(lián)用可發(fā)揮協(xié)同作用,誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌凋亡。但和厚樸酚對(duì)肺癌細(xì)胞紫杉醇耐藥是否可發(fā)揮逆轉(zhuǎn)作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示,和厚樸酚可促進(jìn)紫杉醇對(duì)耐藥細(xì)胞株A450/Taxol細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用,并誘導(dǎo)其凋亡,提示和厚樸酚對(duì)肺癌細(xì)胞紫杉醇耐藥具有逆轉(zhuǎn)作用,紫杉醇方案中加用和厚樸酚有望成為治療肺癌的新方法。

惡性腫瘤細(xì)胞具有增殖調(diào)控失調(diào)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性[13]。c-Myc是Myc基因家族的重要亞型之一,被激活后可啟動(dòng)細(xì)胞分裂增殖程序,其表達(dá)不足的情況下,細(xì)胞增殖將受到抑制;Cyclin D1也是促進(jìn)細(xì)胞增殖基因,可調(diào)控細(xì)胞從G1期向S期過渡[14-15]。細(xì)胞凋亡參與惡性腫瘤起始過程,并發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用,該過程受多種基因控制,細(xì)胞內(nèi)理化因素導(dǎo)致的DNA損傷等可降低線粒體膜電位,促進(jìn)細(xì)胞色素C轉(zhuǎn)入胞漿,活化Caspase-9,啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終活化Caspase-3,導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體[16]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腫瘤細(xì)胞遷移的重要機(jī)制,具體表現(xiàn)為:(1)E-cadherin等上皮細(xì)胞標(biāo)志物低表達(dá)或缺失,細(xì)胞骨架系統(tǒng)排列發(fā)生變化,細(xì)胞間黏附功能降低;(2)N-cadherin、Vimentin等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物高表達(dá),細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞特性,易向周圍組織侵襲或轉(zhuǎn)移[17]。本研究中,與紫杉醇組比較,和厚樸酚+紫杉醇組細(xì)胞c-Myc、Cyclin D1、N-cadherin、Vimentin表達(dá)下調(diào),cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、E-cadherin表達(dá)上調(diào),進(jìn)一步說明和厚樸酚可增強(qiáng)紫杉醇對(duì)A549/Taxol細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響。

Notch信號(hào)通路與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),近期研究表明,Notch信號(hào)通路還與腫瘤耐藥存在關(guān)聯(lián)性:Takahashi[18]等研究顯示,Notch信號(hào)通路參與非小細(xì)胞肺癌奧希替尼耐藥,添加Notch信號(hào)通路抑制劑后可在體內(nèi)外降低耐藥性。陳立松等[8]發(fā)現(xiàn),阻斷Notch信號(hào)通路可抑制肺腺癌細(xì)胞的侵襲能力,并降低其對(duì)順鉑的耐藥作用。Sun等[19]結(jié)果顯示,阻斷Notch信號(hào)通路可逆轉(zhuǎn)EMT表型,增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇治療的敏感性。本研究通過Western Blotting法檢測(cè)細(xì)胞中Notch信號(hào)通路蛋白Notch1、Jagged1和Hes1表達(dá),發(fā)現(xiàn)單用紫杉醇處理后A549/Taxol細(xì)胞中Notch1、Jagged1和Hes1表達(dá)降低,與和厚樸酚聯(lián)用后Notch1、Jagged1和Hes1表達(dá)進(jìn)一步降低,但添加Notch信號(hào)通路激活劑Jagged1/FC后可逆轉(zhuǎn)和厚樸酚的作用,表明和厚樸酚是通過抑制Notch信號(hào)通路的過度活化,逆轉(zhuǎn)A549/Taxol細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥作用。

綜上所述,和厚樸酚可能抑制紫杉醇耐藥肺癌細(xì)胞中Notch信號(hào)通路過度活化,增強(qiáng)紫杉醇對(duì)A549/Taxol細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用,以及對(duì)凋亡的促進(jìn)作用。但和厚樸酚對(duì)紫杉醇耐藥的逆轉(zhuǎn)作用是否還存在其他分子途徑以及體內(nèi)療效如何,還有待深入分析。