侯 軒,王 彬,劉愛(ài)軍,黃曉兵,柴 娟,張航俊,陸春波

(浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,杭州 310000)

隨著物質(zhì)生活水平的逐漸提高,人們對(duì)食品質(zhì)量安全也越來(lái)越重視,其中畜產(chǎn)品獸藥殘留問(wèn)題受到了社會(huì)各界的關(guān)注。雞蛋作為一種重要的動(dòng)物性食品,能夠?yàn)槿藗兲峁┐罅康牡鞍踪|(zhì)以及各種維生素[1],在人們?nèi)粘ｏ嬍持姓加兄匾牡匚?。在蛋雞養(yǎng)殖過(guò)程中,抗生素作為一類天然、半合成或人工合成的化合物,因其具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、減少疾病發(fā)生率、提高飼料利用率等優(yōu)點(diǎn)而廣泛使用[2],但若其使用不當(dāng)則會(huì)造成雞蛋抗生素殘留超標(biāo)。抗生素殘留通過(guò)食物鏈富集進(jìn)入人體后,會(huì)危害人類健康。目前我國(guó)已制定了一系列獸藥限量標(biāo)準(zhǔn)[3-4],對(duì)其用于畜禽動(dòng)物的養(yǎng)殖加以限制或禁止,但獸藥品種繁多,如何同時(shí)快速甄別與確證雞蛋中多種抗生素殘留,保障消費(fèi)者健康安全顯得意義重大。因此,針對(duì)雞蛋建立一套高通量、高靈敏度、快速準(zhǔn)確的獸藥多殘留測(cè)定方法具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

目前,動(dòng)物源性食品中抗生素檢測(cè)方法主要有免疫分析法[5-6]、高效液相色譜法[7-8]、氣相-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-10]、液相-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-13]等。其中,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS / MS)因其具有高通量、高靈敏度、抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn),越來(lái)越多地被廣泛應(yīng)用于食品中獸藥殘留的檢測(cè),但LC-MS / MS受限于其掃描速率及分辨率,對(duì)于同時(shí)測(cè)定多組分獸藥分析的效果不佳。飛行時(shí)間質(zhì)譜作為一類高分辨質(zhì)譜,由于具有更快的掃描速率和更高的分辨率[14-16],在抗基質(zhì)干擾能力方面表現(xiàn)更強(qiáng),可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)數(shù)百種化合物的快速篩查和分析,進(jìn)一步提高檢驗(yàn)效率。

本研究擬采用通過(guò)式固相萃取樣品前處理技術(shù),該技術(shù)可同時(shí)減少雞蛋中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、色素等雜質(zhì)干擾,有效降低基質(zhì)效應(yīng),還可免除活化與平衡步驟,減少前處理時(shí)間與成本,適合多組分檢測(cè)時(shí)大規(guī)模樣品的凈化。同時(shí)結(jié)合高分辨質(zhì)譜檢測(cè)的優(yōu)勢(shì),可對(duì)8大類62種獸藥化合物進(jìn)行同時(shí)測(cè)定,建立一套快速準(zhǔn)確的篩查確證分析方法。本方法具有簡(jiǎn)便快捷、覆蓋目標(biāo)物范圍廣、通量高且準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn),適用于大批量雞蛋中痕量獸藥多殘留的快速篩查與確證分析。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材 甲醇、乙腈(色譜純,Mecrk公司);甲酸、乙酸銨(色譜純,阿拉丁公司);PRiME HLB 固相萃取小柱(200 mg/6 mL,Waters 公司);聚四氟乙烯針式濾膜(0.22 μm,Green Mall公司)等。

62種獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(喹諾酮類13種、磺胺類21種、大環(huán)內(nèi)酯類10種、硝基咪唑類6種、酰胺醇類3種、硝基呋喃類4種、喹噁啉類4種、林可胺類1種)分別購(gòu)于德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司、美國(guó)Sigma公司和中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器與設(shè)備 Agilent 1290-6550高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(配雙噴霧器電噴霧源),美國(guó)Agilent公司;Agilent MassHunter軟件工作站,美國(guó)Agilent公司;XS205分析天平,美國(guó)Mettler Toledo公司;KQ-500E超聲儀,昆山市超聲儀有限公司等。

1.3 樣品前處理 稱取已均質(zhì)的雞蛋樣品2±0.02 g于50 mL離心管中,準(zhǔn)確加入10 mL甲酸乙腈溶液(甲酸、乙腈、水體積比為0.1∶90∶10),渦旋振蕩提取1 min,超聲提取10 min,10000 r/min離心5 min,收集全部上層提取液過(guò)PRiME HLB固相萃取柱,收集濾液,準(zhǔn)確吸取5 mL 濾液于另一帶刻度離心管中,40 ℃氮?dú)獯抵? mL以下,殘?jiān)?.2%甲酸水定容至1.0 mL,過(guò)0.22 μm 濾膜后,供 HPLC-QTOF測(cè)定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 采用Waters ACQUITY T3,1.7 μm,100 mm×2.1 mm色譜柱,柱溫25 ℃,進(jìn)樣量2 μL,流動(dòng)相條件見(jiàn)表1。

表1 HPLC-QTOF流動(dòng)相條件Tab 1 HPLC-QTOF Mobile Phase Conditions

1.4.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜采用Dual AJS ESI源,掃描方式為正離子、負(fù)離子全掃描。電離源溫度120 ℃,毛細(xì)管電壓3000 V,噴嘴電壓200 V,干燥器溫度250 ℃,鞘氣溫度320 ℃。一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集為全掃描模式,掃描范圍:m/z100～1 000 Da,采集速率為1.5 spectra/s。二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集為目標(biāo)離子采集模式,碰撞能量為 10、20和40 eV,掃描范圍:m/z50～1000 Da,采集速率為2.5 spectra/s。采集數(shù)據(jù)的同時(shí)連續(xù)導(dǎo)入?yún)⒈热芤?對(duì)儀器質(zhì)量軸進(jìn)行實(shí)時(shí)校正,參比離子為m/z121.0509和m/z922.0098。62種化合物質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 62種化合物測(cè)定信息Tab 2 Determination Information of 62 Compounds

1.4.3 高分辨質(zhì)譜庫(kù)的建立 針對(duì)62種待測(cè)化合物,在Agilent MassHunter軟件工作站項(xiàng)下的譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)軟件(PCDL)中錄入各化合物的中文名稱、CAS號(hào)、分子式等基本信息;采用本研究建立的液相、質(zhì)譜條件對(duì)62種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定,得到各化合物的保留時(shí)間、母離子精確質(zhì)量數(shù)、子離子特征圖譜等信息,將所有信息導(dǎo)入PCDL中,建立62種化合物高分辨質(zhì)譜譜庫(kù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化 考察了流動(dòng)相組分、比例對(duì)待測(cè)化合物測(cè)定的影響。本研究流動(dòng)相A為含5 mmol/L乙酸銨的0.2%甲酸水溶液,B相為含5 mmol/L乙酸銨的0.2%甲酸甲醇溶液,分別采用0.1%和0.2%甲酸添加量進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)0.2%的甲酸水乙酸銨溶液和甲酸甲醇溶液做流動(dòng)相所得化合物的峰型更好。由于此方法篩選的化合物種類較多,各種藥物的極性強(qiáng)弱、在色譜柱上保留強(qiáng)度以及洗脫的時(shí)間長(zhǎng)短均不相同,若使用等度洗脫的方法無(wú)法得到非常理想的峰形,因此本研究選擇梯度洗脫,具體色譜條件見(jiàn)表1。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 配制濃度為20 ng/mL的62種化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,優(yōu)化最佳的電離源溫度、毛細(xì)管電壓、鞘氣溫度、干燥器溫度等質(zhì)譜條件,用HPLC-Q-TOF測(cè)定。采用MS全掃描模式采集各化合物的一級(jí)質(zhì)譜信息,Target-MS/MS模式采集二級(jí)質(zhì)譜信息,確定了62種化合物的實(shí)測(cè)母離子精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間、特征子離子精確質(zhì)量數(shù)等質(zhì)譜參數(shù),具體見(jiàn)表2。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)考察 雞蛋脂類、蛋白豐富,在化合物質(zhì)譜分析中可能出現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)的情況。對(duì)62種化合物在雞蛋中基質(zhì)效應(yīng)情況進(jìn)行了考察。其中,酰胺醇類、喹噁啉類藥物表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確,本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線以消除或減弱基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量分析結(jié)果的影響。

2.4 定量方法確定 為獲得準(zhǔn)確可靠的定量結(jié)果,待測(cè)樣品采取全掃描模式(FULL-MS)進(jìn)行初步篩查后,疑似陽(yáng)性樣品采取目標(biāo)離子模式(Target-MS)進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集,該模式利用三重四極桿對(duì)目標(biāo)化合物的母離子進(jìn)行選擇與裂解,確保掃描速率與掃描時(shí)間的同時(shí),可有效減少雜質(zhì)干擾、提高檢測(cè)靈敏度,保證定量結(jié)果準(zhǔn)確。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限 按1.3項(xiàng)處理空白樣品后,采用雞蛋空白提取液配制 62種化合物的標(biāo)準(zhǔn)工作液,供HPLC-QTOF檢測(cè)。以目標(biāo)化合物色譜峰面積及其對(duì)應(yīng)化合物濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得待測(cè)物質(zhì)的線性回歸方程,取信噪比S/N=3的樣品濃度為方法檢出限(LOD),取信噪比S/N=10 的樣品濃度為方法定量限(LOQ)。62種化合物濃度在 0.5 ～500 ng /mL 范圍內(nèi),雞蛋中 62 種化合物的線性關(guān)系良好(r2≥0.99),方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別在 1.0～ 2.0 μg / kg 和 2.0 ～5.0 μg / kg 范圍內(nèi),均滿足檢測(cè)需求。

2.6 方法的回收率、精密度 分別在各化合物定量限、2倍定量限及10倍定量限濃度添加水平下進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn),每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行,重復(fù)3次。計(jì)算添加回收率及變異系數(shù),結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 雞蛋中62種化合物的回收率(n=5)Tab 3 Recovery rates of 62 compounds in eggs (n=5)

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè) 應(yīng)用建立的分析方法,對(duì)浙江省內(nèi)市面上售賣的150份雞蛋樣品進(jìn)行測(cè)定,其中1批次雞蛋檢出恩諾沙星,含量為5.3 μg/kg。該檢測(cè)結(jié)果表明,本方法能滿足對(duì)雞蛋中62種化合物有效監(jiān)控的需要。

3 討論與小結(jié)

3.1 液相條件的優(yōu)化 因待檢化合物存在同分異構(gòu)體,僅靠質(zhì)譜分析很難將所有化合物有效定性,故對(duì)液相條件進(jìn)行了優(yōu)化。一是考察了流動(dòng)相組成對(duì)化合物靈敏度和離子化效率的影響,發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相中添加0.1%甲酸及5 mmol/L乙酸銨,可以有效提高化合物在正離子和負(fù)離子模式下的離子化效率,提高靈敏度。二是對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行了考察,發(fā)現(xiàn)采用梯度洗脫能保證待測(cè)化合物的有效分離。如待測(cè)化合物磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶為同分異構(gòu)體,分子式為C11H12N4O3S,采取1.4.1項(xiàng)液相條件進(jìn)行分析,保留時(shí)間分別為8.94、9.29、10.16 min,得到有效分離,進(jìn)一步保證化合物定性的準(zhǔn)確,具體見(jiàn)圖1。

圖1 磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 ng/mL)Fig 1 Sulfameter, Sulfamethoxypyridazine and sulfamethoxypyrimidine Standard solution(10 ng/mL)

3.2 提取條件的優(yōu)化 本研究對(duì)純乙腈、乙腈:水:甲酸(90∶10∶0.1,V/V/V)、乙腈:水:甲酸(80∶20∶0.1,V/V/V)3種提取劑進(jìn)行了考察。3種提取劑對(duì)8大類62種獸藥的提取效果,見(jiàn)圖2。結(jié)果表明,乙腈-水體系提取效率明顯高于純乙腈,可能是乙腈乙腈-水體系有效沉淀蛋白的同時(shí),還具有更強(qiáng)的滲透力,可有效提取基質(zhì)中的待測(cè)化合物;90% 甲酸乙腈水溶液提取效果與80%甲酸乙腈水溶液提取效果差別不大,但提取液過(guò)Prime HLB小柱后還需氮吹,考慮到氮吹效果,減少氮吹時(shí)間,選擇乙腈:水:甲酸(90∶10∶0.1,V/V/V)作為提取液。

圖2 不同提取液提取效率(添加濃度為 10 μg/kg)Fig 2 Extraction efficiency of different extraction solutions (added concentration of 10 μg/kg)

本研究采用通過(guò)式固相萃取與高分辨質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合的檢測(cè)方式,建立了同時(shí)測(cè)定雞蛋中62種獸藥殘留的分析方法,并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證,回收率在71.2%～113%之間,日內(nèi)變異系數(shù)范圍為1.3%～14.3%,日間變異系數(shù)范圍為4.2%～18.3%,檢測(cè)限為1.0～2.0 μg/kg,定量限為2.0～5.0 μg/kg。本方法操作簡(jiǎn)便,靈敏度高,適用于大批量雞蛋中痕量獸藥多殘留的快速測(cè)定。