張靜月，董鵬程，左惠心，梁榮蓉，毛衍偉，張一敏，楊嘯吟，羅 欣，朱立賢

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，國(guó)家牛肉加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，山東 泰安 271018）

肌纖維是肌肉組織的基本結(jié)構(gòu)單位，肌纖維的組成類型對(duì)畜禽肉品質(zhì)產(chǎn)生重要影響[1]。根據(jù)所含肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MyHC）類型的不同，將肌纖維分為4 類：慢速氧化型（MyHC I）、快速氧化型（MyHC IIa）、快速糖酵解型（MyHC IIb）和中間型（MyHC IIx）[1]。I型肌纖維中線粒體含量豐富，肌紅蛋白含量和有氧代謝相關(guān)酶活性高，ATP酶活性低，收縮速率慢且持久；IIa型肌纖維中糖原含量高并含有一定數(shù)量的肌紅蛋白；IIb型肌纖維中線粒體含量少，糖原含量高，糖酵解相關(guān)酶活性高，三磷酸腺苷（adenosine 5’-triphosphate，ATP）酶活性高，收縮速率短且快；IIx型肌纖維中線粒體含量、肌紅蛋白含量以及代謝和收縮特征介于IIa和IIb之間[2-3]。不同的肌纖維類型之間可以相互轉(zhuǎn)化，肌纖維類型可以由糖酵解型轉(zhuǎn)化為氧化型，也可以由氧化型轉(zhuǎn)化為糖酵解型。肌纖維的數(shù)目在動(dòng)物胚胎期已基本固定，而肌纖維類型轉(zhuǎn)化伴隨整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期。外部環(huán)境刺激、能量代謝水平和營(yíng)養(yǎng)等都會(huì)對(duì)肌纖維類型轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響[4-5]。

白藜蘆醇是一種天然多酚物質(zhì)，廣泛存在于虎杖、花生和葡萄等植物中[6]。白藜蘆醇具有廣泛的生物活性，例如預(yù)防肥胖、治療糖尿病、抗炎抗氧化等[7]。白藜蘆醇作為畜禽飼料添加劑，可以提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能以及改善肉品質(zhì)[8]。線粒體在細(xì)胞能量代謝和信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用[9]。線粒體生物發(fā)生是線粒體的一種自我更新途徑，新的線粒體從已存在的線粒體中產(chǎn)生，即線粒體基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯[10]。線粒體生物發(fā)生是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目和功能具有重要作用[11]。骨骼肌纖維中含有大量的線粒體，肌纖維的生長(zhǎng)發(fā)育伴隨著線粒體的生物發(fā)生。鄒彬[12]研究發(fā)現(xiàn)電刺激會(huì)降低線粒體生物發(fā)生程度，同時(shí)使I型肌纖維比例降低，II型肌纖維比例增加。線粒體功能障礙時(shí)，骨骼肌中慢肌纖維的比例減少，快肌纖維的比例增加，證明了線粒體能夠驅(qū)動(dòng)肌纖維類型轉(zhuǎn)化[13]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）可以通過去乙酰化激活過氧化物酶體增殖物，激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptorgamma coactivator-1α，PGC-1α），PGC-1α進(jìn)而激活一系列核基因編碼的線粒體蛋白，從而調(diào)控線粒體生物發(fā)生[14]。Li Yongguang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以激活大鼠心肌細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)，同時(shí)PGC-1α和核呼吸因子的表達(dá)增強(qiáng)，線粒體蛋白含量增加。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)在肉牛日糧中添加白藜蘆醇（5 g/頭）能夠促進(jìn)肌纖維類型由II型轉(zhuǎn)化為I型，并改善牛肉品質(zhì)，但其機(jī)制仍不明確[16]，推測(cè)白藜蘆醇可能通過SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路促進(jìn)線粒體生物發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)牛肌管細(xì)胞肌纖維類型轉(zhuǎn)化。因此，本研究以牛肌管細(xì)胞為研究對(duì)象，通過測(cè)定肌纖維類型、相關(guān)代謝酶活力以及線粒體生物發(fā)生中關(guān)鍵分子表達(dá)量，研究白藜蘆醇對(duì)牛肌管細(xì)胞肌纖維類型轉(zhuǎn)化的影響；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步添加SIRT1抑制劑6-氯-2,3,4,9-四氫-1H-咔唑-1-甲酰胺（1H-carbazole-1-carboxam，EX527），觀察其對(duì)肌纖維類型轉(zhuǎn)化以及線粒體生物發(fā)生中關(guān)鍵分子表達(dá)量的影響，從而分析白藜蘆醇調(diào)控牛肌管細(xì)胞肌纖維類型轉(zhuǎn)化的內(nèi)在機(jī)理，為改善牛肉品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛成肌細(xì)胞 上海一研生物科技有限公司；胰蛋白酶、最低必需培養(yǎng)基（minimum essential medium，MEM）、雙抗（青霉素-鏈霉素）、馬血清、噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）北京索萊寶公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）以色列Biological Industries公司；白藜蘆醇（純度≥98%）美國(guó)MedChemexpress生物科技公司；EX527 美國(guó)Selleck生物科技有限公司；琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）、蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）試劑盒 南京建成生物工程研究所；DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 北京艾科瑞公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒 江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；RIPA細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluorid，PMSF）、磷酸酶抑制劑、抗熒光猝滅封片液（含DAPI）上海碧云天生物技術(shù)公司；slow MyHC抗體（M8421）、fast MyHC抗體（M4276）美國(guó)Sigma公司；SIRT1抗體（8069）、PGC-1α抗體（2178）、核呼吸因子（nucleus respiratory factors，NRF）-1抗體（46743）、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）抗體（8076）美國(guó)Cell Signaling Technology公司；羊抗兔lgG、兔抗鼠lgG、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（ab8245）英國(guó)Abcam公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CFX 96實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、1658029電泳儀、ChemiDoc MP凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；3111 CO2培養(yǎng)箱美國(guó)Thermo公司；Epoch2酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；5840R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)ClemensBio Gmb公司；IX73P1F倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司；VCX130超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技有限公司；TU-1901紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞培養(yǎng)于10% FBS和1%雙抗的MEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%左右時(shí)開始傳代，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTT法測(cè)定白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞活力的影響

將細(xì)胞接種于96 孔板中，誘導(dǎo)分化2 d后向培養(yǎng)板中加入含不同濃度白藜蘆醇（10、20、30 μmol/L和40 μmol/L）的分化培養(yǎng)基（2%馬血清＋98% MEM）。設(shè)置不含白藜蘆醇的培養(yǎng)基為對(duì)照組，每個(gè)濃度設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后加入含0.5 mg/mL MTT的培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h，棄掉上清液后加入100 μL二甲基亞砜，避光振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD570nm，細(xì)胞活力根據(jù)下式計(jì)算：

式中：A0為細(xì)胞背景孔的吸光度；A1為白藜蘆醇處理孔的吸光度；A2為空白對(duì)照孔的吸光度。

1.3.3 白藜蘆醇對(duì)牛肌管細(xì)胞的處理

當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%左右時(shí)，按照1×104個(gè)/孔布板，用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)并將孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，棄掉原來的培養(yǎng)基，用PBS清洗后更換含馬血清的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化。誘導(dǎo)分化2 d后更換含有不同濃度白藜蘆醇（0、10、20 μmol/L和30 μmol/L）的分化培養(yǎng)基，每2 d更換一次培養(yǎng)基，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，分化5 d，收集細(xì)胞樣品用于測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。為明確白藜蘆醇是否通過SIRT1影響牛肌管細(xì)胞肌纖維類型轉(zhuǎn)化，添加SIRT1抑制劑EX527（10 μmol/L）處理細(xì)胞24 h后，更換含或者不含白藜蘆醇（10 μmol/L）的分化培養(yǎng)基，分化5 d后收集細(xì)胞樣品用于測(cè)定相關(guān)指標(biāo)（n＝6）。

1.3.4 mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

1.3.4.1 總RNA提取及引物序列

將細(xì)胞板中的液體棄掉，用PBS收集培養(yǎng)好的細(xì)胞，按照試劑說明書提取總RNA，核酸蛋白分析儀檢測(cè)所提取RNA的濃度和純度，所有樣品的OD260nm/280nm均在1.8～2.0之間。按照反轉(zhuǎn)錄試劑說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。表1為實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR）引物序列，由湖南艾科瑞生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。

表1 real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

1.3.4.2 real-time PCR

以cDNA為模板，采用SYBR法對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增。熒光定量反應(yīng)體系20 μL：2×SYBR?Green ProTaqHS Premix 10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物各0.4 μL，無核酸ddH2O 7.2 μL。real-time PCR條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)40 次；65 ℃ 5 s，5 s一循環(huán)，每個(gè)循環(huán)升溫0.5 ℃，直到95 ℃。用2－ΔΔCT計(jì)算各基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因作為內(nèi)參。

1.3.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)

處理好的細(xì)胞中加入RIPA細(xì)胞裂解液（含1 mmol/L PMSF），冰上裂解20 min，4 ℃、12000×g離心后取上清液，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入適量的蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性10 min。取適量樣品上樣，經(jīng)SDSPAGE分離，使用0.45 μm PVDF膜濕轉(zhuǎn)，用5%脫脂奶粉封閉1.5 h，4 ℃冰箱孵育對(duì)應(yīng)的一抗過夜，第二天孵育對(duì)應(yīng)的二抗1.5 h，用化學(xué)發(fā)光顯影液顯影，用Image Lab軟件分析條帶灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.6 代謝酶活性的測(cè)定

使用超聲波細(xì)胞破碎儀將收集的細(xì)胞破碎，按照試劑盒說明書對(duì)牛肌管中的SDH、LDH和MDH活性進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 細(xì)胞免疫熒光

24 孔板中細(xì)胞用PBS沖洗3 次后加入500 μL的4%多聚甲醛溶液，室溫固定10 min，結(jié)束后用PBS沖洗3 次。用含0.2%曲拉通X-100的PBS通透10 min，PBS洗3 次。用含5%牛血清白蛋白封閉液室溫封閉1.5 h。用抗體稀釋液稀釋抗體，室溫孵育1.5 h，結(jié)束后PBS洗3 次。避光室溫孵育二抗1 h，PBS洗3 次。滴加抗熒光猝滅劑（含DAPI），孵育10 min后于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，多組間的比較采用單因素方差分析（ANOVA）和最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）進(jìn)行多重比較，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以表示，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇對(duì)牛成肌細(xì)胞活力的影響

如圖1所示，隨著白藜蘆醇濃度的增加，牛成肌細(xì)胞活力逐漸降低。在0～40 μmol/L濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率均大于80%，表明其對(duì)牛成肌細(xì)胞增殖沒有明顯影響，無細(xì)胞毒性。在0～40 μmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著白藜蘆醇濃度增加，牛成肌細(xì)胞活力與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05），當(dāng)白藜蘆醇濃度達(dá)到40 μmol/L時(shí)，與對(duì)照組（0 μmol/L）相比，其活力顯著降低（P＜0.05），故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用0～30 μmol/L白藜蘆醇處理細(xì)胞。

圖1 不同濃度白藜蘆醇處理對(duì)牛成肌細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of resveratrol at different concentrations on cell viability of bovine myotube

2.2 白藜蘆醇對(duì)牛肌管細(xì)胞分化的影響

為研究白藜蘆醇對(duì)牛肌管細(xì)胞分化的影響，用含0、10、20 μmol/L和30 μmol/L白藜蘆醇的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)牛成肌細(xì)胞分化。在細(xì)胞發(fā)育過程中存在控制原始干細(xì)胞向成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的調(diào)控因子，這些調(diào)控因子被稱為成肌決定因子。生肌調(diào)節(jié)因子（myogenic regulatory factors，MRFs）家族包括成肌分化抗原（myogenic differentiation，MyoD）、生肌因子5（myogenic factor 5，Myf5）、MRF4（或Myf6）和肌細(xì)胞生成素（myogenin，MyoG）這4 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，具有將非成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有成肌細(xì)胞特性并能融合形成肌管細(xì)胞的能力[17]。MyoD和Myf5是細(xì)胞進(jìn)入成肌細(xì)胞系的起始，構(gòu)成肌肉細(xì)胞決定和分化的調(diào)控核心；Myf6和MyoG對(duì)于成肌細(xì)胞正常分化以及MyHC的表達(dá)具有重要作用[18]。

由圖2可知，白藜蘆醇能顯著增加Myf5、Myf6和MyoGmRNA表達(dá)水平（P＜0.05），10 μmol/L白藜蘆醇顯著增加MyoDmRNA表達(dá)水平（P＜0.05），因此，后續(xù)采用10 μmol/L的白藜蘆醇處理細(xì)胞。白藜蘆醇是一種促分化劑，有研究表明白藜蘆醇具有促進(jìn)造血干細(xì)胞、癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分化的作用[19]。曹君等[20]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇促進(jìn)C2C12成肌細(xì)胞分化，上調(diào)肌肉分化的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，并增加肌球蛋白的表達(dá)。Montesano等[21]研究發(fā)現(xiàn)在小鼠成肌細(xì)胞中添加白藜蘆醇后，早期肌形成階段的重要標(biāo)志物Myf5和MyoD蛋白表達(dá)水平顯著增加。以上結(jié)果與本研究類似，說明白藜蘆醇能夠促進(jìn)牛肌管細(xì)胞分化。

圖2 不同濃度白藜蘆醇處理對(duì)牛肌管細(xì)胞生肌調(diào)節(jié)因子相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)水平的影響Fig.2 Effect of resveratrol at different concentrations on the relative gene expression level of myogenic regulatory factor in bovine myotube

2.3 白藜蘆醇對(duì)牛肌管細(xì)胞肌纖維類型的影響

為研究白藜蘆醇對(duì)肌纖維類型的影響，本實(shí)驗(yàn)采用real-time PCR和蛋白免疫印跡法檢測(cè)10 μmol/L白藜蘆醇處理后牛肌管細(xì)胞中肌纖維類型相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)量。由圖3可知，與對(duì)照組相比，白藜蘆醇顯著增加了MyHC I和MyHC IIamRNA的表達(dá)（P＜0.05），降低了MyHC IIx和MyHC IIbmRNA的表達(dá)（P＜0.05）。由圖4 可知，白藜蘆醇顯著上調(diào)了慢肌纖維蛋白（slow MyHC）表達(dá)（P＜0.05），下調(diào)了快肌纖維蛋白（fast MyHC）表達(dá)（P＜0.05）。進(jìn)一步用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)牛肌管中不同肌纖維類型的數(shù)量，熒光染色面積越大，說明肌纖維數(shù)量越多，由圖5可知，與對(duì)照組相比，白藜蘆醇顯著增加了牛肌管細(xì)胞中慢肌纖維的數(shù)量，同時(shí)減少了快肌纖維的數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)室之前研究發(fā)現(xiàn)，在肉牛日糧中添加白藜蘆醇顯著提高牛肉中氧化型肌纖維的比例[16]，與本研究結(jié)果一致。Wen Wanxue等[22]研究發(fā)現(xiàn)在C2C12細(xì)胞中，白藜蘆醇增加了慢肌纖維蛋白表達(dá)以及MyHC I和MyHC IIa氧化型肌纖維基因的表達(dá)，降低了快肌纖維蛋白表達(dá)以及MyHC IIx和MyHC IIb糖酵解型肌纖維基因的表達(dá)。在豬肌管細(xì)胞中也得到類似的結(jié)果，白藜蘆醇增加了慢肌纖維蛋白的表達(dá)，降低了快肌纖維蛋白的表達(dá)[23]，上述結(jié)果與本研究相似，表明添加白藜蘆醇促進(jìn)牛肌管肌纖維類型由快肌向慢肌轉(zhuǎn)化。

圖3 白藜蘆醇對(duì)牛肌管細(xì)胞中MyHC基因相對(duì)表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of resveratrol on the relative gene expression level of MyHC in bovine myotube

圖4 白藜蘆醇對(duì)牛成肌細(xì)胞中快肌和慢肌蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of resveratrol on protein expression of slow and fast MyHC in bovine myotube

圖5 白藜蘆醇對(duì)牛肌管細(xì)胞中快慢肌表達(dá)的影響Fig.5 Effect of resveratrol on the expression of fast and slow MyHC in bovine myotube

2.4 白藜蘆醇對(duì)牛肌管細(xì)胞代謝酶活性的影響

肌纖維類型不同其能量代謝特征也不同，氧化型肌纖維中含有豐富的線粒體和氧化代謝酶，具有較強(qiáng)的氧化能力，主要依靠有氧代謝途徑供能；糖酵解型肌纖維中線粒體和氧化代謝酶少，含有大量的酵解相關(guān)酶，主要依靠糖酵解方式供能。LDH催化糖酵解產(chǎn)生乳酸，可以反映細(xì)胞內(nèi)無氧酵解的活躍度[24]。MDH存在于線粒體上，參與三羧酸循環(huán)，是合成蘋果酸的關(guān)鍵酶[25]。SDH與其他參與三羧酸循環(huán)的酶類不同，是結(jié)合到線粒體內(nèi)膜上的酶，可為真核細(xì)胞線粒體呼吸鏈提供電子[26]。SDH和MDH均為三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶，其活性在一定程度上反映了肌肉中有氧代謝的水平，與肌纖維類型組成存在一定的關(guān)系[27]。由表2可知，白藜蘆醇顯著降低了LDH活性（P＜0.05），顯著提高了SDH和MDH活性（P＜0.05）。該結(jié)果說明白藜蘆醇能夠提高氧化代謝水平，這與添加白藜蘆醇后氧化型肌纖維比例升高，糖酵解型肌纖維比例下降的結(jié)果一致。溫萬(wàn)雪[27]研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素增加了C2C12肌細(xì)胞中慢肌纖維的比例，同時(shí)增加了SDH和MDH活性，降低了LDH活性，這與本研究結(jié)果相似。多酚化合物可以增加慢肌纖維比例，具體表現(xiàn)為多酚類物質(zhì)能夠顯著增加慢肌纖維蛋白表達(dá)水平，增加SDH活性，同時(shí)降低LDH活性[28-29]。

表2 白藜蘆醇對(duì)牛肌管細(xì)胞中代謝酶活性的影響Table 2 Effect of resveratrol on metabolic enzyme activities of bovine myotube

2.5 白藜蘆醇對(duì)牛肌管細(xì)胞線粒體生物發(fā)生的影響

線粒體生物發(fā)生過程極其復(fù)雜，線粒體是半自主遺傳細(xì)胞器，其生物發(fā)生受線粒體DNA和核DNA的共同調(diào)控[10]。SIRT1/PGC-1α是調(diào)控線粒體生物發(fā)生的重要信號(hào)通路之一。SIRT1是NAD＋依賴性去乙酰酶，作為PGC-1α的上游信號(hào)分子可以誘導(dǎo)激活PGC-1α，從而增加線粒體相關(guān)基因的表達(dá)。小鼠敲除SIRT1基因后肌肉中線粒體含量減少，線粒體功能受到影響[30]。PGC-1α是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，PGC-1α直接激活其下游參與線粒體生物發(fā)生的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，包括NRFs、TFAM和過氧化物酶體增殖劑激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）[14]。在特異性敲除PGC-1α基因的小鼠中發(fā)現(xiàn)線粒體體積減小，線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)下降，影響了線粒體生物發(fā)生[31]。因此，本研究對(duì)SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路以及線粒體相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，研究白藜蘆醇對(duì)牛肌管細(xì)胞線粒體生物發(fā)生的影響。

如圖6所示，與對(duì)照組相比，白藜蘆醇組SIRT1、PGC-1α、NRF-1和TFAMmRNA表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。蛋白表達(dá)水平如圖7所示，白藜蘆醇組SIRT1、PGC-1α、NRF-1和TFAM蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。SIRT1是細(xì)胞的重要能量感受器，當(dāng)骨骼肌中SIRT1的表達(dá)量增加時(shí)，線粒體生物發(fā)生增加，肌纖維類型發(fā)生轉(zhuǎn)化[32]。Li Yongguang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在心肌細(xì)胞中添加白藜蘆醇可以促進(jìn)基因SIRT1和PGC-1α的表達(dá)，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致，說明白藜蘆醇是SIRT1的誘導(dǎo)激活因子。此外SIRT1也是介導(dǎo)線粒體生物發(fā)生的關(guān)鍵因子，楊坤[33]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以通過激活SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路促進(jìn)線粒體生物發(fā)生。PGC-1α是SIRT1的下游因子，誘導(dǎo)線粒體編碼基因的轉(zhuǎn)錄，是銜接肌纖維類型轉(zhuǎn)化和線粒體功能的重要樞紐。在PGC-1α過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌中觀察到線粒體含量增加，抗疲勞能力增強(qiáng)，I型肌纖維含量增加[34]。在本研究中，與對(duì)照組相比，白藜蘆醇處理組中PGC-1α的表達(dá)量顯著增加。因此，白藜蘆醇可能作用于SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路。NRF-1位于PGC-1α的下游，是線粒體生成程序中的起始靶點(diǎn)，可以與TFAM相互作用，從而驅(qū)動(dòng)線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[35]。因此，本研究對(duì)NRF-1和TFAM的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示白藜蘆醇處理組中NRF-1和TFAM的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，表明牛肌管細(xì)胞中添加白藜蘆醇對(duì)于提高線粒體生物發(fā)生有積極作用。

圖6 白藜蘆醇對(duì)牛肌管細(xì)胞中SIRT1、PGC-1α、NRF-1和TFAM基因相對(duì)表達(dá)水平的影響Fig.6 Effect of resveratrol on the relative gene expression levels of SIRT1,PGC-1α,NRF-1 and TFAM in bovine myotube

圖7 白藜蘆醇對(duì)牛肌管細(xì)胞中SIRT1、PGC-1α、NRF-1和TFAM蛋白表達(dá)水平的影響Fig.7 Effect of resveratrol on the protein expression of SIRT1,PGC-1α,NRF-1 and TFAM in bovine myotube

為研究白藜蘆醇是否通過SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路增強(qiáng)線粒體生物發(fā)生，本研究利用SIRT1抑制劑EX527處理細(xì)胞。EX527對(duì)肌纖維類型表達(dá)的影響如圖8所示，real-time PCR結(jié)果表明，EX527顯著削弱了白藜蘆醇對(duì)MyHC I和MyHC IIamRNA表達(dá)的促進(jìn)作用（P＜0.05），此外，EX527顯著削弱了白藜蘆醇對(duì)MyHC I和MyHC IIa mRNA 表達(dá)的抑制作用（P＜0.05）。蛋白免疫印跡結(jié)果如圖9所示，與對(duì)照組相比，添加EX527后，EX527顯著削弱了白藜蘆醇對(duì)slow MyHC蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用（P＜0.05），同時(shí)顯著削弱了白藜蘆醇對(duì)fast MyHC蛋白表達(dá)的抑制作用（P＜0.05）。如圖10、11所示，白藜蘆醇明顯促進(jìn)了SIRT1、PGC-1α、NRF-1和TFAM基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，而加入EX527后可以明顯抑制白藜蘆醇的上述作用（P＜0.05）。楊越[36]發(fā)現(xiàn)在大鼠軟骨細(xì)胞中抑制SIRT1活性后可明顯抑制NRF-1、NRF-2和TFAM的mRNA表達(dá)水平，并且線粒體合成功能下降，與本研究結(jié)果類似。在氧化型肌纖維中線粒體含量豐富，通過增加mtDNA含量可以促進(jìn)線粒體編碼基因的表達(dá)（NRF-1和TFAM），提高線粒體生物發(fā)生，同時(shí) 促進(jìn)I型肌纖維的形成[37]。線粒體生物發(fā)生與肌纖維類型轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，氧化型肌纖維比例越高其線粒體生物發(fā)生程度也越高。綜上所述，白藜蘆醇通過SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路促進(jìn)線粒體生物發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)牛肌管細(xì)胞中肌纖維類型由糖酵解型轉(zhuǎn)化為氧化型。

圖8 EX527對(duì)牛肌管細(xì)胞中MyHC基因相對(duì)表達(dá)水平的影響Fig.8 Effect of EX527 on the relative gene expression levels of MyHC in bovine myotube

圖9 EX527對(duì)牛肌管細(xì)胞slow MyHC和fast MyHC蛋白表達(dá)水平的影響Fig.9 Effect of EX527 on protein expression of slow and fast MyHC in bovine myotube

圖10 EX527對(duì)牛肌管細(xì)胞中SIRT1、PGC-1α、NRF-1和TFAM基因相對(duì)表達(dá)水平的影響Fig.10 Effect of EX527 on the relative gene expression levels of SIRT1,PGC-1α,NRF-1 and TFAM in bovine myotube

圖11 EX527對(duì)牛肌管細(xì)胞中SIRT1、PGC-1α、NRF-1和TFAM蛋白表達(dá)水平的影響Fig.11 Effect of EX527 on protein expression of SIRT1,PGC-1α,NRF-1 and TFAM in bovine myotube

3 結(jié)論

白藜蘆醇能夠促進(jìn)牛肌管細(xì)胞分化，使牛肌管細(xì)胞中肌纖維類型由糖酵解型轉(zhuǎn)化為氧化型。白藜蘆醇使SIRT1、PGC-1α、NRF-1和TFAM的mRNA和蛋白表達(dá)升高，促進(jìn)線粒體生物發(fā)生，這可能是導(dǎo)致肌纖維類型轉(zhuǎn)化的原因。進(jìn)一步添加EX527抑制SIRT1活性后，白藜蘆醇對(duì)肌纖維類型的轉(zhuǎn)化作用被削弱，同時(shí)EX527使白藜蘆醇誘導(dǎo)的SIRT1、PGC-1α、NRF-1和TFAM mRNA和蛋白表達(dá)水平減弱。因此，本研究表明白藜蘆醇可通過SIRT1/PGC-1α激活線粒體生物發(fā)生進(jìn)而促進(jìn)牛肌管肌纖維類型轉(zhuǎn)化（圖12）。

圖12 白藜蘆醇調(diào)控牛肌管肌纖維類型轉(zhuǎn)化Fig.12 Schematic diagram for the regulation of skeletal muscle fiber type conversion in bovine myotube by resveratrol