張佳諾，楊 兵,，高 偉，范麗鵬，桑亞新,

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北省植物資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗室，晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司，河北 邯鄲 057250）

姜黃是姜科姜黃屬草本植物，其主要活性組分為酚類姜黃素和姜黃油，其中姜黃素具有抗癌、抗氧化、抑菌等多種生物活性，因其顯著的著色性能，成為全球銷量最大的食用色素之一[1]。姜黃素在工業(yè)提取過程中往往伴隨其加工副產(chǎn)物姜黃油的生成。目前，對姜黃油的研究主要集中在提取[2-3]以及生物活性功能方面，如抗炎鎮(zhèn)痛、抗癌、利膽和抗氧化等[4-6]。但姜黃油所含成分十分復(fù)雜，多達(dá)數(shù)百種組分，主要為倍半萜類化合物和芳香族化合物等成分，這些成分具有易揮發(fā)、不溶于水、性質(zhì)不穩(wěn)定等特點(diǎn)，同時也使姜黃油具有明顯的刺激性氣味[4]，限制了姜黃油作為一種優(yōu)質(zhì)脂質(zhì)的開發(fā)與利用。因此，如何提高姜黃油的穩(wěn)定性并對其刺激性氣味進(jìn)行有效掩蓋是姜黃油在應(yīng)用過程中亟待解決的問題。

通過物理改性可顯著提高植物精油的溶解性、穩(wěn)定性以及生物利用度[7]。目前，采用微乳液、微膠囊、脂質(zhì)體等物理改性手段提高植物精油的穩(wěn)定性和生物可及性是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[8]。微乳液是由一定比例油、水、表面活性劑和助表面活性劑均勻混合，形成具有良好的透光率、動力學(xué)穩(wěn)定的均相分散體系[9]。Lin Yu等[10]制備的姜黃油微乳液可有效抑制黃瓜葉片表面的真菌活性。何守魁等[11]采用微乳液包封丁香油并制備殼聚糖-丁香油微乳液復(fù)合膜，發(fā)現(xiàn)微乳液可顯著提高丁香油的抑菌活性。也有研究表明，微乳液包封可顯著降低植物油的氧化速率[12-13]。此外，微乳液包封化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的色素類化合物可有效提高此類物質(zhì)的穩(wěn)定性，延緩其降解速率[14]。由此可見，微乳液包封對于類似姜黃油等脂溶性營養(yǎng)素溶解度低、性質(zhì)不穩(wěn)定和生物可及性低等問題具有明顯改善作用，能夠極大地擴(kuò)展姜黃油的應(yīng)用范圍。此外，微乳液相較于其他物理改性技術(shù)，具有操作簡便、穩(wěn)定性高、成本較低等優(yōu)點(diǎn)[15]。對于水不溶性物質(zhì)或油不溶性物質(zhì)，可通過構(gòu)建微乳液體系，提高其溶解度并增強(qiáng)穩(wěn)定性及生物利用度[8]。

本研究通過使用氣相色譜-質(zhì)譜（g a s chromatographic-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀、氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatographic-ion mobility spectrometry，GC-IMS）聯(lián)用儀和電子鼻對姜黃油進(jìn)行成分分析。同時，使用電子鼻驗證微乳液包埋掩蓋其呈味物質(zhì)的作用。并采用水滴定法以吐溫80和1,2-丙二醇制備混合表面活性劑，通過比較偽三元相圖中姜黃油微乳液區(qū)的面積，優(yōu)化并確定微乳液的制備工藝。同時，對姜黃油微乳液的構(gòu)型、粒徑分布、pH值、形貌特征、穩(wěn)定性、自由基清除能力和消化特性等進(jìn)行分析，明確姜黃油微乳液的理化性質(zhì)。以此制備穩(wěn)定、可無限稀釋并廣泛應(yīng)用的姜黃油微乳液，以期為其他植物油微乳液的制備與研究提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃油由河北邯鄲曲周縣晨光生物科技有限公司提供。

吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）400、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、亞甲基藍(lán)、透析袋（截留分子質(zhì)量3 kDa）北京索萊寶科技有限公司；司盤80 上海展云化工有限公司；無水乙醇、丙三醇 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；1,2-丙二醇福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；氯化鉀、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、六水合氯化鎂、碳酸銨、氯化鈣、磷鎢酸水合物 上海麥克林生化科技有限公司；α-淀粉酶、豬胃蛋白酶、胰脂肪酶、膽酸鹽 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C GC-MS 安捷倫科技（中國）有限公司；FlavourSpec?GC-IMS 德國G.A.S.公司；PEN3電子鼻德國Airsense公司；NS-90納米粒度分析儀 珠海歐美克儀器有限公司；N5000紫外-可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；TGL-16G高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DDSJ-308F電導(dǎo)率儀 上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；FEI-TALOS-F200X透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）美國FEI公司；ZQZY-78AV振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 姜黃油組分分析

1.3.1.1 GC-MS分析

樣品前處理：稱取0.5 mL姜黃油，使用0.22 μm微孔有機(jī)濾膜過濾后，上樣分析測試。色譜條件如表1所示。質(zhì)譜條件：電子電離源；電子能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度設(shè)定在150 ℃；全掃描模式；質(zhì)量掃描范圍20～500 u；溶劑延遲3 min；采用NIST 11數(shù)據(jù)庫對檢測出的姜黃油組分進(jìn)行檢索。采用面積歸一化法確定姜黃油組分相對含量，即以鑒定某一成分的峰面積占所有鑒定成分面積之和的百分比作為定量結(jié)果[16]。

表1 姜黃油組分分析的GC-MS條件Table 1 Chromatographic conditions for the analysis of turmeric oil components by GC-MS

1.3.1.2 GC-IMS分析

準(zhǔn)確稱取0.5 g姜黃油于20 mL頂空瓶中，在40 ℃、250 r/min和500 r/min條件下各溫育10 min。提取的頂空空氣體積為100 μL，進(jìn)樣溫度為45 ℃。萃取出的揮發(fā)性有機(jī)化合物用氣相色譜柱預(yù)先分離并與IMS結(jié)合。柱溫為60 ℃，載氣為99.99%的純氮。載氣流動系統(tǒng)初始流速為1 mL/min，2 min時增加到2 mL/min，5 min時增加到10 mL/min，10 min時增加到30 mL/min，15 min時增加到50 mL/min，20 min時增加到100 mL/min，然后維持10 min。預(yù)先分離的化合物在IMS離子室中被電離源（5.68 keV）電離，然后轉(zhuǎn)移到9.8 cm的漂移管中，溫度為45 ℃，氮?dú)饬髁繛?50 mL/min。根據(jù)GC-IMS庫中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留指數(shù)、保留時間和測定方法對揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行鑒定，采用峰面積歸一化法對樣品中各組分進(jìn)行定量[16]。

1.3.1.3 電子鼻分析

參考段夢雅等[17]的方法并稍作修改。取最佳工藝所制備的姜黃油及其微乳液各10 μL于10 mL頂空瓶中，將其密封進(jìn)行測試（樣品一式三份）。待測樣品在40 ℃孵育1 min，頂空分析注射體積1500 μL；收集延遲時間為210 s；注射器溫度為50 ℃。PEN3型電子鼻的10 個傳感器及其敏感物質(zhì)見表2。

表2 PEN3型電子鼻的10 個傳感器及其敏感物質(zhì)Table 2 Performance description of 10 sensors in PEN3 electronic nose

1.3.2 姜黃油微乳液的制備及偽三元相圖的繪制

姜黃油微乳液采用向油相和混合表面活性劑中加水滴定的方法進(jìn)行制備[18]。將表面活性劑與助表面活性劑按照一定比例制成混合表面活性劑，再使用磁力攪拌器以400 r/min的速率攪拌30 min混勻?；旌媳砻婊钚詣┡c姜黃油分別以質(zhì)量比（Smix）1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1在400 r/min攪拌30 min混勻。向該混合體系中滴加去離子水，在滴加過程中進(jìn)行磁力攪拌，使得該體系由澄清變渾濁，繼續(xù)滴加去離子水，直至體系由渾濁變澄清并保持穩(wěn)定。記錄該體系由渾濁變澄清時所滴加去離子水的質(zhì)量，再結(jié)合體系中所含油相和混合表面活性劑的質(zhì)量，使用Origin 2019軟件繪制成偽三元相圖。偽三元相圖中由臨界點(diǎn)圍成的區(qū)域為姜黃油微乳液區(qū)，使用Auto CAD軟件計算姜黃油微乳液區(qū)的相對面積（A）[19]。

1.3.3 姜黃油微乳液的工藝優(yōu)化及影響因素分析

1.3.3.1 表面活性劑的篩選

將表面活性劑（吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80和司盤80）與無水乙醇按照質(zhì)量比2∶1以400 r/min攪拌30 min混合均勻，并以此作為混合表面活性劑按照1.3.2節(jié)所述步驟制備姜黃油微乳液。繪制偽三元相圖，比較不同表面活性劑所制備姜黃油微乳液區(qū)的A。

1.3.3.2 助表面活性劑的篩選

助表面活性劑選擇使用無水乙醇、丙三醇、1,2-丙二醇和PEG 400，按照2∶1質(zhì)量比與篩選出的最優(yōu)表面活性劑混合均勻，并以此作混合表面活性劑按照1.3.2節(jié)所述步驟進(jìn)行姜黃油微乳液的制備。繪制偽三元相圖，比較不同助表面活性劑所制備姜黃油微乳液區(qū)的A。

1.3.3.3Km的篩選

Km即表面活性劑與助表面活性劑的質(zhì)量之比[20]。制備姜黃油微乳液的最優(yōu)表面活性劑和助表面活性劑分別以5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2質(zhì)量比混合均勻，并以此作為混合表面活性劑按照1.3.2節(jié)所述步驟進(jìn)行姜黃油微乳液的制備。繪制偽三元相圖并比較不同Km姜黃油微乳液區(qū)的A。

1.3.4 姜黃油微乳液構(gòu)型分析

1.3.4.1 姜黃油微乳液構(gòu)型表征

選擇吐溫80和1,2-丙二醇按照Km＝4∶1制備混合表面活性劑，混合表面活性劑與油相姜黃油以8∶2質(zhì)量比制備水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%～90%的姜黃油微乳液。采用電導(dǎo)率法和亞甲基藍(lán)染色法對姜黃油微乳液構(gòu)型進(jìn)行表征。根據(jù)微乳液的電導(dǎo)率可判斷微乳液的構(gòu)型變化[21]。水溶性染料亞甲基藍(lán)溶液（1 g/L）在水包油型、油包水型及雙連續(xù)相微乳液中的擴(kuò)散速度不同，據(jù)此可判斷姜黃油微乳液的構(gòu)型[22]。

1.3.4.2 姜黃油微乳液形貌觀察

將銅網(wǎng)浸沒于姜黃油微乳液中，靜置2 min。然后使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的磷鎢酸染色2 min，用濾紙吸干銅網(wǎng)上的多余液體，室溫風(fēng)干后用TEM觀察姜黃油微乳液的形貌特征[23]。

1.3.4.3 粒徑分布及大小、密度、pH值測定

采用納米粒度分析儀測定姜黃油微乳液液滴的平均粒徑和多分散指數(shù)（polydiseperse index，PDI）。測試溫度為25 ℃，散射角為173°。根據(jù)姜黃油微乳液質(zhì)量與體積的比值確定其密度。使用pH計測定姜黃油微乳液的pH值。

1.3.4.4 穩(wěn)定性分析

通過研究離心速率、鹽濃度、貯藏溫度、貯藏時間對姜黃油微乳液透光率的影響，對姜黃油微乳液的穩(wěn)定性進(jìn)行評估[13]。取適量姜黃油微乳液分別在2000、4000、6000、8000 r/min和10000 r/min條件下離心10 min，測定其離心穩(wěn)定性；將濃度分別為0.1、0.5、1、1.5 mol/L和2.0 mol/L的NaCl溶液加入姜黃油微乳液中，評估其鹽濃度穩(wěn)定性；將姜黃油微乳液分別于－20、0、4、25、37、60、80 ℃貯藏30 min，評估其溫度穩(wěn)定性；將微乳液于常溫（（25±1）℃）貯藏，分別在第1、3、5、10、20、30天進(jìn)行貯藏時間穩(wěn)定性的評估；最后觀察姜黃油微乳液是否分層破乳，若無分層無破乳，以去離子水為空白對照，測定姜黃油微乳液離心前后在550 nm波長處的吸光度，按式（1）計算微乳液的透光率：

式中：T為姜黃微乳液的透光率/%；A0為貯藏處理前姜黃油微乳液的吸光度；A1為貯藏處理后姜黃油微乳液的吸光度。

1.3.5 姜黃油及其微乳液自由基清除能力比較測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的測定

姜黃油微乳液DPPH自由基清除能力的測定參考文獻(xiàn)[24]，并稍作修改。稱取30 mg DPPH于50 mL不透光的離心管中，加入20 mL無水乙醇，充分溶解混勻，配制成0.04 mmol/L的DPPH自由基工作液。使用96 孔板測定姜黃油及其微乳液的DPPH自由基清除率。用無水乙醇將姜黃油及其微乳液分別稀釋成不同質(zhì)量濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）的溶液。在571 nm波長處測定各孔吸光度，根據(jù)式（2）計算姜黃油及姜黃油微乳液的DPPH自由基清除率，并以VC作陽性對照進(jìn)行比較。

式中：A1為DPPH自由基工作液與不同質(zhì)量濃度姜黃油與其微乳液混合液的吸光度；A2為無水乙醇與不同質(zhì)量濃度姜黃油與其微乳液混合液的吸光度；A0為DPPH自由基工作液與無水乙醇混合液的吸光度。

1.3.5.2 ABTS陽離子自由基清除能力的測定

取2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液與7 mmol/L的ABTS陽離子自由基溶液各5 mL，混合均勻，室溫避光反應(yīng)12～16 h。在使用前將ABTS陽離子自由基溶液稀釋（無水乙醇）至在734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02。

取2 mL ABTS陽離子自由基溶液加入0.2 mL經(jīng)無水乙醇稀釋至不同質(zhì)量濃度的待測樣品（姜黃油、姜黃油微乳液），室溫渦旋10 min，混勻，并在734 nm波長處測定其吸光度，以無水乙醇作為空白對照。按照式（3）計算姜黃油及姜黃油微乳液的ABTS陽離子自由基清除率，并以VC作為陽性對照進(jìn)行比較[25]。

式中：A0為ABTS陽離子自由基溶液與無水乙醇混合液的吸光度；A1為ABTS陽離子自由基溶液與不同質(zhì)量濃度姜黃油及其微乳液混合液的吸光度。

1.3.6 姜黃油微乳液模擬體外消化

1.3.6.1 姜黃油微乳液于各模擬消化相中pH值與電導(dǎo)率的測定

參照Wang Zhanzhong等[26]的方法并稍作修改。按表3配制模擬口腔消化液、胃液及腸消化液，將姜黃油微乳液按照1∶1（V/V）的比例與消化液渦旋混勻。于37 ℃恒溫?fù)u床以200 r/min模擬口腔消化10 min，每2 min取樣測定電導(dǎo)率與pH值；取口腔消化產(chǎn)物置于模擬胃液中消化3 h，每30 min取樣測定電導(dǎo)率與pH值；取胃消化產(chǎn)物置于模擬腸消化液中消化3 h，每30 min取樣測定電導(dǎo)率與pH值。

表3 模擬消化液的組成及消化條件Table 3 Composition of simulated digestive fluids and experimental conditions

1.3.6.2 姜黃油釋放量測定

參考Li Qing等[27]的方法并稍作修改。將5 mL的姜黃油微乳液分別與5 mL口腔、胃和腸消化液混合，并置于截留分子質(zhì)量為3 kDa的透析袋中。然后分別將透析袋浸沒于200 mL同源消化相電解液中，在37 ℃和200 r/min條件下消化。消化過程中，按照1.3.6.1節(jié)的時間間隔，取出2 mL的透析液，將取出的透析液與等體積的無水乙醇混合均勻，在263 nm波長處測定透析液的吸光度，并按照式（4）計算姜黃油釋放率：

式中：R為姜黃油釋放率/%；ρ2為孵育樣品在每個時間點(diǎn)的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρ1為樣品的初始質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃油的組成成分

根據(jù)保留時間共鑒定出姜黃油的100 種揮發(fā)性組分，通過峰面積歸一化法確定各揮發(fā)性成分的相對含量，其中相對含量高于0.01%的組分有33 種，占總揮發(fā)性組分含量的86.33%，結(jié)果如表4所示。姜黃油組分中相對含量較高的有芳姜黃酮（23.09%）、姜黃酮（21.36%）、β-姜黃酮（14.93%）、姜烯（7.63%）、β-倍半水芹烯（7.30%）、α-姜黃烯（3.32%）等黃酮及萜烯類物質(zhì)。GC-IMS結(jié)果如圖1所示，指紋圖譜中不同色調(diào)表示不同濃度，白點(diǎn)表示濃度較低，紅點(diǎn)表示濃度較高。在姜黃油中共分析到77 種物質(zhì)，其中確定出64 種揮發(fā)性有機(jī)化合物，有13 個峰未確定。64 種揮發(fā)性有機(jī)化合物包括醇類12 種、酮類11 種、酯類10 種、醛類10 種、酚類和酸類8 種、烴類7 種和其他物質(zhì)6 種。電子鼻分析結(jié)果如圖2所示，雷達(dá)圖中的10 個坐標(biāo)分別代表10 個對不同物質(zhì)敏感的感受器（表2）[28]。W1W、W2W、W5S感受器的響應(yīng)值較高，表明姜黃油中含有的萜烯類化合物、芳香族化合物、含硫有機(jī)化合物及氮氧化合物的種類較多，這與GC-MS和GC-IMS的檢測結(jié)果一致。此外，通過微乳液的包埋，電子鼻在姜黃油中較高的感受器響應(yīng)值顯著降低（P＜0.05），這表明微乳液的包埋可穩(wěn)定姜黃油的揮發(fā)性成分。姜黃油中的萜烯類及黃酮類物質(zhì)具有鎮(zhèn)痛消炎、抑菌、抗癌等生理活性，但姜黃油的強(qiáng)揮發(fā)性會導(dǎo)致生物活性成分流失，嚴(yán)重限制姜黃油在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用[29]。因此，使用微乳液體系對姜黃油進(jìn)行包封有助于姜黃油中姜黃酮、姜黃烯、姜烯等成分安全、有效地發(fā)揮作用。

圖1 姜黃油揮發(fā)性有機(jī)化合物指紋圖譜Fig.1 Fingerprint of volatile organic compounds in turmeric oil

圖2 姜黃油及其微乳液電子鼻響應(yīng)數(shù)據(jù)雷達(dá)圖Fig.2 Radar chart of electronic nose response data for turmeric oil and its microemulsion

2.2 姜黃油微乳液的制備與工藝優(yōu)化

2.2.1 表面活性劑對姜黃油微乳液形成的影響

表面活性劑在微乳液形成過程中可在油相和水相之間形成穩(wěn)定的單層膜，同時降低油-水界面的表面張力，進(jìn)而促使微乳液的形成。由圖3可知，不同表面活性劑形成的微乳液區(qū)面積大小依次為吐溫80＞吐溫20＞吐溫60＞吐溫40＞司盤80。不同系列吐溫以及司盤結(jié)構(gòu)與微乳液的形成密切相關(guān)，各表面活性劑的疏水鏈長度、酯化程度以及脂肪酸組成均不同，司盤80、吐溫60和吐溫80的疏水鏈長均為18，吐溫20和吐溫40的疏水鏈長分別為12和16。研究表明，表面活性劑的疏水鏈越長，越有利于形成微乳液[30]。但本研究吐溫80和司盤80所形成的微乳液區(qū)面積差異顯著，這可能與兩者的親水親油平衡（hydrophilic lipophilic balance，HLB）值不同有關(guān)，吐溫80和司盤80的HLB值分別為15.0和4.3。這也說明，表面活性劑的疏水鏈長相較于HLB值對微乳液的形成影響更小。這與褚祚晨[31]的研究結(jié)果相似。因此，確定吐溫80作為制備姜黃油微乳液的表面活性劑。

圖3 表面活性劑對姜黃油微乳液形成的影響Fig.3 Effects of surfactants on the formation of turmeric oil microemulsion

2.2.2 助表面活性劑對姜黃油微乳液形成的影響

助表面活性劑在微乳液形成過程中可嵌入表面活性劑分子中降低其表面張力，同時提高水相和油相界面膜的流動性和柔性[32]。如圖4所示，不同助表面活性劑形成的微乳液區(qū)面積大小依次為1,2-丙二醇＞無水乙醇＞PEG 400＞丙三醇。醇鏈的長短和羥基數(shù)量是影響微乳液形成的關(guān)鍵，隨著醇鏈的增長以及羥基數(shù)量的增加，微乳液區(qū)面積減小[24]。但本研究結(jié)果顯示，1,2-丙二醇作為助表面活性劑形成的微乳液區(qū)面積顯著大于無水乙醇，可能原因為吐溫80的HLB值為15，親水性優(yōu)于親脂性，形成微乳液時，傾向于分散在水核中。但由于丙二醇的羥基數(shù)量大于無水乙醇，具有更好的水溶性，且更易溶解在水核中，從而增大水核的脂溶性，不利于水相中吐溫80的溶解，促使吐溫80更多分配在油-水界面，增加界面上吐溫80的濃度，更有利于微乳液的形成[33]。此外，1,2-丙二醇常作為潤濕劑應(yīng)用到日化行業(yè)，而本研究中姜黃油的生產(chǎn)企業(yè)也偏向于將姜黃油作為日化產(chǎn)業(yè)原料進(jìn)行開發(fā)。因此，確定吐溫80作為姜黃油微乳液制備的助表面活性劑。

圖4 助表面活性劑對姜黃油微乳液形成的影響Fig.4 Effects of cosurfactants on the formation of turmeric oil microemulsion

2.2.3Km對姜黃油微乳液形成的影響

如圖5所示，隨著Km增大，微乳液區(qū)面積呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢?？赡苁且驗楫?dāng)Km較小時，過多的助表面活性劑溶解到水相之中，無法鑲嵌到微乳液的水油界面上，使微乳液的界面膜彈性降低，微乳液穩(wěn)定性減小[34]。當(dāng)Km較大時，助表面活性劑就會被吸附并鑲嵌到油-水界面上，從而增大表面張力，促進(jìn)微乳液的形成，從而得到面積較大的微乳液區(qū)。當(dāng)Km過大時，微乳液制備成本偏高，且會在微乳液制備過程中產(chǎn)生大量氣泡，影響微乳液制備終點(diǎn)的判斷。當(dāng)姜黃油微乳液的Km為4∶1時，偽三元相圖中微乳液區(qū)面積最大，且具有Smix為8∶2的水無限稀釋線，這與羅偉斌等[24]的研究結(jié)果一致。因此，為了穩(wěn)定增溶更多的姜黃油，選擇Km為4∶1和Smix為8∶2作為制備姜黃油微乳液的條件。

圖5 Km對姜黃油微乳液形成的影響Fig.5 Km effect on the formation of turmeric oil microemulsion

2.3 姜黃油微乳液的構(gòu)型分析

如圖6所示，當(dāng)姜黃油微乳液的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于30%時，姜黃油微乳液為油包水型，此時體系以油相為主，且姜黃油密度比水大，因此亞甲基藍(lán)分布于微乳液的頂部；當(dāng)姜黃油微乳液水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍介于30%～60%時，微乳液由油包水型向雙連續(xù)相轉(zhuǎn)變，隨著姜黃油微乳液含水量進(jìn)一步增加，亞甲基藍(lán)染液在姜黃油微乳液中的擴(kuò)散范圍逐漸增大；當(dāng)姜黃油微乳液中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在60%及以上時，姜黃油微乳液轉(zhuǎn)變?yōu)樗托停藭r，姜黃油微乳液以水相為主，亞甲基藍(lán)溶液在姜黃油微乳液中充分?jǐn)U散，分布均勻。

圖6 亞甲基藍(lán)溶液在不同水分含量的姜黃油微乳液中的擴(kuò)散情況Fig.6 Diffusion of methylene blue solution in turmeric oil microemulsion with different moisture contents

微乳液的相轉(zhuǎn)變過程可根據(jù)其電導(dǎo)率的變化進(jìn)行分析，如圖7所示，當(dāng)微乳液中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于30%時，微乳液的電導(dǎo)率呈現(xiàn)緩慢增長趨勢，微乳液構(gòu)型呈油包水型，可能是吐溫80與油相將體系中部分水進(jìn)行包封和隔離，導(dǎo)致體系中水分子之間碰撞較少，電解質(zhì)較少，在此范圍內(nèi)的微乳液電導(dǎo)率增長緩慢[35]。隨著微乳液中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)由30%增加到60%，微乳液的電導(dǎo)率迅速從10.79 μS/cm增加到97.03 μS/cm，可能是因為微乳液中小水滴碰撞與接觸的比率開始逐漸增加，水相也由分散相變成雙連續(xù)相，此時的導(dǎo)電通道逐漸完善，電解質(zhì)也逐漸增加，因此電導(dǎo)率快速升高，且微乳液構(gòu)型呈雙連續(xù)相型。隨著微乳液中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的繼續(xù)升高，電導(dǎo)率增加緩慢，當(dāng)微乳液水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%時，姜黃油微乳液的電導(dǎo)率達(dá)到最大值99.70 μS/cm，隨后開始逐步降低。可能是微乳液電導(dǎo)率達(dá)到最高值時，此時的導(dǎo)電通道已完成，繼續(xù)增大水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，水分的稀釋作用引起電導(dǎo)率下降[35]，同時微乳液由連續(xù)相轉(zhuǎn)變?yōu)樗托?。這些結(jié)果與亞甲基藍(lán)染色法的結(jié)果類似。

圖7 不同含水量的姜黃油微乳液的電導(dǎo)率變化Fig.7 Variation curves of conductivity of turmeric oil microemulsion with different water contents

綜上所述，采用水滴定法以及通過比較偽三元相圖姜黃油微乳液區(qū)的面積，優(yōu)化得出姜黃油微乳液的最佳制備工藝：表面活性劑為吐溫80，助表面活性劑為1,2-丙二醇，Km為4∶1，Smix為8∶2，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%。后續(xù)分析研究基于以上工藝所制備的姜黃油微乳液。

2.4 姜黃油微乳液的表征

2.4.1 姜黃油微乳液的形貌特征

如圖8所示，微乳液經(jīng)磷鎢酸染色后因負(fù)反射呈明亮白色，液滴呈球形或橢球形，分布均勻，不聚集，微乳液的液滴粒徑在100 nm以下，符合微乳液定義的粒徑范圍[36]。崔鈺涵[37]研究發(fā)現(xiàn)，丁香油微乳液顆粒在Km為4∶1、Smix為8∶2、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%時，呈凹凸球狀分布，且體系中粒子分布均勻、不聚集，這與本研究結(jié)果相似。同時，姜黃油微乳液液滴粒徑小于大部分人體細(xì)胞的直徑，有利于姜黃油的吸收與利用。因此，通過制備微乳液對姜黃油進(jìn)行包埋，可提高姜黃油的生物利用度。

圖8 放大50000 倍（a）與100000 倍（b）的姜黃油微乳液TEM圖像Fig.8 TEM images of turmeric oil microemulsion(× 50000 (a) and × 100000 (b))

2.4.2 姜黃油微乳液粒徑分布及大小、密度、pH值分析

微乳液的粒徑分布和大小是反映微乳液體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。如圖9所示，姜黃油微乳液的粒徑呈單峰分布，平均粒徑為（32.81±14.54）nm。姜黃油微乳液的粒徑分布與人體的紅細(xì)胞大小相近，便于人體吸收。相關(guān)研究認(rèn)為微乳液的PDI為0～1，PDI越小表明粒徑分布越集中[36]。本研究中姜黃油微乳液的PDI為0.27±0.11，屬于微乳液的界定范圍。此外，姜黃油微乳液密度為（1.053±0.001）g/mL，接近于水的密度，其pH值為6.81±0.02，接近中性。

圖9 姜黃油微乳液的粒徑分布Fig.9 Droplet size distribution of turmeric oil microemulsion

2.4.3 姜黃油微乳液穩(wěn)定性分析

微乳液透光率及外觀是評價微乳液穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，澄清的微乳液有助于在不影響食品、藥品外觀的情況下進(jìn)行應(yīng)用[23]。圖10顯示，不同貯藏條件下姜黃油微乳液的透光率與貯藏前相比無顯著差異（P＞0.05）。貯藏前后，姜黃油微乳液的透光率始終保持在90%以上。此外，在不同條件下貯藏的姜黃油微乳液無分層或破乳現(xiàn)象。綜上所述，在不同貯藏條件下姜黃油微乳液都表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

圖10 不同貯藏條件下姜黃油微乳液的透光率Fig.10 Light transmittance of turmeric oil microemulsion under different storage conditions

2.5 姜黃油及其微乳液自由基清除能力比較分析

2.5.1 DPPH自由基清除率

如圖11所示，姜黃油及其微乳液的DPPH自由基清除率都表現(xiàn)出劑量依賴性，隨著質(zhì)量濃度的增大，DPPH自由基清除率也不斷增加。姜黃油與其微乳液的DPPH自由基清除率在其質(zhì)量濃度為2～4 mg/mL時存在顯著差異（P＜0.05），但隨著姜黃油及其微乳液質(zhì)量濃度的增大，二者的DPPH自由基清除率之間的差異顯著減小。結(jié)果表明，構(gòu)建姜黃油微乳液體系并沒有降低姜黃油的DPPH自由基清除能力，這與羅偉斌等[24]的研究結(jié)果類似。

圖11 姜黃油及其微乳液的DPPH自由基清除率Fig.11 DPPH radical scavenging rates of turmeric oil and its microemulsion

2.5.2 ABTS陽離子自由基清除率

如圖12所示，在2～10 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，姜黃油及其微乳液質(zhì)量濃度與ABTS陽離子自由基清除率呈劑量依賴效應(yīng)，且在同一質(zhì)量濃度下，微乳液的ABTS陽離子自由基清除率顯著高于姜黃油（P＜0.05），在10 mg/mL時，姜黃油微乳液和姜黃油對ABTS陽離子自由基清除率分別為86.96%和65.99%，陽性對照VC的ABTS陽離子自由基清除率均顯著高于相同質(zhì)量濃度的姜黃油微乳液和姜黃油（P＜0.05）。為進(jìn)一步量化姜黃油微乳液和姜黃油對ABTS陽離子自由基清除能力，計算得出姜黃油微乳液和姜黃油對ABTS陽離子自由基清除率達(dá)到50%時的質(zhì)量濃度分別為2.65 mg/mL和4.89 mg/mL，表明構(gòu)建的姜黃油微乳液體系顯著提高了姜黃油ABTS陽離子自由基清除能力。可能是因為微乳液體系的構(gòu)建克服了姜黃油水溶性差的問題，且姜黃油微乳液是一種水包油型微乳液，其粒徑分布均勻，有助于其發(fā)揮生物活性功能，從而提高了姜黃油的ABTS陽離子自由基清除率[19]。這與褚祚晨[31]的研究結(jié)果相似。

圖12 姜黃油及其微乳液的ABTS陽離子自由基清除率Fig.12 ABTS cation radical scavenging rates of turmeric oil and its microemulsion

2.6 姜黃油微乳液模擬體外消化穩(wěn)定性分析

2.6.1 姜黃油微乳液模擬體外消化pH值及電導(dǎo)率的變化

為分析姜黃油微乳液在模擬消化相中的反應(yīng)情況，測定其pH值和電導(dǎo)率變化，結(jié)果如圖13所示。在口腔消化液中，隨著消化時間的延長，微乳液的pH值從7.02上升至7.15（圖13A），電導(dǎo)率在23.10～23.36 mS/cm范圍內(nèi)波動（圖13C），各取樣點(diǎn)的pH值和電導(dǎo)率均無顯著差異（P＞0.05）。在模擬胃液消化過程中，微乳液的pH值（圖13B）和電導(dǎo)率（圖13D）分別在3.02～3.13和33.03～33.66 mS/cm范圍內(nèi)波動，二者也無顯著差異（P＞0.05），結(jié)果表明姜黃油微乳液受口腔相和胃相消化環(huán)境的影響較小且不顯著。而在模擬腸液消化過程中，微乳液的pH值從7.01上升至7.49，電導(dǎo)率從56.46下降至47.23 mS/cm，這可能是由于微乳液的部分結(jié)構(gòu)被破壞，以及模擬腸液中的脂肪酶對微乳液中姜黃油的酶解作用，使其pH值和電導(dǎo)率均發(fā)生顯著變化[38]（P＜0.05）。綜上所述，姜黃油微乳液在口腔相和胃相中具有良好的穩(wěn)定性，在腸相中可能由于微乳液結(jié)構(gòu)被破壞及組分被脂解而出現(xiàn)微乳液穩(wěn)定性下降或喪失的現(xiàn)象。

圖13 姜黃油微乳液在不同模擬消化相中的pH值和電導(dǎo)率變化Fig.13 Changes in pH and conductivity ofturmeric oil microemulsion in different simulated digestive phases

2.6.2 微乳液中的姜黃油體外釋放量分析

如圖14所示，姜黃油微乳液在模擬口腔消化液中消化2 min及10 min后，姜黃油的釋放量分別為23.68%和32.23%，經(jīng)胃相消化30 min和3 h后的釋放量分別為12.08%和17.71%，這表明微乳液在模擬口腔消化液和胃液中有較好的抗消化作用，可能是因為其在這兩相中形成一個較松散的結(jié)構(gòu)，從而釋放出部分的姜黃油[26]。經(jīng)腸相消化30 min和3 h后，姜黃油的釋放量分別達(dá)到33.63%和45.61%，這可能是由于模擬腸液中的胰酶水解吐溫80的酯鍵，破壞部分姜黃油微乳液的結(jié)構(gòu)，從而釋放出較多的姜黃油。如圖14所示，在口腔相和胃相中都有一定的姜黃油釋放，而在腸相中姜黃油釋放率明顯更高。pH值和電導(dǎo)率的測定結(jié)果表明，姜黃油微乳液在口腔相和胃相中具有較好的抗消化穩(wěn)定性，而在腸相中可能是部分結(jié)構(gòu)被破壞而釋放出較多的姜黃油，表現(xiàn)出一定的腸道定向釋放特性。以上結(jié)果表明姜黃油微乳液可使大部分的姜黃油在模擬口腔消化和胃消化的過程中保持一定的穩(wěn)定性，從而能夠到達(dá)腸道被更好地吸收與利用。

圖14 微乳液中的姜黃油在模擬消化相中的釋放曲線Fig.14 Release curves of turmeric oil from microemulsion in simulated digestive phases

3 結(jié)論

本研究采用GC-MS、GC-IMS及電子鼻分析姜黃油的活性成分，結(jié)果顯示其主要揮發(fā)性化合物為姜黃酮、姜黃烯等萜烯類物質(zhì)。以姜黃油為油相，使用水滴定法制備姜黃油微乳液，繪制偽三元相圖篩選確定表面活性劑為吐溫80，助表面活性劑為1,2-丙二醇，Km為4∶1，Smix為8∶2，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%。其中，使用電子鼻證明微乳液包埋可掩蓋其呈味成分，更加全面地評估姜黃油微乳液在食品中的應(yīng)用潛力。微乳液的表征及對其理化性質(zhì)的研究結(jié)果顯示，姜黃油微乳液中性偏酸，液滴呈球形或橢球形且在不同貯藏條件下仍保持較強(qiáng)的穩(wěn)定性。微乳液包封可顯著提高姜黃油的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力。對姜黃油進(jìn)行體外模擬消化和釋放量測定，發(fā)現(xiàn)微乳液包封可使姜黃油在模擬口腔消化和胃消化的過程中保持一定的穩(wěn)定性，能夠到達(dá)腸道，從而被更好地吸收與利用。本研究為姜黃油資源的高值化利用提供了新思路，同時也為其在食品、日化和醫(yī)藥行業(yè)的產(chǎn)品開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。