萬(wàn)旗鈺，程玉鑫，黃永光, ，佘榮書(shū)，鄧昌偉，左乾程

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省酣客君豐酒業(yè)有限公司，貴州 仁懷 564500）

醬香白酒具有獨(dú)特的釀造工藝，其復(fù)雜的釀造微生物群落構(gòu)成了醬香白酒獨(dú)特的酒體風(fēng)格，近年來(lái)廣受消費(fèi)者歡迎[1-2]。醬香白酒無(wú)論是釀造過(guò)程中的酒醅還是成品酒，其代謝產(chǎn)物及風(fēng)味物質(zhì)中，酸類化合物占比較大，尤其是乳酸和乙酸，因此“酸高”成為醬香白酒一大特點(diǎn)[3]。釀造的7 個(gè)輪次周期中，前期輪次產(chǎn)酸微生物競(jìng)相生長(zhǎng)繁殖，造成酒醅酸度的不斷增加，后期輪次酸度趨向平穩(wěn)，1、2輪次是釀造過(guò)程中酸度變化較大的時(shí)期[4]。因此研究醬香白酒1、2輪次酸類化合物種類及結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步了解其變化趨勢(shì)。

Song Zhewei等[5]通過(guò)超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）和頂空固相微萃取-氣相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)共鑒定出醬香型酒醅中12 種酸（主要是乳酸、乙酸和琥珀酸）。胡小霞等[6]通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)進(jìn)入窖池發(fā)酵后，微生態(tài)很快由復(fù)雜的多菌屬生態(tài)結(jié)構(gòu)演替為單一的以Lactobacillus為主導(dǎo)的生態(tài)結(jié)構(gòu)。同時(shí)Delftia、Pseudomonas、Stenotrophomonas、Burkholderia和Saccharopolyspora等結(jié)構(gòu)主要會(huì)受酸度影響，因此酒醅酸度的變化會(huì)改變微生物群落的組成[7]。

由于發(fā)酵窖池較深，酒醅在輪次加工過(guò)程中均采用“分層起糟”的方式進(jìn)行處理[8]。取自窖面的酒醅含羰基化合物較多，取自窖中的酒醅含大量多元醇物質(zhì)，取自窖底的酒醅乙酸乙酯風(fēng)味較重[9]。造成此差異的可能原因是窖池空間內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)差異及變化，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物具有差異[10]。但前期研究中鮮見(jiàn)采用分層采樣進(jìn)行分析，缺少對(duì)窖池酒醅不同空間位置（上、中、底層）酸類化合物及微生物群落結(jié)構(gòu)的研究。

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)及UPLC檢測(cè)技術(shù)解析了醬香白酒釀造過(guò)程中1、2輪次窖池發(fā)酵上、中、底層微生物群落及酸類化合物，對(duì)分析醬香白酒1、2輪次窖池不同空間位置酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)及酸類化合物種類和變化具有重要意義，旨在為傳統(tǒng)白酒固態(tài)發(fā)酵調(diào)控提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品采自貴州省仁懷市酣客君豐酒廠制酒車間發(fā)酵窖池2021年12月—2022年2月，1、2輪次窖池發(fā)酵酒醅。

E.Z.N.A.Soil DNA試劑盒 美國(guó)Omega BioTek公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、引物合成 生工生物工程（上海）股份有限公司；異丙醇、磷酸（均為分析純）天津市富宇精細(xì)化工有限公司；電泳緩沖液、Gengreen染料 北京金博益生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉（分析純）中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；亞鐵氰化鉀、硫酸鋅（均為分析純）天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水磷酸二氫鈉、冰乙酸、甲酸、無(wú)水檸檬酸（均為標(biāo)準(zhǔn)品，色譜級(jí)）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；L-乳酸、琥珀酸、L-酒石酸、無(wú)水草酸（均為標(biāo)準(zhǔn)品，色譜級(jí)）北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；高壓蒸汽滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 杭州郎基有限公司；DYY-8C電泳儀 北京六一儀器廠；旋渦震蕩儀華利達(dá)有限公司；超純水機(jī) 德國(guó)Think-lab公司；凝膠成像儀 上海天能科技有限公司；MiSeq測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司；自動(dòng)點(diǎn)位滴定儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；超高效液相色譜 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

1、2輪次窖池發(fā)酵周期為30 d，每隔5 d采樣（0、5、10、15、20、25 d和30 d）。樣品采集固定跟蹤一個(gè)窖池，按照窖池空間采集窖池上層酒醅、中層酒醅和底層酒醅，取樣點(diǎn)如圖1所示，上層按照A、B、C 3 個(gè)點(diǎn)采集，中層按照D、E、F 3 個(gè)點(diǎn)采集，底層按照G、H、I 3 個(gè)點(diǎn)采集，將同層采集的3 個(gè)樣品等量混合為該空間位置的混合樣品。研究共采集126 個(gè)發(fā)酵酒醅小樣，最終混合成42 個(gè)樣品。

圖1 窖池發(fā)酵酒醅取樣點(diǎn)Fig.1 Sampling points of fermented grains in the fermentation cellar

1.3.2 酒醅總酸含量及pH值測(cè)定

總酸含量根據(jù)GB 12456—2021《食品中總酸的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定；pH值采用酸度計(jì)測(cè)定。

1.3.3 酒醅預(yù)處理及酸類化合物測(cè)定

樣品預(yù)處理參考郎召偉[11]的方法并做修改，準(zhǔn)確稱取2 g酒醅（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入20 mL超純水，浸泡1 h后，8000 r/min離心15 min。取4 mL上清液加入106 g/L亞鐵氰化鉀溶液和300 g/L硫酸鋅溶液各1 mL以去除蛋白，渦旋混勻，8000 r/min離心3 min。用注射器吸取上清液后使用0.22 μm針管式濾膜（水系）過(guò)濾上清液至液相小瓶中待測(cè)。

采用UPLC法檢測(cè)42 個(gè)待測(cè)樣液，參考文獻(xiàn)[12]方法并適當(dāng)調(diào)整。UPLC條件：采用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：20 mmol/L NaH2PO4溶液（pH 2.7）；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：35 ℃；流速：0.25 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)保留時(shí)間確定樣品中各組分的色譜峰，根據(jù)每次測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)稀釋曲線確定樣品中酸類產(chǎn)物的含量。

1.3.4 酒醅微生物總DNA提取、PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

參考文獻(xiàn)[5]報(bào)道的方法，首先，分別取樣品16 g于100 mL離心管中，加入3～5 顆玻璃珠和35 mL滅菌后的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，旋渦振蕩7 min，400 r/min低速離心5 min，吸取上清液至已滅菌的50 mL離心管中；其次，加入20 mL PBS至裝有樣品的100 mL離心管中，旋渦振蕩4 min，400 r/min低速離心5 min，收集上清液至已滅菌的50 mL離心管中；最后，將裝有上清液的50 mL離心管于離心機(jī)12000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細(xì)胞沉淀。預(yù)處理后每個(gè)樣品的總DNA提取步驟參考E.Z.N.A.Soil DNA試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)。細(xì)菌PCR擴(kuò)增引物：341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）；真菌PCR擴(kuò)增引物：ITS1FI2（5’-GTGARTCATCGAATCTTTG-3’）和ITS2（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性30 s，35 個(gè)循環(huán)（98 ℃變性10 s；54 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s），最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系：Phusion Hot start flex 2×Master Mix 12.5 μL，正、反向引物各2.5 μL，DNA模板50 ng，使用dd H2O補(bǔ)齊體系至25 μL。

高通量測(cè)序得到RawData后，通過(guò)Overlap拼接雙端數(shù)據(jù)，并進(jìn)行質(zhì)控、嵌合體過(guò)濾等操作以獲得高質(zhì)量的CleanData。同時(shí)，通過(guò)DADA2（divisive amplicon denoising algorithm）軟件重復(fù)操作以提高生物信息分析的質(zhì)量。對(duì)具有100%相似性的有效序列進(jìn)行聚類，并將這些序列分類為擴(kuò)增子序列變體（amplicon sequence variant，ASV）。在各ASV特征序列的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行多樣性分析、物種分類注釋和差異分析等數(shù)據(jù)分析。采用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)，分別對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)、真菌ITS3～I(xiàn)TS4區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序分析，由聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司（杭州）協(xié)助完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)。通過(guò)SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及Spearman相關(guān)性分析；采用單因素方差分析判斷差異顯著性（P＜0.05）；利用Origin 8.6軟件繪制圖表，并進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酸含量及pH值變化

醬香白酒的固態(tài)發(fā)酵工藝導(dǎo)致微生物及風(fēng)味物質(zhì)空間分布存在差異[10]。隨著發(fā)酵的進(jìn)程，2輪次整體pH值（3.585±0.035～3.790±0.010）比1輪次（3.715±0.050～4.597±0.050）低（圖2a、b）。其中1輪次pH值從5 d開(kāi)始快速下降，2輪次從10 d開(kāi)始快速下降，酒醅pH值下降表示此時(shí)微生物快速產(chǎn)酸。到達(dá)發(fā)酵30 d（發(fā)酵終點(diǎn)）pH值基本一致，說(shuō)明最終兩個(gè)輪次的酒醅微生物到達(dá)所能耐受的最低pH值[13]。

圖2 1、2輪次窖池酒醅pH值及總酸含量變化Fig.2 Changes in pH and total acid in fermented grains during the first and second rounds of fermentation

1 輪次總酸含量（（0.379±0.005）～（3.706±0.005）g/kg）比2輪次總酸（（2.032±0.02）～（4.606±0.05）g/kg）低（圖2c、d）。多數(shù)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)上、中、底層總酸差異顯著，總酸變化規(guī)律多數(shù)為底層＞中層＞上層，說(shuō)明底層生酸微生物占據(jù)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。

2.2 1、2輪次窖池酒醅酸類化合物結(jié)構(gòu)及分布

從1、2輪次酒醅中共檢測(cè)出7 種主要酸類化合物（乳酸、乙酸、甲酸、琥珀酸、草酸、檸檬酸和酒石酸）。如圖3所示，JYU、JYM、JYB分別為1輪次上、中、底層的酒醅樣品，1輪次酒醅中乳酸和乙酸始終保持優(yōu)勢(shì)占比，其他酸類化合物占比較小。1輪次上、中和底層酒醅酸類化合物的含量存在規(guī)律性波動(dòng)，均呈現(xiàn)先減少后增加趨勢(shì)，在30 d時(shí)達(dá)到最高值。乳酸含量為底層＞中層＞上層，上層從（5.888±0.265）g/kg（0 d）變化到（19.808±0.857）g/kg（30 d），中層從（6.558±0.416）g/kg（0 d）變化到（21.774±0.281）g/kg（30 d），底層從（6.753±0.342）g/kg（0 d）變化到（20.382±0.288）g/kg（30 d）；乙酸含量為中層＞底層＞上層，上層從（5.940±0.334）g/kg（0 d）變化到（15.761±0.566）g/kg（30 d），中層從（6.573±0.291）g/kg（0 d）變化到（16.505±0.057）g/kg（30 d），底層從（6.777±0.357）g/kg（0 d）變化到（21.639±0.498）g/kg（30 d）。其他酸類化合物含量均在（1.937±0.642）g/kg以下，并且在1輪次整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的變化較小。

圖3 1輪次窖池發(fā)酵酒醅中各酸類化合物含量變化Fig.3 Changes in organic acid contents in fermented grains during the first round of fermentation

如圖4所示，JEU、JEM、JEB分別為2輪次上、中、底層的酒醅樣品，2輪次與1輪次酒醅酸類化合物變化規(guī)律類似。乳酸含量為底層＞中層＞上層，上層從（5.937±0.541）g/kg（0 d）變化到（28.196±0.949）g/kg（30 d），中層從（6.490±0.365）g/kg（0 d）變化到（31.272±0.518）g/kg（30 d），底層從（6.769±0.387）g/kg（0 d）變化到（29.868±0.317）g/kg（30 d）；乙酸含量為上層＞中層＞底層，且差異明顯，上層從（5.940±0.414）g/kg（0 d）變化到（12.207±0.595）g/kg（30 d），中層從（6.648±0.512）g/kg（0 d）變化到（11.927±0.329）g/kg（30 d），底層從（6.491±0.395）g/kg（0 d）變化到（10.861±0.916）g/kg（30 d）。其他酸類化合物含量均在（3.505±0.861）g/kg以下。

圖4 2輪次窖池發(fā)酵酒醅中各酸類化合物含量變化Fig.4 Changes in organic acid contents in fermented grains during the second round of fermentation

乳酸可通過(guò)Lactobacillus進(jìn)行的磷酸己糖途徑發(fā)酵產(chǎn)生[14]，乙酸主要由酒醅中Saccharomyces的醇酰基轉(zhuǎn)移酶途徑產(chǎn)生[15]。2 種酸具有優(yōu)勢(shì)占比的原因可能是在發(fā)酵階段，Pichia kudriavzevii、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Zygosaccharomyces bailii及Lactobacillusspp.均大量表達(dá)了丙酮酸代謝中與乙酸和乳酸相關(guān)的酶[16]，但不同空間結(jié)構(gòu)微生物群落具有差異性[10]，因此，酒醅中乳酸和乙酸含量隨發(fā)酵時(shí)間和空間結(jié)構(gòu)改變而發(fā)生變化。

2.3 細(xì)菌及真菌群系結(jié)構(gòu)演替

2.3.1 基于屬水平細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)變化

白酒釀造發(fā)酵過(guò)程是微生物的代謝及調(diào)控過(guò)程，微生物在其中發(fā)揮著重要作用[17]。如圖5 所示，從1 輪次酒醅中共檢出150 個(gè)主要細(xì)菌屬，其中Limosilactobacillus是最主要的優(yōu)勢(shì)菌群，其上、中、底層不同空間的平均相對(duì)豐度分別為46.59%、53.73%和52.06%；其次是Lactobacillus（27.74%、28.38%和27.15%）和Acetobacter（8.05%、6.19%和7.95%）。從2輪次酒醅中共檢出201 個(gè)主要細(xì)菌屬，Limosilactobacillus占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其相對(duì)豐度分別為73.98%（上層）、83.75%（中層）和89.87%（底層）。同樣，Wang Huan等[18]在醬香白酒釀造過(guò)程也觀察到Lactobacillus和Acetobacter為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。Zhu Chutian等[19]揭示了不同地區(qū)大曲微生物群落和功能特征不同。任宇婷等[20]對(duì)比了3 種大曲優(yōu)勢(shì)微生物群落，也發(fā)現(xiàn)大曲中Limosilactobacillus的平均相對(duì)豐度較高。本研究中檢出Limosilactobacillus，在其他醬香白酒報(bào)道中鮮有檢出，因此推測(cè)Limosilactobacillus可能來(lái)源于大曲。

圖5 1、2輪次窖池發(fā)酵酒醅中主要細(xì)菌屬相對(duì)豐度堆積柱狀圖Fig.5 Relative abundance of bacterial genera in fermented grains in the first and second rounds of fermentation

在發(fā)酵進(jìn)程中不同時(shí)間上、中、底層酒醅微生物群系差異較大。1輪次發(fā)酵至5 d時(shí)Limosilactobacillus在上、中、底層的相對(duì)豐度分別為58.15%、58.05%和61.65%，25 d時(shí)相對(duì)豐度分別為32.56%、47.42%和16.16%；而Lactobacillus發(fā)酵至5 d時(shí)上、中、底層的相對(duì)豐度分別為27.81%、20.85%和33.76%，10 d時(shí)相對(duì)豐度分別為38.81%、43.27%和42.38%，25 d時(shí)相對(duì)豐度分別為25.56%、31.05%和16.20%。說(shuō)明10 d后Lactobacillus取代Limosilactobacillus成為發(fā)酵優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，但隨著酒醅中酸類化合物的積累，對(duì)Lactobacillus自身造成一定的酸脅迫，當(dāng)其細(xì)胞處于高濃度酸性環(huán)境中，胞內(nèi)H＋逐漸積累使得pH值降低，會(huì)破壞嘌呤堿基的完整性，影響細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝相關(guān)酶的活性，最終導(dǎo)致Lactobacillus生長(zhǎng)受限制甚至死亡[21]。因此，25 d時(shí)Lactobacillus的相對(duì)豐度減少。Acetobacter發(fā)酵至5 d時(shí)在上、中、底層的相對(duì)豐度分別為0.37%、2.47%和0.11%，10 d時(shí)相對(duì)豐度分別為8.30%、1.30%和0.51%，25 d時(shí)相對(duì)豐度分別為8.15%、2.92%和20.72%。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)和總酸含量的增加，Acetobacter的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)與Lactobacillus相反，Acetobacter在適應(yīng)酸性條件時(shí)，可能逐漸對(duì)更高濃度的乙酸產(chǎn)生耐受性[22]。窖池酒醅發(fā)酵中乙酸的含量位居各類酸類化合物中第二，而Acetobacter可在高含量乙酸的環(huán)境中實(shí)現(xiàn)相對(duì)豐度的增加，說(shuō)明Acetobacter具有良好的耐乙酸特性。

2.3.2 基于屬水平真菌群落動(dòng)態(tài)變化

從1輪次酒醅中共檢出69 個(gè)主要真菌屬，2輪次酒醅中共檢出58 個(gè)主要真菌屬。1、2輪次真菌屬多樣性少于細(xì)菌屬。如圖6所示，隨著發(fā)酵周期進(jìn)行，真菌屬多樣性及其相對(duì)豐度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，不僅醬香白酒發(fā)酵過(guò)程如此，在其他香型白酒發(fā)酵過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)此趨勢(shì)[23]。說(shuō)明在白酒釀造窖池發(fā)酵中細(xì)菌占據(jù)發(fā)酵優(yōu)勢(shì)。1、2輪次酒醅中優(yōu)勢(shì)真菌屬在上、中和底層的多樣性及相對(duì)豐度差異比細(xì)菌屬更大，可能是由于大多細(xì)菌為單細(xì)胞并具有鞭毛結(jié)構(gòu)，可以在發(fā)酵過(guò)程中更加分散在空間各位置中[24]。

圖6 1、2輪次窖池發(fā)酵酒醅真菌屬相對(duì)豐度堆積柱狀圖Fig.6 Relative abundance of fungal genera in fermented grains in the first and second rounds of fermentation

1輪次酒醅中6 個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬，Saccharomyces是最主要的優(yōu)勢(shì)菌群，其不同空間的平均相對(duì)豐度分別為54.27%、54.27%和58.82%，其次是Torulaspora（32.48%、30.81%和32.50%）。此外，Paecilomyces、Saccharomycopsis、Monascus和Thermomyces也是優(yōu)勢(shì)菌屬。王琳[25]從窖池酒醅中檢出優(yōu)勢(shì)真菌屬為Schizosaccharomyces、Saccharomyces、Zygosaccharomyces和Monascus等，與本研究檢出優(yōu)勢(shì)真菌屬一致，但上、中、底層優(yōu)勢(shì)真菌屬結(jié)構(gòu)及分布仍存在差異，且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物量下降，真菌在發(fā)酵后期檢出量減少[26]。2輪次酒醅中共有8 個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬，主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)菌屬是Candida、Kazachstania和Saccharomyces。

由于醬香白酒屬于半開(kāi)放式發(fā)酵，Paecilomyces、Penicillium和Monascus等霉菌屬可能來(lái)自釀造環(huán)境[27]。霉菌在1、2輪次酒醅上層占據(jù)優(yōu)勢(shì)，在中層和底層的多樣性及平均相對(duì)豐度均有降低，而酵母屬在底層占據(jù)優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明窖池底層環(huán)境的變化更適宜酵母菌生長(zhǎng)，可能是因?yàn)榫契讓拥膒H值較低，在酸性環(huán)境中酵母菌生長(zhǎng)得更快[28]。這與之前研究中發(fā)現(xiàn)底層為更適宜酵母菌群生存的環(huán)境結(jié)果一致[14]。

2.4 1、2輪次窖池酒醅總酸及酸類化合物與微生物群落相關(guān)性

如圖7a、b所示，Limosilactobacillus與總酸和酸類化合物（乳酸、乙酸、甲酸、草酸、檸檬酸和酒石酸）呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），說(shuō)明除Lactobacillus產(chǎn)酸外，Limosilactobacillus也是發(fā)酵酒醅中產(chǎn)酸的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬[29]。Lactobacillus、Acetobacter、Lentilactobacillus、Lacti plantibacillus、Companilactobacillus、Ligilactobacillus、Levilactobacillus與酸類化合物呈負(fù)相關(guān)。一般而言，上述菌屬產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，但在本研究中發(fā)現(xiàn)它們與酸性物質(zhì)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。醬香白酒固態(tài)發(fā)酵過(guò)程屬于酸性環(huán)境，隨著酸類化合物的增加，pH值降低，菌群在長(zhǎng)期（發(fā)酵時(shí)間30 d）酸脅迫的防御機(jī)制中，細(xì)胞內(nèi)精氨酸脫亞胺酶和天冬氨酸的積累以及耐酸反應(yīng)使細(xì)胞質(zhì)pH值降低，進(jìn)一步使其糖酵解酶的活性被破壞，進(jìn)而造成大分子物質(zhì)（DNA和蛋白質(zhì)）的結(jié)構(gòu)損傷[30]，導(dǎo)致其生物量降低。并且在酸性發(fā)酵酒醅中，這些菌群與其他微生物也存在生物學(xué)競(jìng)爭(zhēng)，也會(huì)導(dǎo)致其產(chǎn)酸能力的減弱，從而降低代謝活性[31]。此外，耐酸特性及其性狀也受到多個(gè)基因復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)[32]。這可能導(dǎo)致酸類化合物的積累，造成這些細(xì)菌屬的生長(zhǎng)受到抑制。Schizosaccharomyces、Zygosaccharomyces、Candida和Kazachstania與酸類化合物呈正相關(guān)，說(shuō)明真菌屬對(duì)酸類化合物的產(chǎn)生也有所貢獻(xiàn)。例如，酵母可通過(guò)糖酵解途徑分解糖類物質(zhì)，生成酸類化合物如丙酮酸、琥珀酸[33]。但也存在少許真菌屬Saccharomyces、Paecilomyces和Torulaspora與酸類化合物呈負(fù)相關(guān)。根據(jù)相關(guān)性分析的結(jié)果，可以初步推斷1、2輪次酒醅中真菌群落促進(jìn)酸類化合物的合成并使其抑制細(xì)菌群落的生長(zhǎng)。有研究表明，高豐富度和多樣性的真菌群落有利于有機(jī)酸的產(chǎn)生，而過(guò)高的細(xì)菌群落會(huì)使揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)降低[34]，從而導(dǎo)致醬香型白酒的質(zhì)量降低。

圖7 酒醅中細(xì)菌和真菌與酸類化合物的相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis of bacteria and fungi with acids in fermented grains

3 結(jié)論

醬香型白酒1輪次窖池發(fā)酵過(guò)程的總酸含量略低于2輪次，2 個(gè)輪次的總酸含量規(guī)律多為底層＞中層＞上層。從1、2輪次窖池酒醅中共檢出7 種主要的酸類化合物，乳酸和乙酸含量始終保持優(yōu)勢(shì)占比，且不同時(shí)空窖池徑向?qū)用嫔纤犷惢衔锎嬖陲@著差異。從醬香型白酒1輪次窖池發(fā)酵過(guò)程共檢出150 個(gè)主要細(xì)菌屬，69 個(gè)主要真菌屬。上層優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為L(zhǎng)imosilactobacillus、Lactobacillus、Acetobacter、Lentilactobacillus、Lacti ptibacillus、Companilactobacillus、Ligilactobacillus、Levilactobacillus；中層優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為L(zhǎng)imosilactobacillus、Lactobacillus、Acetobacter、Lentilactobacillus、Lactiplantibacillus、Com panilactobacillus；底層優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為L(zhǎng)imosilactobacillus、Lactobacillus、Acetobacter、Lentilactobacillus、Lactiplantibacillus、Ligilactobacillus，Limosilactobacillus占絕對(duì)主導(dǎo)地位。上層優(yōu)勢(shì)真菌屬為Saccharomyces、Torulaspora、Paecilomyces、Saccharomycopsis、Monascus、Thermomyces；中層優(yōu)勢(shì)真菌屬為Saccharomyces、Torulaspora、Paecilomyces、Monascus；底層優(yōu)勢(shì)真菌屬為Saccha romyces、Torulaspora、Paecilomyces。從2輪次窖池發(fā)酵過(guò)程中共檢出201 個(gè)主要細(xì)菌屬，58 個(gè)主要真菌屬。上層優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為L(zhǎng)imosilactobacillus、Acetobacter、Virgibacillus、Lentilactobacillus、Kroppenstedtia、Lactobacillus；中層優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為L(zhǎng)imosilactobacillus、Acetobacter、Lactobacillus；底層優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為L(zhǎng)imosilactobacillus、Aetobacter。上層優(yōu)勢(shì)真菌屬為Candida、Kazachstania、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Thermomyces、Thermoascus和Saccharomycopsis；中層優(yōu)勢(shì)真菌屬為Candida、Saccharomyces、Kazachstania、Schizosaccharomyces、Thermoascus、The rmomyces 和Penicillius；底層優(yōu)勢(shì)真菌屬為Candida、Saccharomyces、Kazachstania、Schizosaccha romyces、Zygosaccha romyces、Penicillius、The rmoascus、The rmomyces和Saccharomycopsis。1、2輪次窖池發(fā)酵過(guò)程中微生物群系既存在相似性，同時(shí)差異性也較明顯。

細(xì)菌屬與大多酸類化合物（乳酸、乙酸、甲酸、草酸、檸檬酸和酒石酸）之間呈負(fù)相關(guān)，但Limosilactobacillus相對(duì)豐度與總酸和酸類化合物含量呈正相關(guān)。真菌屬中Schizosaccharomyces、Zygosaccharomyces、Candida和Kazachstania相對(duì)豐度與酸類化合物含量呈正相關(guān)；Saccharomyces、Paecilomyces和Torulaspora相對(duì)豐度與酸類化合物含量呈負(fù)相關(guān)。此研究為醬香白酒窖池發(fā)酵不同時(shí)空徑向的微生物群系與酸類化合物相關(guān)性作用機(jī)制的研究提供了進(jìn)一步理論參考。