楊修鎮(zhèn)，劉霄飛，李玉姣，趙豐華，張桂萍

（山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，山東 濟(jì)南 250010）

囊狀幼蟲(chóng)病和麻痹病為蜜蜂養(yǎng)殖過(guò)程中常見(jiàn)的病毒性傳染病[1]，治療主要使用抗病毒類(lèi)藥物。常見(jiàn)的抗病毒類(lèi)藥物主要有金剛烷胺、金剛乙胺、利巴韋林、嗎啉胍和阿昔洛韋，其中蜂蜜中金剛烷胺、金剛乙胺、嗎啉胍和阿昔洛韋殘留檢測(cè)方法已有研究[2-3]，而利巴韋林殘留檢測(cè)尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。利巴韋林是廣譜強(qiáng)效抗病毒藥物[4]，有公開(kāi)申請(qǐng)的專(zhuān)利[5]使用利巴韋林治療蜜蜂麻痹病，說(shuō)明利巴韋林在蜜蜂養(yǎng)殖過(guò)程中是有使用的。農(nóng)業(yè)部在2005年頒布的《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第560 號(hào)》將從人用藥物移植獸用的利巴韋林等抗病毒藥物從獸藥中移除。雖然2019年發(fā)布的《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250 號(hào)》食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單中并未列入利巴韋林，但利巴韋林目前未被再次批準(zhǔn)為獸藥，依據(jù)《獸藥管理?xiàng)l例》禁止使用人用藥、原料藥及未經(jīng)國(guó)家批準(zhǔn)或已淘汰的獸藥，利巴韋林屬于畜牧生產(chǎn)過(guò)程中禁止使用的藥物。為建立蜂蜜中利巴韋林殘留檢測(cè)方法，本試驗(yàn)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)其進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 TQ-S 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)沃特斯公司）；PL-602E/02 電子天平（感量0.01 g,瑞士Mettler 公司）；XPE205 電子天平（感量0.00001 g，瑞士Mettler 公司）；UVS-1 小型渦旋混勻器（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）；VX-Ⅲ多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）；CR-21G 離心機(jī)（日本日立工業(yè)株式會(huì)社）；UGC-45C 圓形水浴氮吹儀（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）；IQ7000 超純水器（美國(guó)Milli-Q 公司）。

1.1.2 試劑 利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.9%，Dr. Ehrenstorfer 公司）；13C5-利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.9%，Dr. Ehrenstorfer 公司）；混合型陽(yáng)離子交換固相萃取小柱（500 mg，6 mL，美國(guó)Agilent 公司）；有機(jī)濾膜（0.22 μm）；蜂蜜（山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心提供）；甲酸、甲醇為色譜純；水為一級(jí)水，其余試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品和13C5-利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用甲醇溶解并配制成濃度分別為1 mg/mL 的儲(chǔ)備液。用移液器分別移取1 mg/mL 的利巴韋林儲(chǔ)備液和13C5-利巴韋林儲(chǔ)備液各100 μL，分置100 mL 容量瓶中，用10%（V/V）甲醇溶液配制成濃度各為1 μg/mL的溶液。用單標(biāo)線吸量管吸取1 μg/mL 的13C5-利巴韋林溶液1 mL，置10 mL 容量瓶中，用10%（V/V）甲醇溶液配制成濃度為 100 ng/mL 的13C5-利巴韋林溶液。

1.2.2 樣品前處理 稱(chēng)取蜂蜜樣品2±0.01 g，置50 mL 離心管中，依據(jù)參考文獻(xiàn)[6-11]方法，用移液器加入100 ng/mL13C5-利巴韋林溶液100 μL，渦旋混勻，放置10 min，再加入2%（V/V）甲酸溶液10 mL，振搖提取5 min，8 000 r/min 離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入另一個(gè)50 mL 離心管中，備用。

取備用液全部通過(guò)經(jīng)5 mL 甲醇、5 mL 水活化后的混合型陽(yáng)離子交換固相萃取小柱，再依次用水5 mL、2%（V/V）甲酸溶液5 mL、甲醇5 mL 淋洗，抽干，用5%（V/V）氨水甲醇溶液5 mL 洗脫，40 ℃ 水浴氮?dú)獯蹈桑瑴?zhǔn)確加入10%（V/V）甲醇溶液1 mL 溶解殘?jiān)?，渦旋1 min，過(guò)濾，供上機(jī)測(cè)定。

1.2.3 色譜條件 利巴韋林極性較大，在普通C18反相色譜柱上幾乎不保留，依據(jù)參考文獻(xiàn)[12]方法，選用 Hypercarb 多孔石墨碳色譜柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：A 相為甲醇，B 相為水，為促進(jìn)離子化兩相均含0.1%（V/V）甲酸；流速：0.25 mL/min；進(jìn)樣體積：2μL。流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.2.4 質(zhì)譜條件 電離模式為ESI+；碰撞氣為氬氣；采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），具體參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 利巴韋林及其內(nèi)標(biāo)檢測(cè)質(zhì)譜參數(shù)

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 用移液器吸取1 μg/mL 的利巴韋林溶液和1 μg/mL 的13C5-利巴韋林溶液適量，分置10 mL 容量瓶中，用10%（V/V）甲醇溶液配制利巴韋林濃度為2、4、10、20、50、100 ng/mL，內(nèi)標(biāo)13C5-利巴韋林濃度均為10 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)測(cè)試。

1.2.6 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)估 取空白洋槐蜜、荊條蜜、棗花蜜、百花蜜各一批，按樣品前處理方法處理至40 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，分別準(zhǔn)確加入10 ng/mL利巴韋林溶液1 mL，渦旋1 min，過(guò)濾，注入高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀，按規(guī)定條件進(jìn)行測(cè)定，所得定量離子峰面積與10 ng/mL 利巴韋林溶液定量離子峰面積進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)各蜂蜜樣品均有不同程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)，且各蜂蜜樣品的基質(zhì)抑制程度差別較大，故定量方法選擇同位素內(nèi)標(biāo)法。

1.2.7 專(zhuān)屬性 依據(jù)參考文獻(xiàn)[13-15]方法取空白蜂蜜樣品進(jìn)行空白試驗(yàn)和空白添加試驗(yàn)。

1.2.8 檢出限和定量限 取空白蜂蜜，添加一定量利巴韋林，按照參考文獻(xiàn)[16]給出的規(guī)則進(jìn)行方法檢出限和定量限的測(cè)定。

1.2.9 方法準(zhǔn)確度 采用空白加標(biāo)法，取不含利巴韋林的蜂蜜樣品3 批，按照2 μg/kg、4 μg/kg、20 μg/kg 添加利巴韋林，每個(gè)濃度點(diǎn)平行測(cè)定5次，計(jì)算回收率，求批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以相應(yīng)利巴韋林濃度與13C5-利巴韋林濃度的比值為橫坐標(biāo)，利巴韋林定量離子峰面積和13C5-利巴韋林定量離子峰面的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）?；貧w方程為：y = 1.3268x -0.0642，曲線的R2為0.9995，在2～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 專(zhuān)屬性評(píng)估

取空白蜂蜜樣品進(jìn)行空白試驗(yàn)和空白添加試驗(yàn)，結(jié)果顯示空白樣品無(wú)干擾（圖2～圖4）。

圖2 利巴韋林及其內(nèi)標(biāo)離子色譜圖

圖3 蜂蜜空白樣品離子色譜圖

圖4 空白蜂蜜添加利巴韋林離子色譜圖

2.3 方法檢出限和定量限

取空白蜂蜜，添加一定量利巴韋林，按照參考文獻(xiàn)的要求，確定本方法檢出限為1 μg/kg，定量限為2 μg/kg。

2.4 方法準(zhǔn)確度

從表3 可以看出，利巴韋林在蜂蜜中的加標(biāo)回收率為67.6%～112.7%，批內(nèi)、批間RSD＜15%，能夠滿足蜂蜜中利巴韋林殘留檢測(cè)的要求。

表3 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

利巴韋林是強(qiáng)極性化合物，其極性與蜂蜜中的主要成分果糖、葡萄糖相近，前處理過(guò)程中無(wú)法采用極性差異進(jìn)行分離凈化。利巴韋林具有弱堿性，果糖、葡萄糖具有弱酸性，依據(jù)這一化學(xué)性質(zhì)差異，前處理采用混合型陽(yáng)離子交換固相萃取的方法實(shí)現(xiàn)了良好分離。

流動(dòng)相的選取比較了甲醇水系統(tǒng)和乙腈水系統(tǒng)，甲醇水系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)更好的分離，毒性低、價(jià)格便宜，故以甲醇水系統(tǒng)為流動(dòng)相，利巴韋林具有弱堿性，0.1%甲酸的加入有利于其離子化。

本文建立的蜂蜜中利巴韋林殘留檢測(cè)方法，前處理方法簡(jiǎn)單，采用固相萃取柱凈化降低了基質(zhì)干擾，同位素內(nèi)標(biāo)法定量準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、靈敏度高，適用于蜂蜜中利巴韋林殘留量的檢測(cè)。