蔣昀軒，楊 亞，魏 凱*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東 泰安 271018；2.山東省泰安市寧陽縣畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心，山東 寧陽）

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）是一種可以引起人和多種動物患病的條件性致病菌。該菌主要導致人和多種動物的肺炎、呼吸道感染、腸炎、腹膜炎、腦膜炎、腹瀉，甚至敗血癥等癥狀[1]。目前，國內(nèi)外已從多種家畜、家禽、野生動物、水生動物體內(nèi)分離到該菌[2]。近年來，關(guān)于肺炎克雷伯氏菌致病的報道越來越多，其已經(jīng)成為除大腸桿菌、沙門氏菌之外常見的條件致病菌[3]。由于抗生素的濫用導致該菌耐藥性不斷增強，全國各地出現(xiàn)了高耐藥性菌株，大大增加了該菌所致疾病的發(fā)生率和死亡率，給臨床治療帶來嚴重困難，也給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失[4]。2022年7月，山東萊蕪某養(yǎng)羊場出現(xiàn)黑山羊乳羔羊死亡情況，患病羊發(fā)病急促，眼珠泛紅，被毛凌亂，呼吸困難，原地打轉(zhuǎn)且伴有一定的神經(jīng)癥狀，兩天后精神沉郁，食欲減退，高燒不退，精神萎靡，隨后便倒地死亡。對死亡羔羊進行剖解檢查，可見皮下水腫，肺臟內(nèi)部出現(xiàn)淤血，表面有大的出血點與出血斑，肝臟腫大，大網(wǎng)膜充血出血，腸系膜淋巴結(jié)出血，并且表現(xiàn)一定程度的敗血癥癥狀。

本實驗室通過細菌的分離純化、生化試驗、藥敏實驗等方法，對萊蕪黑山羊的肺臟、肝臟等組織器官進行細菌學檢查，分離到一株羊源肺炎克雷伯氏菌，旨在為臨床上肺炎克雷伯氏菌的防治與耐藥性的研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 從山東濟南萊蕪區(qū)某養(yǎng)羊場收集到萊蕪黑山羊尸體，采用無菌操作解剖并采集了2 只病羊的肝臟與肺臟病料。

1.1.2 主要試劑及試驗動物 瓊脂糖粉、核酸染料均購自TaKaRa 公司；LB 培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基、新鮮綿羊血培養(yǎng)基購自青島海博試劑有限公司；藥敏片由本實驗室保存；細菌DNA 提取試劑盒購自康為世紀有限公司；革蘭氏染色試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；SPF 級昆明小鼠購自山東鵬悅實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 分離株的分離培養(yǎng) 用酒精燈消毒過的剪刀燒烙肝臟和肺臟表面，并剪取肝臟和肺臟內(nèi)部的組織0.5 g 于10 mL 離心管中，然后將病料組織剪碎，加入3～4 顆滅菌后的鋼珠以及5 mL 生理鹽水，使用全自動組織研磨機研磨5 min。在超凈臺中用接種環(huán)蘸取病料研磨液在麥康凱培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基、新鮮綿羊血瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，并做好標記，放入37 ℃溫箱過夜培育，24 h 后觀察菌落形態(tài)特征，挑取典型菌落進行純培養(yǎng)。

1.2.2 革蘭氏染色 使用革蘭氏染色試劑盒將分離純化到的菌液進行革蘭氏染色，觀察細菌的形態(tài)特征和染色特征。

1.2.3 分離株的細菌質(zhì)譜儀鑒定 用滅菌的槍頭輕輕蘸取伊紅美藍培養(yǎng)基上的單菌落均勻涂布于MSP 96 target polished steel BC 上，然后滴加濃度為 70%的甲酸1 μL，晾干后再加入基質(zhì)溶液1 μL，使用布魯克全自動快速生物質(zhì)譜檢測儀鑒定。

1.2.4 分離株的PCR 檢測 根據(jù)文獻設計羊源肺炎克雷伯氏菌特異性鑒定引物：KpYF5'-GCGG TCTGTCAAGTCGGATGTG-3' KpYR5'-CATCGT TTACGGCGTGGACTACC-3'，交由北京擎科生物有限公司合成。

將純化后培養(yǎng)的細菌肉湯取5 mL，使用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取細菌DNA 作為模板，加入到反應體系中進行PCR 擴增（表1）。按照反應條件進行擴增：預變性94 ℃ 6 min；變性 95 ℃ 30 s；退火 55 ℃ 30 s；延伸 72 ℃1 min；35 個循環(huán)；延伸72 ℃ 10 min。反應結(jié)束后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的條帶大小。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，送到青島擎科生物技術(shù)有限公司進行雙向測序，測序結(jié)果通過NCBI 數(shù)據(jù)庫進行BLAST，比較其同源性。

1.2.5 分離株的生化試驗 將分離到的菌液肉湯按照說明書要求，加入到各種類型的生化反應管中，37 ℃ 培養(yǎng)24～48 h 后觀察細菌生化反應特性。所有試驗操作過程均在超凈臺中進行，避免實驗室污染對試驗結(jié)果造成影響。

1.2.6 小鼠的致病性試驗 通過倍比稀釋的方法測的菌液濃度為2x109CFU，根據(jù)菌液濃度，同時設立感染組15 只和空白對照組15 只。將菌液肉湯給小鼠進行腹腔注射（200 μL/只）?？瞻捉M每只注射200 μL 生理鹽水。在小鼠死亡后采集小鼠心血加入LB 肉湯中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.7 分離株的藥敏試驗 通過倍比稀釋涂板，24 h 后測量菌液CFU，然后將分離純化的細菌接種于普通LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。根據(jù)測量的菌落CFU 單位對菌液進行定量后涂板，稍干后共選取20 種藥敏片分別平鋪在培養(yǎng)基表面，37 ℃ 過夜培養(yǎng)，用直尺測量培養(yǎng)基上抑菌圈直徑大小。分離菌株的藥敏試驗參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）推薦的標準K-B 紙片法進行，以抑菌圈直徑（mm）表示該藥對特定細菌的敏感程度，分別用敏感（S）、中度敏感（I）、耐藥（R）表示。

2 結(jié)果

2.1 分離株細菌形態(tài)學上的觀察

利用細菌分離的方法，從本次的病料中獲得一株疑似肺炎克雷伯氏菌分離株，分別在LB 瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基、新鮮綿羊血培養(yǎng)基進行劃線培養(yǎng)，24 h 觀察到在LB 培養(yǎng)基上形成灰白色、邊緣整齊、圓形突起、濕潤且粘稠的菌落，使用接種環(huán)可以輕易拉成絲（圖1 A）；在麥康凱培養(yǎng)基上呈現(xiàn)大片粉紅色菌落（圖1 B）；在伊紅美藍培養(yǎng)基上形成灰白色、邊緣整齊、圓形突起、濕潤且粘稠的菌落（圖1 C）；在新鮮綿羊血培養(yǎng)基上形成白的粘稠狀菌落，且不溶血（圖1 D）。

2.2 革蘭氏染色鏡檢

將分離株進行革蘭氏染色，使用油鏡觀察后發(fā)現(xiàn)視野中分離菌株為紅色，呈短桿狀形態(tài)，表明其為革蘭氏陰性菌（圖2）。

圖2 分離菌株革蘭氏染色結(jié)果（100x）

2.3 分離株的生化試驗結(jié)果

分離株的生化試驗結(jié)果顯示，賴氨酸脫羧酶、尿素酶、甘露醇、枸櫞酸鹽、VP 試驗、核糖醇、棉子糖、山梨醇、蜜二糖、試驗均為陽性；吲哚、硫化氫、蛋白胨水、甲基紅試驗、苯丙氨酸、鳥氨酸脫羧酶試驗為陰性（表2）。分離株的生化特性結(jié)果同《臨床常見細菌鑒定手冊》的肺炎克雷伯氏菌的生化特性相符合。根據(jù)生化試驗結(jié)果，初步判定分離菌為肺炎克雷伯氏菌。

圖3 分離菌株在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)

表2 分離株生化試驗結(jié)果圖

2.4 小鼠致病性試驗

感染組小鼠腹腔注射菌液后，在24 h 內(nèi)陸續(xù)死亡，死亡前被毛凌亂、呼吸加重、精神萎靡、食欲不振，還有部分全身顫抖、眼睛緊閉。剖解死亡的感染組小鼠，發(fā)現(xiàn)其腹腔出現(xiàn)大量粘連液體，成膠凍狀，肝臟、肺臟出現(xiàn)大量出血點、壞死，脾臟腫大。取其心血，肺臟、肝臟研磨液，使用LB 肉湯繼續(xù)進行細菌培養(yǎng)，通過革蘭氏染色鏡檢結(jié)果顯示，該分離株與病羊肺臟、肝臟組織中分離到的細菌相同，且對照組無異常反應。

2.5 PCR 檢測結(jié)果

使用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取細菌DNA 作為模板，進行特異性PCR 鑒定，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖核酸電泳，結(jié)果如圖3 所示，目的條帶大小與預期結(jié)果一致。瓊脂糖凝膠經(jīng)回收后送到青島擎科生物有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST 分析比對，該菌株部分基因序列與肺炎克雷伯氏菌同源性達99%，確定該菌為羊源肺炎克雷伯氏菌。

圖3 PCR 鑒定結(jié)果

2.6 藥敏試驗結(jié)果

根據(jù)藥敏試驗說明書的說明，判斷各種藥物的抑菌圈直徑，發(fā)現(xiàn)羊源的分離菌KpY1、KpY2對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類等大多數(shù)藥物均為敏感，對磺胺間甲氧和阿莫西林表現(xiàn)耐藥（表3）。

3 討論與結(jié)論

目前，肺炎克雷伯氏菌已經(jīng)與大腸桿菌、沙門氏菌一樣，對人類健康以及畜牧業(yè)構(gòu)成威脅的常見的細菌病原體之一[5]。在我國的畜牧生產(chǎn)中，養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)逐漸形成了一種完整的產(chǎn)業(yè)鏈，對經(jīng)濟發(fā)展起著十分重要的作用，嚴格控制養(yǎng)羊場各種疫病的發(fā)生以及病原的感染與傳播對養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展至關(guān)重要[6]。羊源肺炎克雷伯氏菌作為一種危害性強的條件致病菌，當符合發(fā)病條件時，會對人和動物機體和健康造成嚴重的影響。羊源肺炎克雷伯氏菌感染后主要引起呼吸困難、肺炎、腦膜炎、全身敗血癥以及一定的神經(jīng)癥狀，最終使病羊因呼吸系統(tǒng)衰竭而死亡[7]。因此，對于羊源肺炎克雷伯氏菌需要建立有效的預防措施，為養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展起到有效的保護作用。肺炎克雷伯氏菌作為在臨床上僅次于大腸桿菌與沙門氏菌的條件致病菌，與預防和治療有著密不可分的聯(lián)系，抗生素的濫用導致了多重耐藥性菌株的出現(xiàn)。本次試驗分離到肺炎克雷伯氏菌致病性強，耐藥性弱，對多種藥物敏感，為臨床藥物的研究提供了支持與依據(jù)[8]。同時本次病料檢測時還發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌的存在，表明肺炎克雷伯氏菌易與其他細菌混合感染，造成治療難度增加，提示相關(guān)從業(yè)人員與政府部分應提高警惕，做好對混合發(fā)病感染的預防和研究，一旦暴發(fā)疾病，迅速根據(jù)其發(fā)病規(guī)律，制定科學合理的治療手段。

本研究是將由羊肺臟、肝臟中分離到的菌株通過細菌的形態(tài)學觀察、動物致病性試驗、生化試驗、藥敏試驗、PCR 檢測等方法，從多個方面鑒定并確定了分離菌株為有較高致病性的肺炎克雷伯氏菌。藥敏試驗的結(jié)果顯示，羊源的肺炎克雷伯氏菌對大多數(shù)抗生素類藥物敏感，只對阿莫西林和磺胺間甲氧表現(xiàn)為耐藥，表明目前從萊蕪黑山羊病料中分離到的肺炎克雷伯氏菌的耐藥性不強，沒有出現(xiàn)多重耐藥性，說明還具有一定的預防價值，并且對于下一步檢測方法的研究具有重大意義，早發(fā)現(xiàn)早治療，能夠起到預防肺炎克雷伯氏菌多重耐藥性發(fā)生的作用。同時本試驗中的數(shù)據(jù)以及相關(guān)耐藥性分析的結(jié)果為動物源肺炎克雷伯氏菌檢測方法的建立提供了數(shù)據(jù)支持。