戴麗莉, 李曉娟, 趙翡翠

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部, 烏魯木齊 830002; 2新疆維吾爾自治區(qū)中藥炮制重點實驗室, 烏魯木齊 830000)

葡萄醋是一種以葡萄為主要原料,利用傳統(tǒng)壓榨發(fā)酵技術(shù)釀造、富有新疆地域特色的民族藥和傳統(tǒng)炮制輔料[1-2],具有清熱燥濕、退燒、消炎、止瀉、解毒、化淤血、止痛、驅(qū)蟲等功效[3-4],主要用于制備蜜膏劑、合劑、糖漿劑等。新疆地區(qū)葡萄資源豐富,但目前為止葡萄醋還沒有法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),其中的特征成分研究基礎(chǔ)薄弱,基于葡萄醋方面的藥用開發(fā)利用受限。因此,本研究收集不同產(chǎn)地15批葡萄醋樣品,通過高效液相測定葡萄醋中有機(jī)酸成分的含量,建立葡萄醋中有機(jī)酸成分指紋圖譜[5-7],并結(jié)合化學(xué)模式識別[8-9]篩選葡萄醋質(zhì)量差異的標(biāo)志物,對不同產(chǎn)地葡萄醋的質(zhì)量進(jìn)行評價,為臨床應(yīng)用提供參考,同時為制定葡萄醋合理質(zhì)量控制方法提供研究數(shù)據(jù),為后續(xù)進(jìn)一步研究其葡萄醋炮制發(fā)酵機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器1525型高效液相色譜儀(含2489 型PAD 檢測器,Empower Pro 工作站,美國Waters 公司), Centra-20 型紫外-可見分光光度計(GBC 科學(xué)儀器有限公司), AG-135 型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司),電熱恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療儀器有限公司),電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 試藥酒石酸對照品(批號B25642, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、蘋果酸對照品(批號B20524, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、琥珀酸對照品(批號B20534, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、富馬酸對照品(批號B20937, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、綠原酸對照品(批號B20132, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、乙酸對照品(批號B20236, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)均購于中國食品藥品檢定研究院;乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純。15批不同產(chǎn)地的葡萄醋樣品,來源于新疆不同地區(qū),見表1。

表1 15批葡萄醋來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 葡萄醋中有機(jī)酸含量測定方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件[10-11]XTerra C18色譜柱( 4.6 mm×250 mm,5 μm);填充劑:十八烷基硅烷鍵合硅膠;流動相: 甲醇(A)∶0.5%磷酸水溶液(D)=1∶99, 選擇紫外光檢測器, 檢測波長為210 nm, 進(jìn)樣量: 10 μL,理論塔板數(shù)不少于5 000。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、綠原酸、乙酸對照品0.1 g,加入超純水配置成每1 mL含1 mg混合對照品溶液。見圖1。

注: 橫坐標(biāo), 出峰時間; 縱坐標(biāo), 峰面積。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密量取10 mL葡萄醋和0.25 mL流動相置于分液漏斗中,搖勻,靜置5 min,再精密量取15 mL乙酸乙酯加入分液漏斗中,搖勻萃取,靜置分層,反復(fù)5次,收集上層濾液約75 mL,將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)置干,再于蒸干的圓底燒瓶中加入10mL已經(jīng)濾過的超純水,靜置10 min,再通過0.22 μm的微孔濾膜,即可得到供試品溶液。

2.1.4 精密度試驗 取葡萄醋供試品溶液,對照混合對照品溶液,按色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,分別對共有峰的峰面積比值進(jìn)行考察,酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、綠原酸和乙酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.31%、1.80%、0.81%、2.65%、3.43%和2.44%(n=6),結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.5 重現(xiàn)性試驗 精密量取葡萄醋供試品溶液6份,按制備方法進(jìn)行制備后進(jìn)樣,記錄色譜圖,分別對共有峰的峰面積比值進(jìn)行考察,酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、綠原酸和乙酸的RSD分別為1.38%、 0.28%、 0.39%、 0.17%、 0.85%和0.30%(n=6),結(jié)果表明本方法的重現(xiàn)性較好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取葡萄醋供試品溶液,按制備方法進(jìn)行制備,分別在0,4,8,14,20,24 h進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,分別對共有峰的峰面積比值進(jìn)行考察,酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、綠原酸和乙酸的RSD分別為2.86%、1.10%、0.97%、1.13%、0.48%和3.77%(n=6),結(jié)果表明供試品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 加樣回收試驗 采用加樣回收法,精密量取葡萄醋供試品溶液10 mL,共6份,精密加入每1 mL含酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、綠原酸、乙酸0.5 mg的對照品的溶液10 mL,按供試品制備方法制備溶液,按色譜條件進(jìn)行測定,計算加樣回收率,結(jié)果混合對照品平均回收率分別為100.91%,99.61%,101.72%,100.33%,100.86%,98.74%,RSD分別為0.99%、1.77%、1.56%、1.10%、1.27%、1.67%,表明回收率良好。

2.2 指紋圖譜的建立及相似度評價取15批葡萄醋樣品,按“2.1.1”項下的色譜條件分別進(jìn)行測定,記錄峰面積并計算各共有峰的保留時間和峰面積。將測出的15個圖譜數(shù)據(jù)全部導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012A版)[12-13],以R色譜圖作為參照圖譜,經(jīng)多點校正后,生成葡萄醋的色譜疊加圖和對照指紋圖譜,并進(jìn)行相似度評價。15批葡萄醋樣品的指紋圖譜[14-16]共有峰有11個,通過與混合對照品色譜峰進(jìn)行比對,指認(rèn)出6個共有峰[17-18],分別是酒石酸(1號峰),蘋果酸(2號峰),琥珀酸(3號峰),富馬酸(4號峰),綠原酸(9號峰),乙酸(11號峰)。研究發(fā)現(xiàn)葡萄醋中琥珀酸的含量較高,出峰時間相對適中,且峰型穩(wěn)定,差異較小,分離度較好,故將琥珀酸作為對照峰,計算共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為1.31%～2.00% (n=15)和 83.78%～225.71%(n=15),15批葡萄醋樣品中各成分之間含量差異較大。相似度評價[19]結(jié)果表明新疆新綠寶藥業(yè)、新疆麥迪森藥業(yè)等飲片生產(chǎn)企業(yè)出售的葡萄醋相似度均大于0.900,其余自制葡萄醋樣品的相似度均小于0.900,且不同批次葡萄醋樣品之間相似度相差較大,表明不同地方生產(chǎn)的不同批次葡萄醋中化合物含量存在差異。疊加指紋圖譜見圖2,對照指紋圖譜見圖3。

注: 橫坐標(biāo), 出峰時間; 縱坐標(biāo), 峰面積。

圖3 樣品的 HPLC對照指紋圖譜

2.3 基于化學(xué)模式識別對葡萄醋的分析

2.3.1 聚類分析 以15批葡萄醋樣品的共有峰峰面積為變量,用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件,以組間平方歐氏距離為測度進(jìn)行聚類分析[20-21]:當(dāng)類間距離為25時,15批葡萄醋樣品可聚為2類,S1-S5、S7-S12、S14、S15聚為Ⅰ類,Ⅰ類又可聚為2類,S2、S8和S11聚為Ⅰa類,S1、S3-S5、S7、S9、S10、S12、S14、S15聚為Ⅰb類;S6、S13聚為Ⅱ類,結(jié)果表明15批葡萄醋樣品中各個化合物之間含量差異較大,即使是同一飲片生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的不同批次葡萄醋其含量差異也較大,與相似度評價結(jié)果一致。見圖4。

圖4 15批葡萄醋樣品聚類分析樹狀圖

2.3.2 主成分分析 將15批葡萄醋樣品中11個共有峰對峰面積作折線圖,結(jié)果顯示葡萄醋樣品共有峰的峰面積數(shù)據(jù)擬合度較小,樣本組間差異較大,故采用無監(jiān)督的主成分分析方法[22-25],使用的分析軟件為 SPSS 26.0。見圖5。

圖5 15批葡萄醋樣品峰面積折線圖

利用 SPSS 26.0 軟件,對15 批葡萄醋樣品指紋圖譜中 11 個共有峰峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,再通過主成分分析法進(jìn)行因子分析,以特征值>1 為提取標(biāo)準(zhǔn),總方差結(jié)果顯示,共提取到4個主成分,前4種主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為90.968% ,表明這4種主成分能較好地揭示葡萄醋來源與11種共有成分的相關(guān)性,反映出葡萄醋指紋圖譜中共有峰的大部分信息,見表2。

表2 葡萄醋樣品的主成分結(jié)果

由主成分矩陣可知,第1主成分中,峰 2(蘋果酸)、3(琥珀酸)、5、6、9(綠原酸)有較大載荷值;第2主成分中,峰8、10、11(乙酸)有較大載荷值;第3主成分中,峰 4(富馬酸)有較大載荷值。峰的載荷值與峰對主成分的貢獻(xiàn)成正比,結(jié)果顯示葡萄醋共有峰含量差異的主要成分并非單一成分,而是前4種主成分共同的影響。見表3。

表3 15 批葡萄醋樣品主成分矩陣

結(jié)合碎石圖可知,當(dāng)折線由陡峭突然變得平穩(wěn)時,陡峭到平穩(wěn)對應(yīng)的因子個數(shù)即為參考提取因子個數(shù),從第4個主成分開始,主成分的特征分值開始緩慢地下降,且前4種主成分的累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到 90%以上,因此,再次證明葡萄醋共有峰含量差異的主要成分并非單一成分,而是前4種主成分共同的影響。見圖6。

圖6 15批葡萄醋樣品PCA碎石圖

2.3.3 偏最小二乘判別分析(PLS-DA) 運用SIMCA14. 0 統(tǒng)計學(xué)軟件,以11個共有峰的峰面積為變量,繪制 PLS-DA 得分圖[26-28],可以看出,S13、S7分布于得分圖的左上側(cè),S3、S9、S11分布于得分圖的左下側(cè),S4、S10、S14、S15分布于得分圖的右上側(cè),S1、S2、S5、S6、S8、S12分布于得分圖的右下側(cè),表明15批葡萄醋樣品中共有峰化合物之間含量存在差異。見圖7。

圖7 15 批葡萄醋樣品PLS-DA得分圖

根據(jù)變量權(quán)重要性排序(VIP)可知,7號峰的VIP 值為1.422 68、3號峰(琥珀酸)的VIP 值為1.348 91、9號峰的VIP值為1.120 09 、4號峰(富馬酸)的VIP值為1.042 15,表明篩選出的7、3、9、4號峰可作為鑒別和區(qū)分葡萄醋質(zhì)量差異的標(biāo)志物,其中包括共有峰3號峰(琥珀酸)、4號峰(富馬酸),因琥珀酸較穩(wěn)定,故將琥珀酸作為葡萄醋的特征鑒別成分,并對琥珀酸進(jìn)行含量測定。見圖8。

圖8 PLS-DA模型中共有峰的VIP值

3 葡萄醋樣品中琥珀酸含量測定

3.1 色譜條件同“2.1.1”色譜條件。

3.2 供試品溶液的制備精密量取10 mL葡萄醋和0.25 mL流動相置于分液漏斗中,搖勻,靜置5 min,再精密量取15 mL乙酸乙酯加入分液漏斗中,搖勻萃取,靜置分層,反復(fù)5次,收集上層濾液約75 mL,將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)置干,再于蒸干的圓底燒瓶中加入10 mL已經(jīng)濾過的超純水,靜置10 min,通過0.22 μm的微孔濾膜,即得到供試品溶液。

3.3 對照品溶液的制備精密稱取琥珀酸對照品10.05 mg,加入超純水配置成每1 mL含1 mg對照品的溶液。

3.4 線性關(guān)系考察精密稱量0.016 g琥珀酸于10 mL量瓶中,超純水溶解,定容至刻度線,作為儲備液。精密提取琥珀酸儲備液0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mL,超純水定容至刻度線,測定峰面積。以琥珀酸進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)。以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到琥珀酸標(biāo)品的回歸方程Y=560 965X+7 334.8,R2=0.999 7;結(jié)果表明琥珀酸濃度在0.05～1.6 mg/mL,呈良好的線性關(guān)系[29-30]。

3.5 精密度試驗按“3.2”項下方法,制備葡萄醋供試品溶液,按色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次,計算琥珀酸峰面積的RSD為1.82%,表明儀器精密度良好。

3.6 重復(fù)性試驗按“3.2”項下方法,制備葡萄醋供試品溶液6份,按色譜條件進(jìn)樣,計算琥珀酸峰面積的RSD為1.88%,表明本方法重復(fù)性良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗按“3.2”項下方法,制備葡萄醋供試品溶液,分別在0、6、12、18、24、48 h進(jìn)樣,按色譜條件進(jìn)樣,計算琥珀酸峰面積的RSD值為2.27%,說明樣品溶液在48 h內(nèi)保持穩(wěn)定[31]。

3.8 回收率試驗按“3.2”項下方法,制備葡萄醋供試品溶液6份,每份10 mL,加入琥珀酸0.35 mg,按色譜條件測定,計算加樣回收率[32]得到RSD值為1.14%,見表4。

表4 琥珀酸加樣回收率結(jié)果

3.9 含量測定取15批葡萄醋樣品按“3.2”項下方法制備葡萄醋供試品溶液,按色譜條件進(jìn)樣,測得不同批次樣品的峰面積,計算含量,見表5。

表5 15批葡萄醋樣品中琥珀酸含量

4 討論

4.1 色譜條件的考察葡萄生長環(huán)境、品種、采收時間及釀制時間影響著葡萄醋的質(zhì)量。據(jù)查閱大量參考文獻(xiàn)[33-35]發(fā)現(xiàn),葡萄醋主要含有多種有機(jī)酸,有機(jī)酸不僅影響著葡萄醋的感官特性和穩(wěn)定性,還決定著葡萄醋的酸味質(zhì)量,所以是葡萄醋中一類重要的有機(jī)化合物。

通過前期研究對流動相(乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、甲醇-0.5%磷酸溶液、甲醇-磷酸氫二鈉緩沖溶液),柱溫(20℃、25℃、30℃),供試品前處理的提取溶劑考察(甲醇、50%甲醇、石油醚(60～90℃),流速(0.8、1.0、1.2 mL/min ),以琥珀酸的峰面積、分離度、峰性狀為衡量標(biāo)準(zhǔn),篩選最優(yōu)條件,最終確定流動相為甲醇(A)∶0.5%磷酸水溶液(D)=1∶99,檢測波長為210 nm,柱溫為25℃,流速為1.0 mL/min 。

4.2 建立葡萄醋中有機(jī)酸成分的HPLC特征圖譜前期預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)葡萄醋成品中以有機(jī)酸為主,故采用高效液相法,以有機(jī)酸含量為主要測定指標(biāo),建立了15批葡萄醋中有機(jī)酸含量成分的HPLC指紋圖譜,標(biāo)定了11個共有峰;通過與對照品溶液峰面積進(jìn)行比對,確認(rèn)了6個共有峰,分別是酒石酸(1號峰),蘋果酸(2號峰),琥珀酸(3號峰),富馬酸(4號峰),綠原酸(9號峰),乙酸(11號峰),以琥珀酸為對照峰計算共有峰相對保留時間和相對峰面積,通過計算相似度表明不同地方生產(chǎn)的葡萄醋中共有峰成分含量存在一定差異。

4.3 葡萄醋含量差異分析通過聚類分析將不同產(chǎn)地的15批葡萄醋可以聚為2大類,與主成分分析結(jié)果一致,主成分分析表明結(jié)果顯示造成葡萄醋共有峰含量差異的主要成分并非單一成分,而是前4種成分共同影響的,且15批葡萄醋中共有化合物含量差異大。葡萄醋在全疆作為維吾爾藥、炮制輔料和發(fā)酵食品均在使用,但是沒有明確的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和炮制工藝,其發(fā)酵機(jī)制中參數(shù)沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

因此,通過建立葡萄醋中有機(jī)酸成分指紋圖譜,并結(jié)合化學(xué)模式識別篩選葡萄醋質(zhì)量差異的標(biāo)志物,對不同產(chǎn)地葡萄醋的質(zhì)量進(jìn)行評價,為臨床應(yīng)用提供參考,同時為制定葡萄醋合理質(zhì)量控制方法提供研究數(shù)據(jù),為后續(xù)進(jìn)一步研究其葡萄醋炮制發(fā)酵機(jī)制奠定基礎(chǔ)。