汪 鵬, 周 浪, 趙 義, 林熠斌, 姚 明, 王向磊, 宋圓圓*,,3

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 作物遺傳育種與綜合利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué) 作物生物技術(shù)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué) 閩臺(tái)作物生物育種農(nóng)業(yè)農(nóng)村部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002；4.山東京衛(wèi)制藥有限公司，山東 泰安 271000)

稻田雜草種類多樣，禾本科稗屬 (Echinochloaspp.) 植物是危害最為嚴(yán)重的稻田雜草之一，其中孔雀稗Echinochloa crus-pavonis喜深水田，是一些濕地中的惡性雜草[1]。二氯喹啉酸 (quinclorac)是目前水稻田中應(yīng)用最為廣泛的除草劑品種之一[2]，屬于典型的生長激素類型除草劑，作用機(jī)理主要是通過誘導(dǎo)乙烯的生物合成而抑制稗草生長，雜草中毒后癥狀與生長素過量時(shí)相似，高濃度下表現(xiàn)為對(duì)植物細(xì)胞分裂、節(jié)間延長乃至葉、莖生長的顯著抑制作用，并最終使植株枯黃、壞死[3-5]。二氯喹啉酸能被稗屬雜草吸收進(jìn)入植株體內(nèi)并迅速傳導(dǎo)，進(jìn)一步誘導(dǎo)根部細(xì)胞產(chǎn)生乙烯合成的前體物質(zhì)——1-氨基環(huán)丙基-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC)，再經(jīng)ACC 氧化酶 (ACC oxidase, ACO) 氧化生成乙烯，在此過程中產(chǎn)生的衍生物氫氰酸 (hydrogen cyanide，HCN)累積在稗草組織中能夠抑制稗草的生長[4-7]。因此，二氯喹啉酸誘導(dǎo)乙烯生物合成而引起的氫氰酸積累被認(rèn)為是該除草劑的主要作用機(jī)制[8-9]。

由于頻繁、長期使用二氯喹啉酸，田間已出現(xiàn)對(duì)二氯喹啉酸具有高水平抗性的稗草生物型群體[10-12]。有研究認(rèn)為，稗屬雜草對(duì)二氯喹啉酸抗性的產(chǎn)生是因?yàn)锳CC 合成酶 (ACC synthase，ACS)的活性受到抑制，導(dǎo)致乙烯生物合成的直接前體ACC 含量不足，致使乙烯的生物合成途徑被抑制而造成的[13-14]。β-氰丙氨酸合成酶 (β-cyanoalanine synthase，β-CAS) 活性的提高也可以提升稗屬雜草對(duì)二氯喹啉酸的抗性[15]。水稻葉片中的β-CAS可以降解乙烯生物合成途徑中產(chǎn)生的有毒副產(chǎn)物氫氰酸[16-17]，這也是目前植物中所發(fā)現(xiàn)的氫氰酸降解的唯一途徑。此外，植物體中的一些保護(hù)酶如超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶 (CAT) 和過氧化物酶 (POD) 等也參與了植物對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)，這些酶活性的強(qiáng)弱在一定程度上反映了植物抵抗逆境的能力[18-20]。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 (GSTs) 能夠調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)，解毒代謝產(chǎn)物，維持免疫穩(wěn)態(tài)，在植物抵御非生物脅迫時(shí)也起著重要作用[21-22]。

現(xiàn)今，有關(guān)稗屬雜草對(duì)二氯喹啉酸抗性的研究大多集中在抗性相關(guān)基因方面[23]，從代謝角度進(jìn)行的研究還鮮有報(bào)道。氨基酸廣泛參與植物的蛋白質(zhì)合成及多種代謝過程，進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育與對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)性，而外源施加氨基酸也可作為氮素營養(yǎng)與信號(hào)分子影響植物的生長與抗逆[24-27]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，外源施加L-谷氨酰胺 (L-Gln)、L-天冬酰胺 (L-Asn) 及L-天冬氨酸 (L-Asp) 等氨基酸可促進(jìn)植物生長[23,26]。Saeed 等[24]對(duì)大豆的研究也發(fā)現(xiàn)，添加氨基酸處理顯著提高了大豆地上部分生長參數(shù)、鮮重和莢果產(chǎn)量?？梢姡庠词┘影被嵩谄胶庵参锏漠a(chǎn)量和品質(zhì)，特別是調(diào)節(jié)次級(jí)代謝產(chǎn)物的水平方面發(fā)揮著重要作用。

本研究探索了外源混施L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸對(duì)二氯喹啉酸抗性孔雀稗抗藥性的影響，進(jìn)一步測定了抗性孔雀稗的生物表型及植株體內(nèi)保護(hù)酶系 (SOD、CAT 及POD) 和解毒酶GSTs 的活性變化，并對(duì)乙烯合成通路中ACS、ACO 1和與氰化物解毒相關(guān)的β-CAS基因進(jìn)行了熒光定量PCR 檢測，以期探索外源添加L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液對(duì)抗二氯喹啉酸孔雀稗生長、生理和乙烯信號(hào)途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

對(duì)二氯喹啉酸具有中高水平抗性的孔雀稗Echinochloa crus-pavonis(編號(hào)：3008A-20) 種子由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所李永豐研究員提供[28-29]，整株水平法測得其GR50值為有效成分1519.23 g/hm2，對(duì)二氯喹啉酸的抗性指數(shù)為 8.87[28]。試驗(yàn)土壤取自福建農(nóng)林大學(xué)校園農(nóng)場，過10 mm篩，高壓蒸汽濕熱滅菌2 次 (每次30 min，103 kPa，121 ℃)。

萬分之一電子天平，上海奧豪斯有限公司。RNA 提取試劑盒，上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR 試劑盒，北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥劑配制 50% 二氯喹啉酸可濕性粉劑(quinclorac 50% WP) 購自中國江蘇省激素研究所股份有限公司，用無菌水配制成10 mmol/L 的母液備用；99%L-甲硫氨酸粉末和99%L-半胱氨酸粉末均購自中國上海麥克林生化科技有限公司，用無菌水配制成10 mmol/L 的1:1 等摩爾濃度混合母液備用。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 當(dāng)抗性孔雀稗幼苗生長至12 d(三葉一心左右) 時(shí)分別進(jìn)行以下5 個(gè)處理：對(duì)照CK，僅添加木村B 營養(yǎng)液 (950 mL) (配方見表1)；藥劑處理1～4：分別添加1.2.1 節(jié)中配制得到的10 mmol/LL-甲硫氨酸與L-半胱氨酸1 : 1 等摩爾濃度氨基酸混合母液20、40、60 和80 mL 至木村B 營養(yǎng)液中 (終體積為950 mL)。將抗性孔雀稗幼苗置于上述5 種不同處理營養(yǎng)液中培養(yǎng)15 d (生長至4 葉一心左右) 后進(jìn)行各項(xiàng)生理指標(biāo)的測定；之后再向各處理培養(yǎng)液中分別加入10 mmol/L 的二氯喹啉酸溶液50 mL (終體積為1000 mL，除草劑終濃度為 500 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)3 d 后再進(jìn)行各項(xiàng)生理指標(biāo)的測定。

表1 木村B 營養(yǎng)液配方Table 1 Kimura B nutrient salts formula

1.2.3 試驗(yàn)方法 抗性孔雀稗種子用2% 的NaClO 溶液消毒 10 min，無菌水沖洗干凈后催芽2 d。將露白的種子移栽至裝有滅菌土壤的花盆中培養(yǎng)10 d 后，選取長勢一致的幼苗移栽到12.5 cm ×8.5 cm × 11.0 cm 的六孔水培盒中進(jìn)行水培。每個(gè)試驗(yàn)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù) (3 盒)，每盒3 株，共9 株抗性孔雀稗。將各處理水培盒隨機(jī)擺放在玻璃溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，光周期14 h/10 h (L/D)，維持相對(duì)濕度在75%左右，溫度20～35 ℃。培養(yǎng)期間每天補(bǔ)充木村B 營養(yǎng)液使各處理塑料盒內(nèi)培養(yǎng)液總體積維持在1000 mL。

1.3 測定方法

1.3.1 幼苗生長指標(biāo)測定 分別測量并記錄各處理生長18 d 后抗性孔雀稗的根長 (cm) 和株高 (cm)，其中根長測量范圍為每株植物的最長主根；擦干根系和葉片表面水分，稱量整株鮮重 (g) 和根鮮重 (g)。每個(gè)處理測定9 株植物。

1.3.2 保護(hù)酶和解毒酶活性測定 采集不同處理的抗性孔雀稗葉片各100 mg，加入液氮研磨至粉末狀。分別采用紫外吸收法測定CAT 活性[29]，氮藍(lán)四唑 (NBT) 還原法測定SOD 活性[29]，愈創(chuàng)木酚法測定POD 活性[29]，咖啡酸法測定PPO 活性[30]，二硝基氯苯法測定GSTs 活性[23]。

1.3.3 總RNA 提取和cDNA 合成 分別稱取不同處理的抗性孔雀稗葉片各50 mg，加入液氮研磨至粉末狀，參照Eastep? Super 總 RNA 提取試劑盒說明方法提取葉片總RNA，經(jīng)DNaseI 處理后，吸取 200 ng/μL RNA，采用蘭博利德反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，于 - 80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析 依據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期獲得的抗性型孔雀稗基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[27]，根據(jù)其基因功能注釋結(jié)果，基于浙江大學(xué)樊龍江教授團(tuán)隊(duì)公布的E.crus-galli的CDS sequence[31-33]，從抗性孔雀稗基因中挑選與ACS 相關(guān)的EC_v6.g023859，與ACO 相關(guān)的EC_v6.g050359、EC_v6.g065826和EC_v6.g024163基因，與β-CAS 相關(guān)的EC_CAS基因，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析。采用

NCBI Primer-BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 設(shè)計(jì)用于RT-qPCR 擴(kuò)增的引物，引物序列見表2 (EC_Actin為內(nèi)參基因)。根據(jù)蘭博利德PCR 試劑盒的 Ultra SYBR 三步法熒光定量程序進(jìn)行熒光定量 PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。采用 2-ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物合成由福州尚亞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

表2 熒光定量 PCR 分析所用特異性引物Table 2 Specific primers for real-time quantification PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2016 軟件處理數(shù)據(jù)，通過GraphPad Prism 9 繪制結(jié)果圖，采用SPSS 20軟件分析結(jié)果的差異顯著性。所有試驗(yàn)均按照完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行。在統(tǒng)計(jì)分析之前，采用Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗(yàn)和Levene 方差同質(zhì)性檢驗(yàn)檢查數(shù)據(jù)的正態(tài)性 (p＞ 0.05)。當(dāng)數(shù)據(jù)滿足方差正態(tài)性和同質(zhì)性假設(shè)時(shí)，采用方差分析 (ANOVA)(Tukey's post hoc test，p＜ 0.05) 比較處理組之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源氨基酸混合液對(duì)抗性孔雀稗生長的影響

結(jié)果如圖1 所示，在不添加二氯喹啉酸處理的情況下，不同濃度的L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理對(duì)抗性孔雀稗幼苗生長無明顯影響，其根長、株高和鮮重在不同處理組之間及各處理與空白對(duì)照之間均無顯著性差異。

圖1 不同濃度L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸等比例混合液對(duì)抗性孔雀稗根長、株高和鮮重的影響Fig.1 Root length, plant height and fresh weight of quinclorac-resistant Echinochloa crus-pavonis plants treated with the equimolar mixture of L-methionine and L-cysteine at different concentrations

2.2 外源氨基酸混合液對(duì)抗性孔雀稗相關(guān)酶活性的影響

結(jié)果見圖2。與CK 相比，不同濃度L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸等比例混合液處理對(duì)抗性孔雀稗葉片中SOD 和CAT 酶活性均無顯著影響；低濃度 (200 和400 μmol/L) 氨基酸混合液處理組抗性孔雀稗葉片中PPO 酶活性與CK 相比也無顯著性差異，而高濃度 (600 和800 μmol/L) 氨基酸混合液處理組PPO 酶活性顯著下降，分別比CK 降低了35%和47%；200、600 和800 μmol/L 氨基酸混合液處理組POD 酶活性均被誘導(dǎo)升高，其中800 μmol/L 處理組比CK 提高了64%；200、600和800 μmol/L 氨基酸混合液處理組GSTs 酶活性與CK 相比無顯著性差異，但400 μmol/L 氨基酸混合液處理組GSTs 酶活性比CK 提高了14%，差異顯著 (p＜ 0.05)。說明不同濃度L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理對(duì)抗性孔雀稗PPO、POD、GSTs 酶活性存在不同程度影響，但對(duì)SOD 和CAT酶活性則幾乎無影響。

圖2 不同濃度L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸等比例混合液對(duì)抗性孔雀稗相關(guān)酶活性的影響Fig.2 Enzyme activities of quinclorac-resistant Echinochloa crus-pavonis plants treated with the mixture of L-methionine and L-cysteine at different concentrations

2.3 外源氨基酸混合液對(duì)二氯喹啉酸脅迫下抗性孔雀稗耐藥性的影響

結(jié)果如圖3 所示。500 μmol/L 的二氯喹啉酸脅迫對(duì)CK 及不同濃度L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液預(yù)處理組抗性孔雀稗地上部分和地下部分生長均有一定影響。在二氯喹啉酸脅迫下，與CK 相比，800 μmol/L 氨基酸混合液預(yù)處理對(duì)抗性孔雀稗生長的抑制作用最強(qiáng) (圖3A)。二氯喹啉酸脅迫下，CK 組抗性孔雀稗根系生長受到明顯抑制，而200 μmol/L 氨基酸混合液預(yù)處理組根系生長受抑制情況相對(duì)較輕，但隨著氨基酸混合液預(yù)處理濃度升高，抗性孔雀稗根系生長受抑制作用變強(qiáng)，即氨基酸混合液對(duì)抗性孔雀稗根系生長存在低濃度促進(jìn)高濃度抑制現(xiàn)象 (圖3B)。二氯喹啉酸脅迫下，600 和800 μmol/LL-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理組抗性孔雀稗根系生長狀態(tài)明顯差于 200 和400 μmol/L 氨基酸混合液處理組，表明高濃度氨基酸混合液處理后可能出現(xiàn)了一定程度的根系中毒狀況 (圖3B)。如圖3C 所示，二氯喹啉酸脅迫下，L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理濃度為 200 μmol/L 時(shí)，抗性孔雀稗整株鮮重、株高和根鮮重分別比CK 提高30%、24%和99%，差異顯著；600 μmol/L 氨基酸混合液處理組根長與 800 μmol/L 氨基酸混合液處理組之間具有顯著差異，但與CK 相比均無顯著差異?？傮w來看，在500 μmol/L 二氯喹啉酸脅迫下，添加L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液預(yù)處理，對(duì)抗性孔雀稗生長存在一定的低濃度促進(jìn)高濃度抑制現(xiàn)象，說明適當(dāng)提高L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液的施用濃度，可增強(qiáng)二氯喹啉酸對(duì)抗性孔雀稗的作用。

圖3 不同濃度L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸等比例混合液對(duì)二氯喹啉酸脅迫下抗性型孔雀稗幼苗生長的影響Fig.3 Effect of pre-treatment with a mixture of L-methionine and L-cysteine at different concentrations on seedling growth of quinclorac-resistant Echinochloa crus-pavonis

2.4 外源氨基酸混合液對(duì)二氯喹啉酸脅迫下抗性孔雀稗相關(guān)酶活性的影響

結(jié)果見圖4。在 500 μmol/L 二氯喹啉酸脅迫下，200 μmol/LL-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理組抗性型孔雀稗葉片中SOD 和GSTs 酶活性達(dá)到最高，分別比CK 高出22%和22%；800 μmol/L氨基酸混合液處理下則SOD 和GSTs 酶活性最低，分別比CK 低38%和35%，存在顯著性差異。二氯喹啉酸脅迫下，不同濃度氨基酸混合液處理組抗性型孔雀稗葉片中CAT 酶活性均顯著高于CK；同時(shí)，400 μmol/L 氨基酸混合液處理組PPO 酶活性比CK 顯著提高了143%；POD 酶活性隨著氨基酸混合液處理濃度的升高而升高，到最高濃度800 μmol/L 時(shí)則與CK 相比差異不顯著?？傊?，在500 μmol/L 二氯喹啉酸脅迫下，添加不同濃度L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理，對(duì)抗性型孔雀稗葉片中的保護(hù)酶和解毒酶如SOD、CAT、PPO、POD 以及GSTs 活性都有不同程度影響，說明施加L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液可增強(qiáng)二氯喹啉酸對(duì)抗性孔雀稗的作用。

圖4 不同濃度L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸等比例混合液對(duì)二氯喹啉酸脅迫下抗性型孔雀稗幼苗抗性相關(guān)酶活性的影響Fig.4 Effect of pre-treatment with a mixture of L-methionine and L-cysteine at different concentrations on activities of resistance associated enzymes in seedlings of quinclorac-resistant Echinochloa crus-pavonis

2.5 外源氨基酸混合液對(duì)二氯喹啉酸脅迫下抗性孔雀稗基因表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 研究發(fā)現(xiàn)，在 500 μmol/L二氯喹啉酸脅迫下，與ACC 合成酶 (ACS) 相關(guān)的EC_v6.g023859基因表達(dá)量隨著L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理濃度的升高而上調(diào)，其中800 μmol/L 氨基酸混合液處理組比CK 顯著上調(diào)了5.44 倍，同時(shí)與其他濃度氨基酸混合液處理組之間也均存在顯著性差異 (圖5A)；與ACC 氧化酶 (ACO) 相關(guān)的EC_v6.g050359、EC_v6.g065826和EC_v6.g024163基因的表達(dá)量隨著氨基酸混合液處理濃度的升高而上調(diào)，其中800 μmol/L 氨基酸混合液處理組EC_v6.g050359、EC_v6.g065826和EC_v6.g024163基因表達(dá)量分別比CK 上調(diào)了6.82、77.00 和18.91 倍，其余濃度氨基酸混合液處理組EC_v6.g050359、EC_v6.g065826和EC_v6.g024163的相對(duì)表達(dá)量與CK 相比也均出現(xiàn)了顯著性上調(diào) (圖5B、5C、5D)；與CK 相比，600 和800 μmol/L 氨基酸混合液處理組EC_CAS基因的表達(dá)量也出現(xiàn)了顯著上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)分別為4.68 和4.35 倍 (圖5E)。

圖5 不同濃度L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸等比例混合液對(duì)二氯喹啉酸脅迫下抗性型孔雀稗ACC 合成酶和ACC 氧化酶及氰化物解毒酶相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of pre-treatment with a mixture of L-methionine and L-cysteine at different concentrations on expression of ACC synthesis gene, ACC oxidation genes and cyanide detoxification enzyme gene in seedlings of quinclorac-resistant Echinochloa crus- pavonis

3 結(jié)論與討論

氨基酸是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元，同時(shí)也是很多代謝產(chǎn)物的合成前體，在植物代謝途徑中發(fā)揮著多種功能。已有研究表明，氨基酸類物質(zhì)在植物抗逆和生長中、特別是影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的水平方面具有重要作用[23-24]。氨基酸廣泛參與植物的生長發(fā)育、抗逆等生理活動(dòng)，外源氨基酸也可通過參與其他代謝過程和作為信號(hào)分子促進(jìn)植物生長[25-28]。本研究明確了外源添加L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸等比例混合液對(duì)抗性型孔雀稗抗除草劑二氯喹啉酸的效果：低濃度下，L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理降低了稗草對(duì)除草劑的敏感性，高濃度下則增強(qiáng)了稗草對(duì)除草劑的敏感性，即外源添加L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液對(duì)稗草對(duì)二氯喹啉酸耐藥性的影響存在低濃度促進(jìn)高濃度抑制現(xiàn)象。

植物體內(nèi)相關(guān)酶活性升高是增強(qiáng)植物防御能力和解毒能力的前提。已有研究表明，植物體內(nèi)的保護(hù)酶系 (SOD、CAT、PPO、POD) 能夠消除逆境脅迫下活性氧的積累，以保證植物的正常生長[20-21]，而GSTs 酶能直接軛合除草劑并參與解毒反應(yīng)，從而使雜草的耐藥性增強(qiáng)[18,22]。本研究發(fā)現(xiàn)，在500 μmol/L 二氯喹啉酸脅迫下，隨著L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理濃度升高，抗性孔雀稗葉片中SOD、CAT、PPO 和GSTs 酶活性整體均表現(xiàn)為逐漸下降趨勢，而POD 酶活性則隨著氨基酸混合液處理濃度的升高而逐漸升高。在低濃度 (200 μmol/L) 氨基酸混合液處理下，二氯喹啉酸對(duì)抗性孔雀稗的毒害作用被減弱，植物中防御酶SOD、CAT、PPO 以及解毒酶GSTs 活性與CK 相比均有所升高，抗性孔雀稗對(duì)除草劑的防御能力和解毒能力得以加強(qiáng)，從而增強(qiáng)了對(duì)二氯喹啉酸的抗性；而800 μmol/L 高濃度的氨基酸混合液處理則增強(qiáng)了二氯喹啉酸對(duì)抗性孔雀稗的作用，導(dǎo)致葉片出現(xiàn)萎蔫及死亡，根部短小停止生長。總之，在500 μmol/L 二氯喹啉酸脅迫下，抗性型孔雀稗可顯著提高保護(hù)酶活性以抵御活性氧的積累，保護(hù)自身免受除草劑影響，而經(jīng)過不同濃度的L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理后，抗性孔雀稗的保護(hù)酶和解毒酶活性會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化，最終導(dǎo)致抗性孔雀稗對(duì)除草劑二氯喹啉酸的敏感性發(fā)生變化。

有研究表明，二氯喹啉酸對(duì)敏感型雜草的主要作用機(jī)制是誘導(dǎo)其乙烯生物合成途徑中有毒氰化物的積累[8-9]。同時(shí)亦有研究發(fā)現(xiàn)，乙烯合成的前體物質(zhì)ACC 含量如果不足，將會(huì)導(dǎo)致乙烯的生物合成途徑啟動(dòng)失敗，致使稗草對(duì)二氯喹啉酸抗性增強(qiáng)[14]，而β-CAS 酶可以降解在乙烯生物合成途徑中產(chǎn)生的有毒氰化物，同樣也可提高稗草對(duì)二氯喹啉酸的抗性[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理濃度升高，與乙烯生物合成相關(guān)基因的表達(dá)水平呈上調(diào)趨勢，導(dǎo)致稗草ACC 的合成及氧化加快，從而產(chǎn)生更多的乙烯，并隨之產(chǎn)生更多的HCN，最終導(dǎo)致稗草死亡。另一方面，稗草為了避免自身死亡，調(diào)動(dòng)與氰化物解毒相關(guān)β-CAS 基因大量上調(diào)表達(dá)，加速降解在乙烯生物合成途徑中產(chǎn)生的有毒氰化物，從而提高稗草對(duì)二氯喹啉酸的抗性。推測在高濃度的L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理下，植物降解HCN 的速度可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于生成HCN 的速度，導(dǎo)致植物出現(xiàn)萎蔫，甚至最終死亡。

本研究通過不同濃度L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理抗性孔雀稗后再采用二氯喹啉酸處理，測定了供試稗草的生物表型、酶活性變化以及與乙烯生物合成及氰化物解毒相關(guān)基因表達(dá)水平的變化，從上述3 個(gè)方面研究了氨基酸類代謝物L(fēng)-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液對(duì)抗性稗草對(duì)二氯喹啉酸敏感性的影響?？傮w而言，外源添加L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液對(duì)稗草的抗藥性具有低濃度下促進(jìn)高濃度下抑制的作用；外源氨基酸可影響植物保護(hù)酶和解毒酶的活性，隨著L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液濃度升高，稗草抗氧化酶SOD、CAT、PPO 以及解毒酶GSTs 活性整體均表現(xiàn)為逐漸下降趨勢，而POD 酶活性則隨氨基酸混合液濃度升高而逐漸升高；同時(shí)稗草乙烯信號(hào)途徑ACC 合成酶基因和ACC 氧化酶基因，以及與氰化物解毒相關(guān)的β-氰丙氨酸合成酶基因也均隨著氨基酸混合液濃度升高而上調(diào)表達(dá)，可能進(jìn)一步促進(jìn)了乙烯代謝產(chǎn)物氫氰酸的形成，進(jìn)而導(dǎo)致稗草對(duì)除草劑的敏感性升高，抗性降低。本研究結(jié)果可為降低稻田中除草劑的施用量，以及減輕田間稗屬雜草對(duì)二氯喹啉酸的抗性提供參考。后續(xù)還將通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)進(jìn)一步對(duì)稗草抗藥性變化的分子機(jī)制進(jìn)行探究。