高 玥, 黃冀楠, 許 賢, 李 杰, 李秉華, 趙鉑錘, 祁志尊,王貴啟, 郭建青, 劉小民*,

(1.河北北方學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，河北 張家口 075000；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所，河北省作物栽培生理與綠色生產(chǎn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050035；3.河北省石家莊市發(fā)展和改革委員會(huì)，石家莊 050011；4.河南省太行山林業(yè)有害生物野外科學(xué)觀測研究站，河南 安陽 455099)

玉米是我國的主要糧食作物，而雜草是影響玉米品質(zhì)和產(chǎn)量的重要因素之一[1]。目前，施用化學(xué)除草劑仍是防除玉米田雜草的主要措施。研究表明，雜草已對多類除草劑產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性[2]。對羥基苯基丙酮酸雙氧化酶 (4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD) 為20 世紀(jì)90 年代新發(fā)現(xiàn)的除草劑作用靶標(biāo)酶之一。HPPD 可以催化對羥基丙酮酸轉(zhuǎn)化為尿黑酸，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為光合作用中電子傳遞所需要的質(zhì)體醌和生育酚[3]。此類除草劑能競爭抑制植物體內(nèi)HPPD 的活性，使植物出現(xiàn)失綠、褪色癥狀，組織壞死，最終導(dǎo)致植物死亡[4]。該類除草劑因具有生物活性高、對作物安全性好、可用于防除抗性雜草等特點(diǎn)，成為近幾年除草劑研發(fā)的熱點(diǎn)。

環(huán)磺酮是2007 年由拜耳公司研發(fā)的HPPD 抑制劑類除草劑，具有內(nèi)吸性和選擇性，可以用于玉米、向日葵等作物田防除多種闊葉雜草和禾本科雜草。環(huán)磺酮2021 年在中國登記后，近幾年在我國被廣泛的推廣應(yīng)用，具有廣譜、高效和低殘留的優(yōu)點(diǎn)，施藥后植物的受害癥狀主要為葉片白化，植株矮小，嚴(yán)重時(shí)整株死亡[5]。研究表明，環(huán)磺酮對玉米田大多數(shù)禾本科和闊葉雜草具有很好的防治效果，且對那些已對麥草畏、草甘膦和乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性的雜草有滅殺效果[6]。與同類型的除草劑硝磺草酮相比，環(huán)磺酮的除草活性更高[7]，更耐雨水沖刷，且除草范圍廣，對后茬作物沒有影響[8-10]。

玉米對除草劑的敏感性與其自身的遺傳基礎(chǔ)有關(guān)。有研究表明，玉米5 號染色體短臂上的CYP等位基因nsf1與玉米對煙嘧磺隆、甲酰胺磺隆、硝磺草酮等除草劑的敏感性密切相關(guān)。Williams等[11]通過玉米對煙嘧磺隆和硝磺草酮的敏感性差異分析，將249 份玉米材料分為純合敏感基因型(nsf1nsf1)、雜合耐藥基因型 (NSF1nsf1) 和純合耐藥基因型 (NSF1NSF1) 3 類。雖然環(huán)磺酮對玉米的安全性較好，并可應(yīng)用于爆裂玉米、甜玉米等特種玉米田，但仍有研究表明，部分甜玉米品種對環(huán)磺酮高度敏感。Bollman 等[12]發(fā)現(xiàn)，用環(huán)磺酮處理甜玉米品種‘Merit’ 7 d 后有52% 的葉片白化，14 d 后植株嚴(yán)重枯萎死亡。Williams 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磺酮按有效成分184 g/hm2處理7 d后，對‘Shogun’、‘Merit’、‘177A’等7 個(gè)甜玉米品種可造成56%～100% 的藥害。我國玉米品種繁多，明確骨干自交系對除草劑的耐藥性水平，對指導(dǎo)除草劑在玉米田的安全應(yīng)用、避免除草劑藥害發(fā)生、保障玉米生產(chǎn)安全具有重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)意義。本研究以‘Mo17’、‘PH6WC’、‘J525’和‘KH8’等玉米自交系為試驗(yàn)對象，明確了環(huán)磺酮對耐、感玉米生長發(fā)育及體內(nèi)生理生化指標(biāo)的影響差異，旨在為環(huán)磺酮在玉米田的安全使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試藥劑95%環(huán)磺酮（(tembotrione）原藥和8%環(huán)磺酮可分散油懸浮劑 (tembotrione 8% OD)，均由安徽久易農(nóng)業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；植物油助劑GY-Tmax，由北京廣源益農(nóng)化學(xué)有限責(zé)任公司提供。供試自交系H B 0 5 (‘M o 1 7’)、H B 0 9(‘PH6WC’) 為耐藥型玉米，HB39 (‘J525’) 和HB82(‘KH8’) 為敏感型玉米，兩者均由河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所提供。

1.2 環(huán)磺酮對玉米苗期生長的影響

采用室內(nèi)生物測定法[13]。選取籽粒飽滿、大小勻稱的玉米種子放入高10 cm、直徑11 cm 育苗盆中培養(yǎng)，溫度25 ℃，每盆兩粒種子，3 次重復(fù)。待玉米長到三葉一心時(shí)，使用3WP-2000 型噴霧塔 (農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南京農(nóng)業(yè)機(jī)械化研究所) 進(jìn)行莖葉噴霧處理，噴霧壓力0.3 MPa，噴液量450 L/hm2。環(huán)磺酮處理劑量 (有效成分，下同) 敏感型玉米為：0、30、60、90、120、180 和240 g/hm2，耐藥型玉米為：0、120、240、360、480、600 和720 g/hm2。于藥后14 d 測定玉米株高和鮮重，計(jì)算抑制率。

1.3 環(huán)磺酮對玉米主根生長的影響

采用垂直根長法[14]。稱取環(huán)磺酮原藥1.030 g，用丙酮溶解后用蒸餾水定容到1000 mg/L，作為母液。用蒸餾水將母液分別稀釋到0.1、1、10 和100mg/L，以清水為對照。將玉米種子用酒精沖洗1 min，用次氯酸鈉浸泡10 min 后，再用自來水沖洗3 次，最后用蒸餾水將種子浸泡24 h。第2 天將處理好的玉米種子置于玻璃板上，用兩張濾紙固定，將玻璃板垂直放在保鮮盒中，保鮮盒中放入不同濃度的藥液。于7 d 后測量主根根長。以抑制率概率值 (y) 和濃度對數(shù)值 (x) 建立回歸方程 (y=a+bx)，計(jì)算IC50值 (mg/L)。

1.4 環(huán)磺酮對玉米葉片類胡蘿卜素和葉綠素含量的影響

按照1.2 節(jié)中的方法培養(yǎng)玉米，待其長到三葉一心時(shí)，采用環(huán)磺酮按有效成分120 g/hm2處理。分別在施藥后0、3、5 和7 d 采集0.1 g 新鮮的玉米葉片，去掉中脈，在黑暗條件下研磨后倒入10 mL試管中，加入V(乙醇) :V(蒸餾水) = 95 : 5 混合液，于黑暗條件下浸提3 h。待材料完全變白后，取浸提液于96 孔板中，將波長分別調(diào)至665、649 和470 nm 處讀取吸光值 (A)。按公式 (1)～(4)計(jì)算葉綠素a 含量、葉綠素b 含量、葉綠素總含量和類胡蘿卜素含量。

其中，Ca為葉綠素a 含量，Cb為葉綠素b 含量，Ct為葉綠素總含量，Cc為類胡蘿卜素含量，單位均為mg/g；V為提取液體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；m為樣本質(zhì)量，g。

1.5 超氧化物歧化酶 (SOD) 和過氧化物酶 (POD)活性測定

按照1.2 節(jié)的方法培養(yǎng)玉米，待其長到三葉一心時(shí)，采用環(huán)磺酮有效成分120 g/hm2處理。分別于施藥后0、1、3、5 和7 d 采集新鮮的玉米葉片，冰浴勻漿，使用索萊寶 (Solarbio) 生物科技有限公司提供的SOD 和POD 試劑盒進(jìn)行測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 及DPS 17.1 軟件進(jìn)行處理，并利用新復(fù)極差法(Duncan's 法)進(jìn)行單因素差異顯著性分析，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)磺酮對玉米幼苗生長的影響

2.1.1 環(huán)磺酮對玉米株高的影響 環(huán)磺酮按30 g/hm2(有效成分，下同) 施用4 d 后，敏感型玉米植株開始表現(xiàn)出藥害癥狀，葉片出現(xiàn)白化現(xiàn)象；對玉米株高的抑制率隨著用藥量的增加而逐漸增大，其中在60 g/hm2處理下對HB82 株高的抑制率達(dá)52.87%，在240 g/hm2處理下抑制率高達(dá)64.63%。而耐藥型玉米在施用環(huán)磺酮后，植株葉片并未出現(xiàn)白化現(xiàn)象，各處理間株高抑制率變化幅度較小，在720 g/hm2處理下對HB05 和HB09 的株高抑制率分別為48.61%和38.05% (圖1)。

圖1 環(huán)磺酮對玉米株高的影響Fig.1 Effect of tembotrione on maize plant height

2.1.2 環(huán)磺酮對玉米鮮重的影響 由圖2 可知，環(huán)磺酮對不同玉米自交系的鮮重抑制率存在明顯差異。在30 g/hm2處理下，對敏感型玉米HB82、HB39 的鮮重抑制率分別為38.59%和24.94%，在240 g/hm2處理下對其鮮重抑制率分別高達(dá)70.06%和66.02%。而耐藥型玉米HB05 在施用環(huán)磺酮120 g/hm2后，鮮重抑制率僅為4.44%，720 g/hm2處理下鮮重抑制率為21.93%；HB09 在120～720 g/hm2處理下，鮮重抑制率為22.39%～43.63%。

圖2 環(huán)磺酮對玉米鮮重的影響Fig.2 Effect of tembotrione on maize fresh weig ht

2.2 環(huán)磺酮對玉米主根生長的影響

從圖3 可以看出，環(huán)磺酮對玉米主根生長有一定的抑制作用，在同一濃度處理下，對敏感型玉米主根根長的抑制作用明顯高于耐藥型玉米，濃度越高對主根根長的抑制作用越明顯。1000 mg/L處理對敏感型玉米HB82 和HB39 的根長抑制率分別為90.94%和85.35%，對耐藥型玉米HB05 和HB09 的抑制率分別為76.65%和78.07%。由表1數(shù)據(jù)可以看出，環(huán)磺酮對敏感型HB82 和HB39的IC50值分別為13.48 和16.13 mg/L，對耐藥型玉米HB05 和HB09 的IC50分別為223.50 和37.42 mg/L，兩者的IC50值相差較大。

表1 環(huán)磺酮對玉米主根的影響(120 g a.i./hm2)Table 1 Effect of tembotrione on taproots of maize (120 g a.i./hm2)

圖3 環(huán)磺酮對玉米主根生長的影響Fig.3 Effect of tembotrione on the growth of maize taproots

2.3 環(huán)磺酮對玉米幼苗類胡蘿卜素和葉綠素含量的影響

HPPD 抑制劑類除草劑可以阻斷植物體內(nèi)酪氨酸的正常代謝，導(dǎo)致類胡蘿卜素的缺乏, 從而誘導(dǎo)葉綠素光氧化作用減弱，影響植物的光合作用。施用環(huán)磺酮后，葉綠素a、b，葉綠素總含量和類胡蘿卜素含量均隨用藥時(shí)間的增加呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢 (表2)。施藥7 d 后，敏感型玉米HB82 和HB39 體內(nèi)類胡蘿卜素含量分別下降83.72%和74.02%，耐藥型玉米HB05 和HB09 分別下降40.83%和33.33%；敏感型玉米和耐藥型玉米的葉綠素總含量有明顯的差異，敏感型玉米HB82 的下降趨勢最明顯，下降87.76%，而耐藥型玉米HB09 下降33.65%；葉綠素a 和葉綠素b的變化趨勢與葉綠素總含量變化趨勢一致，敏感型玉米HB82 葉綠素a 含量由0.837 mg/g 下降至0.102 mg/g，HB39 由0.540 mg/g 下降至0.159 mg/g；耐藥型玉米HB05 由0.546 mg/g 下降至0.217 mg/g，HB09 由0.668 mg/g 下降至0.442 mg/g。HB82 和HB39 葉綠素b 含量分別下降0.184 和0.086 mg/g，HB09 和HB05 分別下降0.055 和0.079 mg/g。表明環(huán)磺酮對敏感型玉米葉片中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總含量和類胡蘿卜素含量影響較大，葉片受害較重，光合作用受到嚴(yán)重抑制。而耐藥型玉米在施用環(huán)磺酮后，葉片受害較輕，對葉綠素a、葉綠素b，葉綠素總含量和類胡蘿卜素含量影響較小。

表2 環(huán)磺酮對玉米葉片類胡蘿卜素和葉綠素含量的影響 (120 g a.i./hm2)Table 2 Effect of tembotrione on carotenoids and chlorophyll content in maize leaves (120 g a.i./hm2)

2.4 環(huán)磺酮對不同玉米自交系SOD 和POD 酶活性的影響

SOD 活性測定結(jié)果如圖4 所示，與對照組相比，環(huán)磺酮處理誘導(dǎo)了不同玉米自交系體內(nèi)SOD 酶活性的增加。不同玉米自交系SOD 酶活性均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在第3 天出現(xiàn)最高值，然后下降。敏感型玉米和對照組相比活性變化幅度大，藥后3 d 與對照組相比，敏感型HB82活性提高69.02%，HB39 提高93.63%；而耐藥型玉米HB05 和HB09 的SOD 酶活性與對照組相比變化幅度不大。

圖4 環(huán)磺酮對玉米葉片SOD 酶活性影響 (120 g a.i./hm2)Fig.4 Effect of tembotrione on SOD enzyme activity in maize leaves (120 g a.i./hm2)

POD 活性測定結(jié)果 (圖5) 表明，施用環(huán)磺酮后，不同玉米自交系體內(nèi)POD 酶活性均高于對照組。整體呈先上升后下降趨勢，HB82、HB39 和HB05 在藥后5 d 出現(xiàn)最高值，HB09 在藥后3 d 出現(xiàn)最高值。與對照組相比，藥后5 d， HB82 升高182.19%，HB39 升高163.23%；藥后3 d，HB09升高28.09%，HB05 變化最小，僅升高4.20%。敏感型玉米與耐藥型玉米相比具有較大的差異。

圖5 環(huán)磺酮對玉米葉片POD 酶活的影響Fig.5 Effect of tembotrione on POD enzyme activity in maize leaves

3 結(jié)論與討論

除草劑對玉米的安全性除了受氣候和土壤等環(huán)境因素的影響之外，還與玉米品種密切相關(guān)[15]。本研究借鑒董曉雯等[16]和陳錫嶺等[17]的方法，分析了環(huán)磺酮脅迫對玉米幼苗和主根生長的影響。結(jié)果表明，環(huán)磺酮對玉米幼苗生長和主根根長具有不同程度的抑制作用，不同玉米自交系對環(huán)磺酮的耐藥性存在明顯差異，環(huán)磺酮120 g/hm2處理對敏感型玉米產(chǎn)生傷害，影響其光合作用，阻礙玉米生長發(fā)育所需物質(zhì)的運(yùn)輸，導(dǎo)致玉米營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，代謝能力減弱，藥害嚴(yán)重；而對耐藥型玉米的生長發(fā)育無明顯影響。敏感型玉米HB82和HB39 在環(huán)磺酮30 g/hm2處理下葉片出現(xiàn)白化，而生產(chǎn)上常用的骨干自交系‘Mo17’ (HB05)、‘PH6WC’ (HB09) 即使在720 g/hm2劑量下葉片也沒有出現(xiàn)失綠現(xiàn)象?！甅o17’在育種中做出巨大貢獻(xiàn)，先后培育出‘丹玉13’和‘中單2 號’等品種?！甈H6WC’培育的雜交后代有‘先玉335’，我們在前期研究中驗(yàn)證了‘先玉335’為耐環(huán)磺酮的品種 (結(jié)果未發(fā)表)。已有研究表明，不同玉米品種對不同類型除草劑的敏感性存在顯著差異。董曉雯等[16]測定了32 個(gè)玉米品種對有效成分60 g/hm2煙嘧磺隆的敏感性，發(fā)現(xiàn)‘泰玉2 號’等7 個(gè)玉米品種對煙嘧磺隆敏感，植株生長受到嚴(yán)重抑制，而‘農(nóng)大2008’等4 個(gè)玉米品種生長正常，無明顯藥害癥狀。謝娜等[18]研究發(fā)現(xiàn)，氯吡嘧磺隆對甜玉米的IC10值為94.87 g/hm2(有效成分，下同)，而對‘強(qiáng)盛16’的IC10值為230.19 g/hm2，相差2.43 倍。郭玉蓮等[19]研究表明，‘吉單27’、‘先玉335’、‘東農(nóng)888’和‘墾粘1 號’對氟磺胺草醚敏感性差異顯著，耐藥倍數(shù)相差5.71～8.83 倍。

HPPD 抑制劑類除草劑可以阻礙玉米體內(nèi)質(zhì)體醌 (PQ) 的合成，質(zhì)體醌作為光合作用中關(guān)鍵的輔助因子，影響類胡蘿卜素的生成，使植物逐漸白化，葉綠素含量下降[20]。葉綠素含量的高低能反映作物光合作用狀態(tài)的變化，因此葉綠素含量是反映逆境脅迫下光合作用的重要指標(biāo)。本研究中，隨著施藥時(shí)間的推移，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總含量和類胡蘿卜素含量均呈不同程度的下降趨勢，其中敏感型玉米的下降幅度大于耐藥型玉米，二者差異明顯。郭玉蓮等[19]研究了不同玉米品種對氟磺胺草醚的敏感性差異，發(fā)現(xiàn)施用氟磺胺草醚后不論是敏感還是耐藥型玉米體內(nèi)葉綠素含量均受到抑制，但對耐藥品種葉綠素抑制率變化幅度較敏感品種小，二者間差異極顯著。王一[21]對不同耐旱脅迫下兩個(gè)玉米自交系苗期生長發(fā)育以及生理生化特性的研究發(fā)現(xiàn)，耐旱玉米自交系體內(nèi)葉綠素a、葉綠素b 和葉綠素總含量受脅迫影響較敏感型玉米自交系小。

除草劑使用不當(dāng)容易對玉米造成傷害，當(dāng)玉米受到除草劑等非生物脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)生成大量的活性氧如超氧自由基、過氧化氫等，植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)為防止細(xì)胞的氧化損傷，啟動(dòng)保護(hù)酶來維持植物細(xì)胞的穩(wěn)定。超氧化物歧化酶(SOD) 和過氧化物酶 (POD) 是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶，是評價(jià)植物氧化反應(yīng)的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磺酮脅迫誘導(dǎo)了玉米體內(nèi)SOD 和POD活性的增加，整體呈先上升后下降的趨勢，其中敏感型玉米的增長幅度明顯高于耐藥型玉米。石小堰[22]研究表明，在2,4-D 丁酯、乙草胺和莠去津3 種除草劑處理下，抗感玉米體內(nèi)SOD 和POD的活性與對照組相比都有一定的升高。高鵬[23]關(guān)于谷子和玉米對煙嘧磺隆敏感性差異的生理機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，玉米施用煙嘧磺隆后體內(nèi)S O D和POD 活性升高，其中 ‘農(nóng)大108’和‘迪甜8 號’玉米體內(nèi)SOD 和POD 活性隨用藥時(shí)間的推移呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

有關(guān)不同自交系玉米品種對環(huán)磺酮敏感性差異的生理機(jī)制，還需要從酶學(xué)、生理學(xué)等方面進(jìn)行深入研究。