馬寅龍，郭銳斌，于雁松，馬隆凱，許曉曦

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱 150030）

生物活性肽是一種蛋白質(zhì)降解成氨基酸的中間產(chǎn)物，它除了具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外，還會(huì)對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生有益的生理作用，與傳統(tǒng)藥物相比，它無毒、副作用小且利于機(jī)體利用，目前許多生物活性肽已被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[1]。生物活性肽具有多種生物活性，主要包括抗氧化、抗菌、降血壓及降血糖等[2]。目前研究報(bào)道，生物活性肽主要來源于乳制品、動(dòng)物和植物，這是因?yàn)樗鼈兒刑囟ㄉ锘钚云蔚牡鞍踪|(zhì)前體[3]。乳源蛋白質(zhì)被視為生物活性肽的重要來源，目前越來越多的生物活性肽在乳蛋白水解物和發(fā)酵乳制品中被發(fā)現(xiàn)。乳清蛋白來源于奶酪生產(chǎn)加工中的副產(chǎn)物乳清中，蛋白組成包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白、血清白蛋白、乳鐵蛋白、乳過氧化物酶、蛋白胨和糖巨肽，含有大量必需氨基酸和支鏈氨基酸，如異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸，具有調(diào)節(jié)不同代謝通路、血糖穩(wěn)態(tài)及含硫氨基酸平衡的功能[4]。它本身也具有優(yōu)良的抗氧化性，可清除機(jī)體自由基，螯合金屬離子及修復(fù)體內(nèi)蛋白質(zhì)中的游離巰基[5]。研究表明，乳清蛋白在水解過程中會(huì)釋放出具有高抗氧化能力的抗氧化肽[6-7]。Peng 等[8]發(fā)現(xiàn)，與未水解的乳清分離蛋白相比，乳清分離蛋白的水解物具有更強(qiáng)的自由基清除能力、銅離子螯合能力和總還原能力。Daliri 等[9]研究表明，乳清蛋白經(jīng)Corolase 酶或其它商業(yè)蛋白酶水解后得到的乳清蛋白肽具有較高的清除自由基能力。Corrochano 等[10]通過模擬胃腸道消化的方式研究乳清蛋白源抗氧化肽，發(fā)現(xiàn)乳清蛋白經(jīng)消化后產(chǎn)生的多肽（ALMP、GDLE、TKIPA、VEELKPT、VGIN 和AVEGPK）通過Caco-2/HT-29 細(xì)胞中的腸屏障傳輸，從而抑制肌肉和肝細(xì)胞中自由基的形成。

人體產(chǎn)生氧自由基含量的多少，受機(jī)體內(nèi)部和外部環(huán)境影響，比如自然生長(zhǎng)發(fā)育的過程、外部環(huán)境接觸的過程及不良飲食習(xí)慣的影響。在代謝正常的條件下，機(jī)體產(chǎn)生的自由基會(huì)被其內(nèi)部的抗氧化系統(tǒng)中和，如果機(jī)體代謝紊亂就會(huì)導(dǎo)致自由基和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡紊亂，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)積累過量的自由基。氧自由基在生物體內(nèi)過量往往與活性氧種類和抗氧化物質(zhì)之間的不平衡有關(guān)，這種自由基的平衡紊亂稱為氧化應(yīng)激[11]。自由基反應(yīng)的加劇會(huì)引起強(qiáng)烈且持久的氧化應(yīng)激，并可能導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的永久性變化，這個(gè)過程會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和基因，從而導(dǎo)致代謝紊亂和腫瘤轉(zhuǎn)化[12]。研究表明，許多現(xiàn)代非傳染性疾病與氧化應(yīng)激有關(guān)，如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、循環(huán)系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂[13]。雖然合成藥物可用于治療這些疾病，但是其往往伴隨有不良副作用，因此天然食物來源的抗氧化成分受到科學(xué)界的廣泛關(guān)注。

傳統(tǒng)的抗氧化肽篩選方法是通過特定酶對(duì)蛋白進(jìn)行水解，然后對(duì)產(chǎn)生的肽段進(jìn)行鑒定、合成，并進(jìn)行體外和體內(nèi)的抗氧化驗(yàn)證試驗(yàn)，因此抗氧化肽序列的試驗(yàn)研究往往既價(jià)格昂貴又耗費(fèi)時(shí)間[14]。采用生物信息學(xué)對(duì)肽段進(jìn)行電子分析來篩選抗氧化肽序列，可以克服這些缺點(diǎn)，對(duì)抗氧化肽的研究主要包括電子預(yù)測(cè)和分子模擬技術(shù)。生物活性肽的電子預(yù)測(cè)是基于機(jī)器學(xué)習(xí)方法創(chuàng)立的，在機(jī)器學(xué)習(xí)推理中通常需要正數(shù)據(jù)集和負(fù)數(shù)據(jù)集來訓(xùn)練預(yù)測(cè)模型，通過這種方式可以訓(xùn)練機(jī)器學(xué)習(xí)算法，從給定數(shù)據(jù)集中學(xué)習(xí)復(fù)雜的基本模式，并利用它們的物理化學(xué)性質(zhì)和氨基酸組成預(yù)測(cè)生物活性肽的生物活性[15]。分子模擬技術(shù)是從生命科學(xué)中蛋白質(zhì)、多肽等結(jié)構(gòu)出發(fā)，在分子水平上解析生物反應(yīng)過程，在分子作用機(jī)理上補(bǔ)充體外和體內(nèi)試驗(yàn)的理論，由于其可對(duì)模擬粒子進(jìn)行原子細(xì)節(jié)分析，因此在分子相互作用方面提高了對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的理解和解釋的新水平[16-17]。

綜上所述，本研究利用虛擬酶解、電子預(yù)測(cè)、分子對(duì)接及分子動(dòng)力學(xué)等生物信息學(xué)方法，以牛乳清蛋白為目標(biāo)蛋白篩選抗氧化肽。旨在為篩選乳清蛋白源抗氧化肽提供一種高效、低成本的方法，為天然食源性抗氧化肽的快速篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳清蛋白氨基酸序列，來自Universal Protein數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）；Keap1 蛋白的天然晶體結(jié)構(gòu)，來自RCSB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）。

1.2 儀器與設(shè)備

Discovery studio（DS）V2019 軟件，美國(guó)BIOVIA 公司。

1.3 牛乳清蛋白序列的獲得

牛乳清蛋白主要包括β-乳球蛋白（1.3 g/L）、α-乳白蛋白（1.2 g/L）、免疫球蛋白（0.5～1.0 g/L）、牛血清白蛋白（0.4 g/L）、牛乳鐵蛋白（0.1 g/L）[18]，其蛋白序列來源于Universal Protein（https：//www.uniprot.org/），5 種蛋白的編號(hào)和氨基酸數(shù)目分別為：Beta-lactoglobulin，P02754，178；Alpha-lactalbumin，P00711，142；Polymeric immunoglobulin receptor，P81265，757；Albumin，P02769，607 和Lactotransferrin，P24627，708。

1.4 計(jì)算機(jī)虛擬消化

采用BIOPEP-UWM（http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep）[19]中 的“enzyme（s）action”程序?qū)? 種牛乳清蛋白源蛋白質(zhì)進(jìn)行虛擬消化，使用的水解酶為胃蛋白酶（EC 3.4.23.1）和胰蛋白酶（EC 3.4.21.4），識(shí)別和切割位點(diǎn)分別為：（胃蛋白酶）、（胰蛋白酶），且2 種蛋白酶均可作用于C-末端。

1.5 抗氧化肽的篩選

將虛擬消化得到的牛乳清蛋白源肽段在PeptideRanker（http：//distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）預(yù)測(cè)網(wǎng)站中進(jìn)行潛在生物活性評(píng)分，生物活性評(píng)分越高代表預(yù)測(cè)肽的生物活性越大，通常選擇不小于0.5 或0.4 作為篩選生物活性肽的基準(zhǔn)[20]。本研究為了擴(kuò)大篩選抗氧化肽的范圍，因此選擇不小于0.4 的生物活性評(píng)分的肽作為后續(xù)研究對(duì)象。

通過BIOPEP-UWM 和SATPdb[21]（http：//crdd.osdd.net/raghava/satpdb/）數(shù)據(jù)庫，將上述篩選后的所有肽段與兩數(shù)據(jù)庫中已被報(bào)道的生物活性肽進(jìn)行比對(duì)，篩選出未被報(bào)道過的肽進(jìn)行后續(xù)研究。

1.6 毒性、過敏性及水溶性分析

通過ToxinPred[22]程序（http：//crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/）預(yù)測(cè)肽的毒性，設(shè)定SVM 閾值為0.0，采用兩種預(yù)測(cè)方法：SVM（Swiss Prot）+Motif 和SVM（TrEMBL）+Motif 進(jìn)行測(cè)定，只有當(dāng)2 兩種方法預(yù)測(cè)結(jié)果均為無毒時(shí)才可被視為無毒的肽序列；通過AllerTOP v.2.0[23]程序（https：//www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/index.html）預(yù)測(cè)肽的過敏性；通過Innovagen 在線網(wǎng)站（http：//www.innovagen.com）預(yù)測(cè)肽的水溶性優(yōu)劣，此網(wǎng)站可以將肽區(qū)分為“Good water solubility”和“Poor water solubility”。篩選出預(yù)測(cè)結(jié)果為無毒、無致敏性、良好水溶性的肽用于后續(xù)研究。

1.7 物理化學(xué)性質(zhì)分析

通過Expasy-compute[24]程序（http：//web.expasy.org/compute_pi/）的pI/Mw tool 功能預(yù)測(cè)肽的相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；通過在線網(wǎng)站Pepdraw（http：//www.tulane.edu/～biochem/WW/PepDraw）預(yù)測(cè)肽的凈電荷和疏水性。

1.8 藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析

通過Discovery studio（DS）V2019（Dassault Systemes Biovia，San Diego，CA，USA）軟件對(duì)多肽進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)（Absorption distribution metabolism excretion toxicity，ADMET）分析，分析多肽作為相關(guān)藥物的吸收與毒性，進(jìn)一步篩選更加合理、健康的肽段。采用DS 軟件的ADMET Descriptors 程序，分析多肽的人體腸道吸收（Human intestinal absorption，HIA）[25]、25 ℃水溶性（Aqueous solubility）[26]、血腦屏障通透性（Blood brain barrier，BBB）[27]、細(xì)胞色素P450 2D6 抑制性（Cytochrome P4502D6 inhibition）[28-29]、肝毒性（Hepatotoxicity）[29-30]及血漿蛋白結(jié)合率（Plasma protein binding，PPB）[31]；采用DS 軟件的Toxicity Prediction 程序?qū)Χ嚯倪M(jìn)行毒理性質(zhì)的預(yù)測(cè)，依據(jù)乳清蛋白源多肽的應(yīng)用功能選定9 個(gè)預(yù)測(cè)模型：1）埃姆斯致突變性模型、2）NTP 數(shù)據(jù)集下的嚙齒動(dòng)物致癌性模型（NTP Rodent Carcinogenicity）、3）FDA 數(shù)據(jù)集下的嚙齒動(dòng)物致癌性模型（FDA Rodent Carcinogenicity）、4）嚙齒動(dòng)物致癌性證據(jù)權(quán)重（Weight-of-evidence rodent carcinogenicity）、5）致癌潛能TD50（Carcinogenic potency TD50）、6）潛在發(fā)育毒性（Developmental toxicity potential）、7）大鼠口服LD50（Rat oral LD50）、8）大鼠最大耐受劑量（Rat maximum tolerated dose）、9）大鼠長(zhǎng)期口服最低毒副反應(yīng)水平（Rat chronic oral lowest observed adverse effectlevel，LOAEL）。

1.9 分子對(duì)接

1.9.1 配體結(jié)構(gòu)優(yōu)化 使用DS 軟件的“Macromolecules” 模塊下的 “Build and Edit Protein”工具，將篩選出的多肽序列按照特定順序輸入到程序中；利用“Small Molecules”模塊下的“Minimize Ligands”和“Prepare Ligands”工具對(duì)肽的結(jié)構(gòu)在CHARMm 力場(chǎng)下進(jìn)行能量?jī)?yōu)化。

1.9.2 準(zhǔn)備受體蛋白 從RCSB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）獲取Keap1 蛋白的天然晶體結(jié)構(gòu)（PDB 代碼：2FLU）。使用DS 軟件打開PDB文件，刪除水分子、氫原子及原有受體所攜帶的配體，并對(duì)蛋白進(jìn)行加氫處理，再使用“Macromolecules”模塊下的“Clean Protein”工具除去蛋白多構(gòu)象，使Keap1 蛋白補(bǔ)充完整的氨基酸殘基。通過DS 軟件的“Receptor-Ligand Interactions”模塊下的“Define and Edit Binding site”工具定義受體靶標(biāo)活性位點(diǎn)，活性中心坐標(biāo)（X：5；Y：9；Z：1），對(duì)接半徑為15?[32]。

1.9.3 半柔性分子對(duì)接 使用DS 軟件的“Receptor-Ligand Interactions” 模塊下的“Dock Ligands（CDOCKER）”，在“Input Ligands”欄選擇全部?jī)?yōu)化后的配體，其余參數(shù)默認(rèn)不變。將受體定義為剛性，配體定義為半柔性，進(jìn)行半柔性分子對(duì)接，根據(jù)“-CDOCKER Energey”值評(píng)定分子對(duì)接效果。

1.10 分子動(dòng)力學(xué)模擬

使用DS 軟件的“Simulation”模塊進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，將最終所篩選出的CDEF 肽序列-Keap1 最優(yōu)結(jié)合復(fù)合物結(jié)構(gòu)在“Macromolecules”模塊下的 “Prepare protein” 進(jìn)行蛋白質(zhì)預(yù)處理，在“Simulation”模塊下的“Apply forcefield”為蛋白復(fù)合物添加charmm36 力場(chǎng)，用“Solvation”對(duì)其進(jìn)行溶劑化處理，在“Run simulation”中的“Standard Dynamics Cascade”進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，參數(shù)設(shè)置如下：升溫階段由50 K 逐漸加熱至300 K，模擬加熱時(shí)間4 ps，平衡階段模擬時(shí)間設(shè)置為20 ps，模擬采樣階段設(shè)置為0.2 ns[33]。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳清蛋白的虛擬酶解及抗氧化肽的篩選

為了在人體內(nèi)發(fā)揮生物效應(yīng)，生物活性肽必須經(jīng)過胃腸道消化，然后在胃腸道吸收后以活性分子形式到達(dá)其目標(biāo)部位[34]。因此本研究將牛乳清蛋白源的主要5 種蛋白成分用胃蛋白酶（EC 3.4.23.1）和胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）虛擬消化，通過虛擬消化程序，計(jì)算出β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白、牛血清白蛋白及牛乳鐵蛋白的水解度分別為28.25%，24.82%，21.43%，29.87%及27.16%，結(jié)果表明牛血清白蛋白被兩種酶水解程度最大，可能會(huì)消化產(chǎn)生相對(duì)更多的肽段。然后將消化后得到的多肽用PeptideRanker 程序進(jìn)行生物活性肽評(píng)分預(yù)測(cè)，并將PeptideRanker 評(píng)分＞0.4的生物活性肽篩選出來，最終與BIOPEP-UWM 和SATPdb 數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的活性肽序列進(jìn)行對(duì)比，具體篩選評(píng)分結(jié)果見表1。

表1 虛擬酶解及數(shù)據(jù)庫分析得到的肽Table 1 Peptides obtained by virtual enzymatic hydrolysis and database analysis

研究表明抗氧化肽具有以下特征：1）抗氧化肽一般含有0～20 個(gè)氨基酸；2）肽序列中含有Pro、Gly、Ala、Val 和Leu 的蛋白肽具有潛在的抗氧化活性；3）帶有芳香環(huán)（Tyr、Trp、Phe）、咪唑基（His）和含硫基（Met、Cys）的肽鏈直接淬滅自由基[35]。由表1 可知，5 種蛋白質(zhì)（β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白、牛血清白蛋白及牛乳鐵蛋白）分別篩選出11，8，38，36，44 條生物活性評(píng)分大于0.4 的肽段，一共137 條多肽，大多數(shù)篩選出的多肽符合抗氧化肽的特征性。接下來對(duì)比BIOPEP-UWM 和SATPdb 數(shù)據(jù)庫，對(duì)未報(bào)道過的多肽進(jìn)行毒性、過敏性及水溶性分析，通過3 項(xiàng)評(píng)價(jià)進(jìn)一步篩選出無毒、無過敏性及水溶性良好的抗氧化肽，詳細(xì)結(jié)果見表2。

表2 肽的毒性、過敏性及水溶性分析Table 2 Toxicity，allergy and water solubility analysis of peptides

采用ToxinPred 程序?qū)Χ嚯倪M(jìn)行毒性預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示絕大多數(shù)肽在此程序設(shè)定的2 種模型下表現(xiàn)為無毒。乳蛋白的過敏性是乳制品中不可忽視的重要因素，乳清蛋白中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白是除酪蛋白外的嬰兒牛乳過敏癥的主要致敏因子[36]，因此需要對(duì)乳清蛋白源抗氧化肽進(jìn)行過敏性預(yù)測(cè)。通過AllerTOP v.2.0 程序預(yù)測(cè)肽的過敏性，結(jié)果顯示大約50%的的多肽被預(yù)測(cè)為具有過敏性，說明牛乳清蛋白在經(jīng)過胃腸道消化后依然會(huì)有許多過敏性多肽產(chǎn)生。多肽的水溶性是其在機(jī)體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)分布的基礎(chǔ)，也是應(yīng)用食品、生物及材料化學(xué)研究時(shí)需要考慮的重要指標(biāo)[37]。通過Innovagen 網(wǎng)站預(yù)測(cè)肽的水溶性，結(jié)果顯示有近一半多肽的水溶性被判定為差。綜合分析毒性、過敏性及水溶性3 項(xiàng)性質(zhì)，可以發(fā)現(xiàn)α-乳白蛋白源的多肽沒有同時(shí)符合無毒、無過敏性及水溶性良好的抗氧化肽，而β-乳球蛋白源的多肽只有PMHIR和DAQSAPL 序列同時(shí)符合這3 個(gè)條件。將同時(shí)符合3 個(gè)條件下的多肽進(jìn)行相關(guān)物理化學(xué)分析，詳細(xì)結(jié)果見表3。

表3 肽的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)及pH=7 時(shí)的凈電荷分析Table 3 Molecular weight，isoelectric point and net charge analysis at pH=7 of peptide

2.2 藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析

藥物代謝動(dòng)力學(xué)是一門傳統(tǒng)上的生命科學(xué)學(xué)科，可以研究藥物或候選藥物在藥理過程中的可用性，并表征其進(jìn)入機(jī)體體內(nèi)吸收、轉(zhuǎn)移及代謝的生物轉(zhuǎn)化過程[38]。研究多肽的藥物代謝動(dòng)力學(xué)行為可有效地指導(dǎo)多肽的結(jié)構(gòu)優(yōu)化與系統(tǒng)篩選，對(duì)藥物的深入開發(fā)及應(yīng)用具有重大意義[39]。

2.2.1 多肽的ADMET 分析 ADMET 是一種基于機(jī)器學(xué)習(xí)的有助于預(yù)測(cè)和篩選良好候選藥物的方法，可以減少對(duì)藥物進(jìn)行傳統(tǒng)試驗(yàn)方法的篩選，同時(shí)減少應(yīng)用于臨床治療時(shí)的失敗[40-41]。多肽的ADMET 分析如表4、5 所示，所有乳清蛋白源的多肽序列的人體腸道吸收（HIA）均很差，這是因?yàn)楸狙芯窟x用的是生物體胃腸道中存在的胃蛋白酶和胰蛋白酶，獲得的抗氧化肽會(huì)抵御胃腸道的消化吸收，這并不意味著其抗氧化能力無法在機(jī)體中表現(xiàn)出來，一些抗氧化肽的抗氧化作用的表達(dá)往往需要能夠抵御胃腸道的消化作用[42]。除了免疫球蛋白源的YWCK 和牛血清白蛋白源的QNCDQF 肽序列在25 ℃水溶性表現(xiàn)為非常高，其余多肽在25 ℃水溶性都表現(xiàn)為極高，這說明所有多肽都具有良好的水溶性，同時(shí)也印證了前文通過Innovagen 網(wǎng)站預(yù)測(cè)肽的水溶性的準(zhǔn)確性。多肽的血腦屏障通透性（BBB）均表現(xiàn)為未定義，通過打分?jǐn)?shù)字的命名規(guī)律以及腸道吸收率可以預(yù)測(cè)出其對(duì)血腦屏障的穿透性也很低[43]。所有多肽均無細(xì)胞色素P450 2D6 抑制性。除β-乳球蛋白源的DAQSAPL、免疫球蛋白源的CPR 及牛乳鐵蛋白源的CAGDDQGL、AAPR 肽序列有肝毒性，其余多肽均無肝毒性。血漿蛋白與藥物分子的結(jié)合會(huì)影響藥物的效率，因?yàn)榻Y(jié)合部分會(huì)暫時(shí)避免代謝，所有多肽的血漿蛋白結(jié)合率（PPB）均小于90%，表明其均不會(huì)影響藥物結(jié)合的效率。

表4 Admet 評(píng)分參考表Table 4 Reference table of ADMET score

表5 肽的ADMET 分析Table 5 ADMET analysis of peptides

2.2.2 多肽的TOPKAT 分析 TOPKAT 是根據(jù)其二維分子結(jié)構(gòu)來準(zhǔn)確、快速地評(píng)估化學(xué)品毒性的預(yù)測(cè)手段，DS 軟件中使用了一系列穩(wěn)定的、交叉驗(yàn)證的、定量的結(jié)構(gòu)-毒性關(guān)系（QSTR）模型來評(píng)估化合物特定的毒理學(xué)性質(zhì)。肽的Topkat 毒性分析詳情見表6、7。

表6 Topkat 評(píng)分參考表Table 6 Topkat scoring reference table

表7 肽的Topkat 毒性分析Table 7 Topkat toxicity analysis of peptides

埃姆斯致突變性模型是根據(jù)美國(guó)環(huán)保署基因毒素協(xié)議檢測(cè)的化合物開發(fā)出來的，結(jié)果顯示所有多肽序列均無致突變性。美國(guó)國(guó)家毒理學(xué)計(jì)劃（National toxicology program，NTP）和美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）數(shù)據(jù)集下的嚙齒動(dòng)物致癌性模型均是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和交叉驗(yàn)證的定量結(jié)構(gòu)-毒性關(guān)系（QSTR）模型，結(jié)果顯示所有多肽在NTP 數(shù)據(jù)集下的嚙齒動(dòng)物致癌性模型（包含雌性大小鼠和雄性大小鼠）中均無致癌性；在FDA 數(shù)據(jù)集下的嚙齒動(dòng)物致癌性模型中，β-乳球蛋白源的PMHIR 肽序列在雌性小鼠模型中表現(xiàn)為單劑量致癌性，在雄性小鼠模型中表現(xiàn)為多劑量致癌性，其次免疫球蛋白源的CPR 和YWCK、牛乳鐵蛋白源SQSCAPGADPK 和AAPR 肽序列在雌性大鼠模型中表現(xiàn)為單劑量致癌性，而免疫球蛋白源（牛乳鐵蛋白源）的QGR 和GGK、牛血清白蛋白源的CCTK 及牛乳鐵蛋白源的肽序列在雄性小鼠模型中表現(xiàn)為多劑量致癌性，在雌性大鼠模型中表現(xiàn)為單劑量致癌性，最后牛乳鐵蛋白源的CAGDDQGL 肽序列在雄性小鼠模型中表現(xiàn)為多劑量致癌性。嚙齒動(dòng)物致癌性證據(jù)權(quán)重模型是使用美國(guó)食品和藥物管理局藥物評(píng)估和研究中心證據(jù)權(quán)重協(xié)議所制定的QSTR 模型，結(jié)果顯示所有多肽在此模型下均無致癌性。潛在發(fā)育毒性模型是來源于374 篇開放文獻(xiàn)中開發(fā)得到的，此模型僅包括大鼠口服的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示免疫球蛋白源（牛乳鐵蛋白源）的QGR、牛血清白蛋白源的GEYGF 在此模型下表現(xiàn)為有毒，其余多肽均表現(xiàn)為無毒。

DS 軟件中關(guān)于大鼠耐受劑量預(yù)測(cè)主要包括致癌潛能TD50、大鼠口服LD50、大鼠最大耐受劑量及大鼠長(zhǎng)期口服最低毒副反應(yīng)水平，耐受劑量多少可為后續(xù)多肽應(yīng)用于食品、生物及醫(yī)療方面提供理論數(shù)據(jù)支持，詳細(xì)結(jié)果見表8。

表8 Topkat 預(yù)測(cè)相關(guān)大鼠耐受劑量表Table 8 Tolerance dose table of Topkat prediction related rats

綜合分析以上藥物代謝動(dòng)力學(xué)結(jié)果，將在所有ADMET 和TOPKAT 數(shù)據(jù)模型下無毒、無致突變性及無致癌性的多肽序列篩選出來用于分子對(duì)接分析，可以發(fā)現(xiàn)β-乳球蛋白源的序列在此環(huán)節(jié)中無符合全部條件的多肽。

2.3 分子對(duì)接

在生物活性肽研究領(lǐng)域，分子對(duì)接可以基于結(jié)構(gòu)構(gòu)象表征肽在受體蛋白結(jié)合位點(diǎn)的行為，分子對(duì)接過程包括預(yù)測(cè)受體內(nèi)配體的分子方向，然后使用結(jié)合親和力評(píng)分函數(shù)計(jì)算受體-配體的互補(bǔ)相互作用[44-45]。雖然蛋白質(zhì)水解物和肽的抗氧化作用的潛在機(jī)制尚未完全研究清楚，但據(jù)報(bào)道Keap1-Nrf2 通路是消除體內(nèi)氧化應(yīng)激的最可能機(jī)制，在Keap1-Nrf2 通路中，Nrf2 因子在遷移到細(xì)胞核后可與抗氧化反應(yīng)元件ARE 序列結(jié)合，并啟動(dòng)血紅素加氧酶1 的表達(dá)，從而激活抵抗氧化應(yīng)激的防御系統(tǒng)[46]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激條件下，外來的抗氧化劑會(huì)干擾Keap1-Nrf2 相互作用，從而最終激活A(yù)RE 序列調(diào)控細(xì)胞內(nèi)一系列具有抗氧化功能的酶（如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶等）的基因表達(dá)，從而促進(jìn)機(jī)體的抗氧化能力[47]。為了進(jìn)一步篩選乳清蛋白源抗氧化肽，并解釋抗氧化肽的在Keap1-Nrf2抗氧化通路的分子機(jī)制，對(duì)乳清蛋白源抗氧化肽進(jìn)行分子對(duì)接分析。準(zhǔn)備好的受體蛋白見圖1 所示。

圖1 原始蛋白（a）及準(zhǔn)備好的受體蛋白（b）Fig. 1 Original protein（a）and prepared receptor protein（b）

2.3.1 分子對(duì)接評(píng)分 乳清蛋白源生物活性肽可以通過分子對(duì)接的方式研究其生物活性，如Li等[48]借助分子對(duì)接研究了乳清蛋白水解物中的4種多肽（PQVSTPTL、MPGP、PMHIR、PPLT）的ACE抑制機(jī)理，結(jié)果顯示乳清蛋白水解物可能是獲得新型ACE 抑制肽的合適來源。對(duì)接結(jié)果中“-CDOCKER Energy” 值是受體與配體相互作用力或結(jié)合親和力的評(píng)分，其值相對(duì)越高，表示受體與配體結(jié)合的越緊密、越容易[49]。本研究通過將前步篩選得到的13 條乳清蛋白源抗氧化肽與Keap1 受體進(jìn)行分子對(duì)接，并選擇文獻(xiàn)中報(bào)道過的乳清蛋白源抗氧化肽WYSL[50]作為陽性對(duì)照也與Keap1 受體進(jìn)行分子對(duì)接，具體對(duì)接結(jié)果見表9。

分子對(duì)接結(jié)果顯示，相較陽性對(duì)照抗氧化肽WYSL，本研究篩選出的乳清蛋白源抗氧化肽的“-CDOCKER Energy”大多數(shù)高于WYSL 序列，說明篩選出的抗氧化肽能夠較好地與Keap1 蛋白結(jié)合從而發(fā)揮抗氧化性，同時(shí)也印證了本研究前面篩選步驟的真實(shí)性與可靠性。選取“-CDOCKER Energy” 值排名前4 位的多肽以及陽性對(duì)照（WYSL 序列）與Keap1 受體進(jìn)行相互作用分析。

2.3.2 分子對(duì)接相互作用分析 Keap1 的分子突變?cè)囼?yàn)證明，ETGE 基序是與Keap1 的Kelch 結(jié)構(gòu)域結(jié)合時(shí)關(guān)鍵基序[51]。研究表明，接觸ETGE 基序相互作用的殘基分別是3 個(gè)Arg 殘基（Arg380、Arg415 和Arg483）、4 個(gè)Ser 殘基（Ser363、Ser508、Ser555 和Ser602），以及Kelch 結(jié)構(gòu)域中Tyr334、Asn382 和Gln530 的殘基，此外Asn387、His436、Tyr525、Tyr572 和Phe577 的殘基在Keap1-Nrf2蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中也起著關(guān)鍵作用[52]。圖2～6 表示的是陽性對(duì)照（WYSL 序列）、選定的4 個(gè)多肽分別與Keap1 活性位點(diǎn)分子對(duì)接相互作用的結(jié)果圖（包括3D 和2D 模式圖）。陽性對(duì)照（WYSL序列）為已報(bào)道過的乳清蛋白源抗氧化肽，在體外試驗(yàn)驗(yàn)證中表現(xiàn)出良好的抗氧化性[50]。圖2 對(duì)接結(jié)果顯示W(wǎng)YSL 序列與Keap1 分子的氨基酸殘基Arg415 和Arg483 之間形成鹽橋和電荷吸引力，與氨基酸Ser508、Arg483 之間形成常規(guī)氫鍵，與氨基酸殘基Tyr572 之間形成碳?xì)滏I和π-供體氫鍵，與氨基酸殘基Phe577、Tyr572 之間形成π-π相互作用，與氨基酸殘基Tyr525、Tyr572 之間疏水相互作用，與氨基酸殘基Tyr334、Arg380、Asn414、Ile461、Phe478、Ala556、Ser555、Gln530 之間形成范德華力。其中9 個(gè)氨基酸殘基Arg415、Arg483、Ser508、Tyr572、Tyr525、Tyr334、Arg380、Ser555、Gln530 是影響Keap1-Nrf2 相互作用的關(guān)鍵殘基，因此陽性對(duì)照（WYSL 序列）具有在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化性的潛力，驗(yàn)證了前人的結(jié)論。圖3 對(duì)接結(jié)果顯示EDEGWYWCGVK 序列與Keap1 分子的氨基酸殘基Arg483、Arg380、Arg415 之間形成鹽橋、電荷吸引力及π-陽離子作用，與氨基酸殘基Arg415、Asn414 之間形成常規(guī)氫鍵，與氨基酸殘基Tyr334、Gly462、Gly511、Leu557、Ala366、Val418、Gly603 之間形成碳?xì)滏I和π-供體氫鍵，與氨基酸殘基 Gly574、Tyr572、Asn382、Phe577、Ser363、Gly509、Ile416、Ala510、Val463、Gly464、Gly558、Gly417、Gln530、Tyr525、Ser555、Ser602、Gly364、Ala556、Leu365、Gly605、Ile461、Ile559、Val604、Val606、Val512、Val465 之間形成范德華力。其中11 個(gè)氨基酸殘基Arg483、Arg380、Tyr334、Tyr572、Asn382、Phe577、Ser363、Gln530、Tyr525、Ser555、Ser602 是影響Keap1-Nrf2 相互作用的關(guān)鍵殘基，說明EDEGWYWCGVK 序列也具有在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化性的潛力。圖4 對(duì)接結(jié)果顯示QNCDQF 序列與Keap1 分子的氨基酸殘基Arg483、Arg415 之間形成鹽橋，與氨基酸殘基Arg380、Gln530 形成常規(guī)氫鍵，與氨基酸殘基Tyr334 形成π-π 相互作用，而同時(shí)也與氨基酸殘基Tyr334 之間形成不利的供體-供體相互作用，與氨基酸殘基Asn382、Ser602、Ser363、Gly603、Gly364、Tyr572、Phe577、Tyr525、Ala556、Asn414、Ser555 之間形成范德華力。其中11 個(gè)氨基酸殘基Arg483、Arg415、Arg380、Tyr334、Asn382、Ser602、Ser363、Tyr572、Phe577、Tyr525、Ser555 是影響Keap1-Nrf2 相互作用的關(guān)鍵殘基，說明QNCDQF 序列也具有在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化性的潛力。圖5 對(duì)接結(jié)果顯示CDEF 序列與Keap1 分子的氨基酸殘基Arg483、Arg415、Arg380 之間形成鹽橋、電荷吸引力及π-陰離子作用，氨基酸殘基Ser508、Asn414、Tyr334、Asn382、Arg483、Arg380 之間形成常規(guī)氫鍵，與氨基酸殘基Arg415 之間形成碳?xì)滏I，而與氨基酸殘基Arg415 之間形成不利的陽性-陽性相互作用，與氨基酸殘基Tyr525 之間形成π-π 相互作用，與氨基酸殘基Gln530、Ser555、Gly509、Ile461、Ala556、Ser602、Ser363、Gly364、Gly603、Tyr572 之間形成范德華力。其中12 個(gè)氨基酸殘基Arg483、Arg415、Arg380、Ser508、Tyr334、Tyr334、Tyr525、Gln530、Ser555、Ser602、Ser363、Tyr572 是影響Keap1-Nrf2 相互作用的關(guān)鍵殘基，說明CDEF 序列也具有在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化性的潛力。圖6 對(duì)接結(jié)果顯示DEF 序列與Keap1 分子的氨基酸殘基Arg483、Arg415、Arg380、Tyr334 之間形成鹽橋和電荷吸引力，與氨基酸殘基Ser508、Arg415、Asn414、Arg380、Asn382、Tyr334 之間形成常規(guī)氫鍵，與氨基酸殘基Arg415 之間形成碳?xì)滏I，而與氨基酸Arg380 之間形成不利的陽性-陽性相互作用，與氨基酸殘基Tyr572 之間形成π-π 相互作用，與氨基酸殘基Ala556 之間形成疏水相互作用，與氨基酸殘基Phe577、Ser602、Ser555、Tyr525、Gln530、Ile461 之間形成范德華力。其中11 個(gè)氨基酸殘基Arg483、Arg415、Arg380、Tyr334、Ser508、Tyr334、Phe577、Ser602、Ser555、Tyr525、Gln530 是影響Keap1-Nrf2 相互作用的關(guān)鍵殘基，說明DEF序列也具有在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化性的潛力。

圖2 陽性對(duì)照（WYSL 序列）與Keap1 活性位點(diǎn)相互作用的3D（a）和2D（b）模式圖Fig. 2 3D（a）and 2D（b）pattern of interaction between positive control（WYSL sequence）and Keap1 active site

圖3 EDEGWYWCGVK 與Keap1 活性位點(diǎn)相互作用的3D（a）和2D（b）模式圖Fig. 3 3D（a）and 2D（b）mode diagram of the interaction between EDEGWYWCGVK and Keap1 active site

圖4 QNCDQF 與Keap1 活性位點(diǎn)相互作用的3D（a）和2D（b）模式圖Fig. 4 3D（a）and 2D（b）pattern of interaction between QNCDQF and Keap1 active site

圖5 CDEF 與Keap1 活性位點(diǎn)相互作用的3D（a）和2D（b）模式圖Fig. 5 3D（a）and 2D（b）pattern of interaction between CDEF and Keap1 active site

圖6 DEF 與Keap1 活性位點(diǎn)相互作用的3D（a）和2D（b）模式圖Fig. 6 3D（a）and 2D（b）pattern of interaction between DEF and Keap1 active site

綜合分析上述結(jié)果，4 種所選多肽相較陽性對(duì)照（WYSL 序列）均具有更多影響Keap1-Nrf2相互作用的重要?dú)埢f明本研究前期抗氧化肽篩選過程的合理性與嚴(yán)謹(jǐn)性。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)所選4 種多肽中的CDEF 序列與Keap1 分子間存在最多影響Keap1-Nrf2 相互作用的關(guān)鍵殘基（12 個(gè)），同時(shí)也存在最多的氫鍵作用力（6 個(gè)），因此CDEF序列可能是所選肽段中具有最高抗氧化活性的多肽序列，它可以與Keap1 分子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合并釋放Nrf2 因子，并通過激活Keap1-Nrf2-ARE 途徑在體內(nèi)顯示抗氧化活性。與本研究結(jié)果相似的是，Wei 等[53]從發(fā)酵魯賓奶酪中獲得的YPFPGPIH 肽序列也可以激活Keap1-Nrf2 途徑激活抗氧化機(jī)制。

2.4 分子動(dòng)力學(xué)模擬

分子對(duì)接是從結(jié)構(gòu)的角度出發(fā)去評(píng)估對(duì)接結(jié)合的緊密程度，而藥物的設(shè)計(jì)不能單從結(jié)構(gòu)出發(fā)，往往需要考慮溶劑、溫度及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的因素，分子動(dòng)力學(xué)模擬是量化局部和全局蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的強(qiáng)大計(jì)算工具[54]。從分子對(duì)接中篩選出的最具抗氧化活性潛力的CDEF 序列，將其與Keap1 分子最優(yōu)結(jié)合復(fù)合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，具體模擬結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示，CDEF-Keap1 復(fù)合物在分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中，RSMD 在所產(chǎn)生的100 個(gè)構(gòu)象中逐漸穩(wěn)定，最終在200 ps 左右穩(wěn)定時(shí)結(jié)合自由能約為210.87 kJ/mol，說明復(fù)合物在分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中結(jié)構(gòu)變化相對(duì)平穩(wěn)，氫鍵熱圖說明了復(fù)合物在模擬過程中與較多小分子形成氫鍵作用力，在前80 個(gè)構(gòu)象氫鍵變化并不顯著，因此可判斷出復(fù)合物可能沒有經(jīng)歷較大的構(gòu)象變化[55]。進(jìn)一步說明了篩選出的抗氧化肽CDEF 可以在人體中較好地發(fā)揮其抗氧化活性。

圖7 CDEF-Keap1 復(fù)合物的分子動(dòng)力學(xué)模擬RMSD 圖（a）、能量變化圖（b）及氫鍵熱圖（c）Fig. 7 Molecular dynamics simulation RMSD diagram（a），energy change diagram（b）and hydrogen bond heat diagram（c）of CDEF-keap1 complex

3 結(jié)論

本研究通過虛擬消化牛乳清蛋白，將能夠抵御胃腸道消化的肽段進(jìn)行初步酶解篩選，并通過相關(guān)活性預(yù)測(cè)及藥物代謝動(dòng)力學(xué)對(duì)肽段進(jìn)行細(xì)致篩選，將無毒、無致敏性、無致突變性、無致癌性及水溶性良好的肽段挑選出來，并對(duì)符合條件的肽段與Keap1 受體進(jìn)行半柔性分子對(duì)接，通過分子對(duì)接評(píng)分和作用機(jī)理分析對(duì)肽段的抗氧化活性潛力進(jìn)行評(píng)估，最終篩選出了最具抗氧化活性潛力的CDEF 肽序列，其與Keap1 受體的氨基酸殘基Arg483、Arg415、Arg380、Ser508、Tyr334、Tyr334、Tyr525、Gln530、Ser555、Ser602、Ser363、Tyr572 之間形成的鹽橋、電荷吸引力、π-陰離子作用、常規(guī)氫鍵、碳?xì)滏I、π-π 相互作用及范德華力，可能有助于激活Keap1-Nrf2-ARE 途徑使其在體內(nèi)顯示抗氧化活性。分子動(dòng)力學(xué)模擬分析表明CDEF 肽序列具有良好的結(jié)合能力與穩(wěn)定性，可能成為抗氧化的候選藥物。本研究基于生物信息學(xué)的手段詳細(xì)闡述了如何從牛乳清蛋白源篩選出抗氧化肽，研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)肽的抗氧化作用機(jī)制有一定的指導(dǎo)意義，為后續(xù)篩選天然食品源抗氧化肽提供了一定的理論基礎(chǔ)。