檀茜倩，王 丹，王曉晴，崔方超，呂欣然，李學鵬，李英美，勵建榮*

（1 渤海大學食品科學與工程學院/海洋研究院 遼寧錦州121013 2 達蓮食品（錦州）有限公司 遼寧錦州 121019）

蛋白酶是一種水解肽鍵的酶類[1]，其來源廣泛，微生物是蛋白酶的一類重要來源。微生物源蛋白酶的利用率高[2]且穩(wěn)定性好，在較高溫度、極端pH 值條件、表面活性劑和有機溶劑存在的情況下仍能夠保持較高活力[3-4]。發(fā)酵是一種傳統(tǒng)的食品加工方式，對于海產(chǎn)品這類營養(yǎng)豐富而容易腐敗的食品來說，發(fā)酵處理不僅能在一定程度上延長食品貨架期，還能獲得特殊風味。產(chǎn)蛋白酶菌株在海產(chǎn)品發(fā)酵中起到了非常重要的作用。產(chǎn)蛋白酶菌株的存在一方面可加速發(fā)酵過程以及改善發(fā)酵食品的風味和品質(zhì)。有研究利用從發(fā)酵魚湯、魚露廠、鹽晶和鹽鍋中分離的多株產(chǎn)蛋白酶菌株作為發(fā)酵劑發(fā)酵生產(chǎn)魚露，相對于未接種發(fā)酵劑的自然發(fā)酵方式，更能促進魚露特定香氣和風味的形成[5]。Peinado 等[6]利用蛋白酶酶解水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物生產(chǎn)魚粉，發(fā)現(xiàn)能顯著改善魚粉風味，尤其是使其腥味降低。然而，產(chǎn)蛋白酶菌株在海產(chǎn)品的發(fā)酵中也有不利影響。研究發(fā)現(xiàn)部分菌株（例如維氏氣單胞菌等）蛋白酶的分泌與發(fā)酵食品腐敗變質(zhì)密切相關(guān)[7-8]?；谝陨? 個出發(fā)點考慮，本研究以自制發(fā)酵海產(chǎn)品為研究對象，對其中產(chǎn)蛋白酶菌株進行了篩選，并對其中部分產(chǎn)蛋白酶菌株的生長特性以及其產(chǎn)生蛋白酶的酶學性質(zhì)進行了分析，以期為海產(chǎn)品發(fā)酵酶解菌種開發(fā)和避免發(fā)酵海產(chǎn)品變質(zhì)提供一定借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗原料 自制腌制發(fā)酵蛤蜊、蝦蛄、海參腸等海產(chǎn)品。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 細菌DNA 提取試劑盒、PCR 擴增試劑預混液、細菌通用引物，生工生物工程（上海）股份有限公司；福林酚試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、氫氧化鈉、無水乙醇、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、氯化亞鐵、三氯化鐵、氯化銅、EDTA等均為國產(chǎn)分析純級，上海帝博思生物科技公司；LB 營養(yǎng)瓊脂、LB 液體培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；改良脫脂乳培養(yǎng)基（10.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，水1.0 L，pH 7.2～7.4），115 ℃滅菌15 min備用。

1.2 設備與儀器

BagMixer 400 均質(zhì)器，法國Interscience 公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；Thermo Sorvall Legend Micro21R臺式微量離心機，美國賽默飛世爾科技公司；LRH-250A 型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；MS105DU 電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；GelDoc XR+全自動凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；PCR 儀，德國Eppendorf 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的初篩和分離純化 在無菌環(huán)境下取各樣品10.0 g，加入無菌生理鹽水90 mL，梯度稀釋后，涂布于LB 固體培養(yǎng)基，每個梯度做3 個平行，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后挑取不同形態(tài)菌株進行純化培養(yǎng)和革蘭氏染色，將分離的菌株凍存于-80 ℃冰箱。

1.3.2 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選 將保藏在-80 ℃冰箱的菌株活化后接種于LB 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后將菌液以10 000 r/min 離心10 min，留取上清液。參考耿芳等[9]的方法適當修改，采用牛津杯法篩選產(chǎn)蛋白酶菌株，具體方法為將滅菌處理后的牛津杯放入平板后將脫脂乳固體培養(yǎng)基倒入平板，待其凝固后，取出牛津杯，在孔內(nèi)加入150 μL分離菌株上清液，無菌水做陰性對照，在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后測量透明圈直徑，探究其產(chǎn)蛋白酶情況。

1.3.3 產(chǎn)蛋白酶菌株鑒定 對在平板上形成透明圈的產(chǎn)蛋白酶菌株按照細菌DNA 提取試劑盒說明完成菌株DNA 提取。采用細菌通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’），以所提取各菌株DNA 為模板進行PCR 擴增，對PCR 產(chǎn)物檢測合格后送上海生工生物科技有限公司測序，測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫對比，用MAGE7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 菌株產(chǎn)蛋白酶酶活測定 參照曹慧等[10]的方法并作適當修改以分離粗蛋白酶。將37 ℃培養(yǎng)24 h 后的菌液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，于4 ℃、10 000 r/min 下離心10 min，所得上清液為胞外蛋白酶粗酶液，保存于4 ℃冰箱內(nèi)并于12 h 內(nèi)使用。按照國標GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》中的福林酚顯色法測定蛋白酶活力[11]。吸取0.5%的酪蛋白溶液2 mL，在40 ℃水浴加熱5 min，加入預熱的粗酶液1 mL，反應10 min 后加入10%三氯乙酸溶液3 mL，孵育15 min 終止反應，以無菌水代替粗酶液作為陰性對照。將反應液在12 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL 加入5 mL 碳酸鈉溶液（0.55 mol/L）和1 mL 福林酚試劑，處理15 min后在波長680 nm 處測定樣品及對照組樣品的吸光度值（A）。根據(jù)公式（1）計算粗酶液酶活力。

式中，A樣——樣品吸光度值；A對——對照組樣品吸光度值；K——標準曲線為1 時對應酪氨酸的含量，μg；t——酶促反應時間，10 min；V——酶促反應總體積，6 mL。

1.3.5 產(chǎn)蛋白酶菌株生物學特性分析

1.3.5.1 溫度對菌株生長的影響 參照Shu 等[12]的方法作適當修改。按照3%的接種量將菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基并置于不同溫度（20，25，28，30，37，40 ℃）培養(yǎng)24 h，在波長600 nm 處根據(jù)測得各溫度菌株隨時間生長的吸光度值變化判斷溫度對菌株生長的影響。

1.3.5.2 pH 值對菌株生長的影響 參照Sun 等[13]的方法作適當修改。按照3%接種量將活化后的菌株接種于pH 值分別為1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5 的LB 液體培養(yǎng)基中，置于37℃搖床培養(yǎng)24 h 后測定波長600 nm 處菌株生長的吸光度值變化判斷pH 值對菌株生長的影響。

1.3.5.3 鹽質(zhì)量濃度對菌株生長的影響 參考宋夢思等[14]的方法，按照3%接種量將活化后的菌株接種于鹽質(zhì)量濃度為10，20，30，40，50，60，70 g/L的LB 液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)24 h 后測定波長600 nm 處菌株生長的吸光度值變化判斷鹽質(zhì)量濃度對菌株生長的影響。

1.3.6 蛋白酶酶學性質(zhì)分析 選取產(chǎn)蛋白酶活力較高的不同種菌株進行蛋白酶酶學特性分析。

1.3.6.1 溫度對酶活力的影響 分別在10，20，30，40，50，60 ℃條件下測定粗酶液酶活力，判斷溫度對酶活力的影響。

1.3.6.2 pH 值對酶活力的影響 參考Sun 等[15]的方法，將粗酶液與pH 值為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0 的酪蛋白底物在上述最適溫度下反應，測得相應酶活力，判斷pH 值對酶活力的影響。

1.3.6.3 金屬離子和抑制劑對蛋白酶活力的影響參照李丹陽等[16]的方法并作適當修改。分別將粗酶液與添加1 mmol/L 和10 mmol/L 的不同金屬離子（Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+）氯化物鹽溶液和抑制劑EDTA 共孵育30 min，將沒有添加金屬離子和抑制劑的蛋白酶活性定義為100%，測定在金屬離子和抑制劑的作用下粗酶液相對酶活的變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的分離培養(yǎng)與鑒定

產(chǎn)蛋白酶微生物種類很多，分布于類桿菌門、變形桿菌門、放線桿菌門、熱變形球菌門等多個門中[17]。本研究從發(fā)酵海產(chǎn)品中分離得到多株菌株，經(jīng)改良脫脂乳平板篩選后發(fā)現(xiàn)10 株菌株具有產(chǎn)蛋白酶能力。以菌株DNA 為模板利用細菌通用引物對菌株16S rRNA 基因序列進行擴增，在1 000 bp 附近均出現(xiàn)明顯條帶（圖1）。

圖1 菌株的16S rRNA 基因PCR 擴增電泳圖Fig. 1 Electrophoretic of PCR amplification products of 16S rRNA gene of the isolated strains

將PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫對比并經(jīng)過系統(tǒng)發(fā)育樹分析后得到的菌株鑒定結(jié)果如表1 所示，分離培養(yǎng)得到表型不同的菌株分別為革蘭氏陽性菌的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）S1YBB、S1YB，藤黃色微球菌（Micrococcus luteus）C1Y1，海氏腸球菌（Enterococcus hirae）M1R；革蘭氏陰性菌的黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）S2DD、S2DB、C2Y3、M1B、C2J2，海 藻希瓦氏菌（Shewanella alga）C2J1。

表1 菌株鑒定結(jié)果分析Table 1 Analysis of strain identification results

菌株在LB 平板上的生長形態(tài)如圖2a 所示。貝萊斯芽孢桿菌S1YBB、S1YB 生長狀態(tài)呈現(xiàn)中間凸起，有孢子形成；黏質(zhì)沙雷氏菌S2DD、S2DB、C2Y3、M1B、C2J2 菌落邊緣清晰，有黏性；藤黃色微球菌C1Y1 呈現(xiàn)油狀金黃色；海藻希瓦氏菌C2J1 菌落表面光滑、邊緣清晰；海氏腸球菌M1R為球狀菌落。菌株粗酶提取液在改良脫脂乳平板上水解圈的形成情況如圖2b 所示，10 株菌在改良脫脂乳平板上形成大小不一的水解圈。

圖2 菌落形態(tài)（a）以及菌株粗酶提取物的蛋白水解能力（b）Fig. 2 Colony morphology of the strains（a）and the hydrolytic abilities of their crude enzyme extract（b）

2.2 菌株產(chǎn)蛋白酶酶活分析

參照國標GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》制作酪氨酸標準曲線，得標準曲線線性回歸方程式為：y=0.0097x+0.0994，其中R2=0.9992，表明線性回歸方程線性關(guān)系良好。根據(jù)福林酚試劑法對10 株菌株產(chǎn)蛋白酶活性進行測定（表2），其中黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)蛋白酶酶活相對較高，均在20 U/mL以上，最高的是黏質(zhì)沙雷氏菌S2DB 為（32.44±0.67）U/mL，藤黃色微球菌C1Y1、海藻希瓦氏菌C2J1、海氏腸球菌M1R 產(chǎn)蛋白酶酶活也可以達到20 U/mL 以上，而貝萊斯芽孢桿菌S1YBB 所產(chǎn)蛋白酶活性最低為（8.65±0.14）U/mL，相對于已報道[18]芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的酶活較低，在后續(xù)研究中可考慮對其培養(yǎng)條件進行優(yōu)化以提高產(chǎn)酶活性。本研究選取5 株產(chǎn)蛋白酶活力相對較高的不同種菌株（貝萊斯芽孢桿菌S1YB、黏質(zhì)沙雷氏菌S2DB、藤黃色微球菌C1Y1、海藻希瓦氏菌C2J1、海氏腸球菌M1R）進行后續(xù)菌株生物學和產(chǎn)蛋白酶的酶學特性分析。

表2 菌株產(chǎn)蛋白酶活力Table 2 Activities of protease produced by the strains

2.3 菌株的生物學特性分析

2.3.1 菌株的最適生長溫度 菌株的生長受溫度影響，5 株菌株在不同溫度條件下培養(yǎng)24 h 的生長情況如圖3 所示，37 ℃左右時5 株菌在LB 液體培養(yǎng)基中OD600nm普遍達到0.6～0.7，吸光度值較高，說明各菌株在此溫度下生長情況良好。在25 ℃時，菌株藤黃色微球菌C1Y1、貝萊斯芽孢桿菌S1YB 的OD600nm出現(xiàn)一定程度升高，具體原因有待于進一步分析，可能與其對溫度適應性有關(guān)。相關(guān)研究表明藤黃色微球菌[19]、芽孢桿菌[20]以及黏質(zhì)沙雷氏菌[21]生長比較適合的溫度為37 ℃，不同株之間可能由于受到分離環(huán)境影響而有所差異。

圖3 溫度對菌株生長的影響Fig. 3 Effects of temperature on bacterial growth

2.3.2 pH 值對菌株生長的影響 pH 值是影響菌株生長的另一個重要因素，也會在一定程度上影響其所分泌的蛋白酶活性[22]。不同pH 值條件對菌株生長影響如圖4 所示，5 株菌在pH 1.5～4.5 范圍內(nèi)OD600nm值較低，說明在此pH 值下菌株生長受到抑制；隨著pH 值升至4.5 左右時，菌株OD600nm值有明顯上升，pH 5.5 左右時達到最高為0.7，pH 5.5～6.5 之間菌株生長趨于平緩。其中貝萊斯芽孢桿菌S1YB 相對于其它菌株生長能力較弱，其原因可能與菌株本身特性或菌株對營養(yǎng)的不同需求有關(guān)；黏質(zhì)沙雷氏菌S2DB 在趨近于中性偏堿性條件下生長能力較好，與其它研究發(fā)現(xiàn)的黏質(zhì)沙雷氏菌在pH 為8.0 偏堿性條件下菌株生長能力更好的相關(guān)結(jié)果具有一致性[23]。

圖4 不同pH 值對菌株生長的影響Fig. 4 Effects of different pH values on bacterial growth

2.3.3 菌株的耐鹽能力分析 鹽質(zhì)量濃度的變化會通過改變細胞滲透壓影響菌株生長。不同菌株耐鹽能力分析結(jié)果如圖5 所示。在10～20 g/L 范圍，隨鹽質(zhì)量濃度升高，菌株能夠生長，OD600nm值升高，在20 g/L 時達到最大值，隨后各菌株OD600nm值隨鹽質(zhì)量濃度增加呈現(xiàn)下降趨勢，說明菌株生長受到抑制（P＜0.05）。

圖5 不同鹽質(zhì)量濃度對菌株生長的影響Fig. 5 Effects of different salt mass concentrations on bacterial growth

2.4 菌株蛋白酶的酶學性質(zhì)

2.4.1 溫度對酶活力的影響 溫度會影響蛋白酶活力發(fā)揮，溫度對粗酶活性影響如圖6 所示。研究發(fā)現(xiàn)，不同菌株提取的粗酶液在不同溫度下酶活力大小不同，在10～60 ℃內(nèi)，酶活力隨溫度升高整體呈現(xiàn)上上的趨勢，在40～50 ℃左右酶活性相對較高。相對于其它菌株來說，芽孢桿菌所產(chǎn)蛋白酶活力在一定溫度范圍內(nèi)都可以保持穩(wěn)定[24]。這與本研究所分離所分離貝萊斯芽孢桿菌S1YB 酶活力變化抑制，S1YB 在試驗溫度范圍內(nèi)整體酶活相對其它菌株所產(chǎn)酶活較高，且呈現(xiàn)上升趨勢，未出現(xiàn)酶活下降的情況。

圖6 溫度對蛋白酶活性的影響Fig. 6 Effects of temperature on protease activity

2.4.2 pH 值對酶活力的影響 pH 值對酶活力影響如圖7 所示。貝萊斯芽孢桿菌SIYB 所分泌的蛋白酶在一定pH 值范圍內(nèi)呈現(xiàn)出較高酶活力，且在pH 值為7.0 時最為穩(wěn)定；黏質(zhì)沙雷氏菌S2DB和海藻希瓦氏菌C2J1 分泌的蛋白酶也在pH 7時最為穩(wěn)定；藤黃色微球菌C1Y1 和海氏腸球菌M1R 分別在pH 值為6.0（偏酸性）和8.0（偏堿性）下較為穩(wěn)定。其中，芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶對熱和pH值的穩(wěn)定性相對較高[25-26]，與本研究所分離貝萊斯芽孢桿菌S1YB 產(chǎn)蛋白酶酶活力在pH 值變化下酶活力的變化情況一致，S1YB 所產(chǎn)蛋白酶活力在相同pH 值下均高于其它菌株所產(chǎn)蛋白酶酶活力。

圖7 pH 值對蛋白酶活力的影響Fig. 7 Effects of pH value on protease activity

2.4.3 金屬離子和抑制劑對酶活力的影響 在食品的加工過程中添加的Na+、K+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Cu2+等金屬離子也會在一定程度上影響蛋白酶活力[27-28]。本研究以不添加金屬離子的粗酶液作為對照，研究了1 mmol/L 和10 mmol/L 上述金屬離子添加對5 株菌株所分泌蛋白酶相對酶活力影響，結(jié)果如表3 和表4 所示。研究發(fā)現(xiàn)添加金屬離子后5 株菌株所分泌的蛋白酶相對活力產(chǎn)生了不同程度的下降，下降程度與金屬離子的類型和金屬離子的添加量有關(guān)。

表4 10 mmol/L 金屬離子和抑制劑對5 株菌產(chǎn)蛋白酶相對酶活力的影響Table 4 Effects of 10 mmol/L metal ions and inhibitors on the relative protease activity produced by five stains

金屬離子能提高或者降低蛋白酶的穩(wěn)定性[29]。Na+的添加可能改變蛋白酶的結(jié)構(gòu)，在10 mmol/L 的Na+作用下，雖然菌株整體蛋白酶活力有所降低，但貝萊斯芽孢桿菌S1YB、藤黃色微球菌C1Y1、海藻希瓦氏菌C2J1 相對于1 mmol/L 的Na+作用相對增強；在上述兩個濃度的Ca2+作用下也發(fā)現(xiàn)類似趨勢，Ca2+在一定溫度條件內(nèi)可穩(wěn)定蛋白酶結(jié)構(gòu)，提高蛋白酶活力，有研究發(fā)現(xiàn)一株從海洋環(huán)境中分離出的葡萄球菌BUU1，在添加Ca2+共孵育培養(yǎng)48 h 后其產(chǎn)蛋白酶活力提升了44%，很多研究表明Ca2+在提高蛋白酶活力和熱穩(wěn)定性中起到了非常重要的作用[30]。Fe2+和Fe3+的加入對菌株蛋白酶活性抑制作用明顯，可能與鐵離子與酶活性中心基團結(jié)合從而造成蛋白酶活性降低或失活有關(guān)[31]。Cu2+的添加也使得包括貝萊斯芽孢桿菌S1YB、藤黃色微球菌C1Y1、海藻希瓦氏菌C2J1菌株在內(nèi)的菌株蛋白酶活力大幅降低，可能與Cu2+造成蛋白酶活力失效有關(guān)。抑制劑EDTA 在上述濃度下對蛋白酶活性的降低也十分顯著，推測本研究分離菌株所產(chǎn)蛋白酶為半胱氨酸類酶或金屬蛋白酶，因為這類酶活性容易受到EDTA 的影響。

3 結(jié)論

本研究從發(fā)酵海產(chǎn)品中分離出10 株產(chǎn)蛋白酶菌株，并對其中5 株產(chǎn)蛋白酶活力相對較高的菌株貝萊斯芽孢桿菌S1YB、黏質(zhì)沙雷氏菌S2DD、藤黃色微球菌C1Y1、海藻希瓦氏菌C2J1、海氏腸球菌M1R 進行后續(xù)生物學和酶學特性分析。研究發(fā)現(xiàn)菌株最適生長溫度在37 ℃左右，在低pH 值（＜4.5）時幾乎不生長，最適pH 值為6.0～8.0，在鹽質(zhì)量濃度范圍10～70 g/L 菌株均呈現(xiàn)一定耐受性，最適鹽質(zhì)量濃度為20 g/L，相比于其它菌株，貝萊斯芽孢桿菌S1YB 耐鹽性較弱。酶學特性研究結(jié)果表明菌株蛋白酶活性穩(wěn)定性為50 ℃，pH 7.0，不同濃度（1 mmol/L 和10 mmol/L）金屬離子和抑制劑會造成菌株產(chǎn)生的蛋白酶活性降低。

后續(xù)可考慮對菌株蛋白酶類型和底物作用的特異性等方面進行深入研究，并在海產(chǎn)品的發(fā)酵過程中考慮提高有益微生物例如貝萊斯芽孢桿菌和海氏腸球菌等的比例，控制腐敗微生物黏質(zhì)沙雷氏菌的數(shù)量及控制其蛋白酶的產(chǎn)生，并討論以有益微生物作為發(fā)酵劑發(fā)酵海產(chǎn)品對其風味的影響。