馬世源，李子健，2，羅惠波，2，孫躍鵬，李 津，黃 丹，2*

（1 四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院 四川自貢643000 2 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川自貢643000 3 宜賓今良造制酒有限公司 四川宜賓 644000）

濃香型白酒在中國(guó)是最受歡迎的白酒，具有窖香濃郁、口感柔和甘冽、回味悠長(zhǎng)等特點(diǎn)[1]。濃香型白酒的釀造包括蒸煮、拌曲、酒醅密封發(fā)酵、蒸餾、貯存、勾調(diào)等工序[2]。在白酒釀造過(guò)程中，酒醅窖內(nèi)發(fā)酵是最重要的過(guò)程。由于濃香型白酒釀造過(guò)程是開(kāi)放式發(fā)酵，因此不同來(lái)源的微生物相互作用、此消彼長(zhǎng)，形成具有釀造功能的微生物菌群，并利用底物產(chǎn)生多種代謝物，包括醇類(lèi)、酯類(lèi)、酸類(lèi)、醛酮類(lèi)等，它們是白酒中風(fēng)味物質(zhì)的直接來(lái)源[3]。

添加功能菌是提高酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的一種常見(jiàn)的方式。黃曉寧等[4]將兩株高產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶能力的芽孢桿菌用于清香型白酒發(fā)酵過(guò)程，使得酒醅中4-乙基-2-甲氧基苯酚、辛酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、四甲基吡嗪等風(fēng)味物質(zhì)的含量升高。楊陽(yáng)等[5]通過(guò)向濃香型酒醅中添加貝萊斯芽孢桿菌，提高了己酸和己酸乙酯的含量。王曉丹等[6]在醬香酒醅中添加德巴利酵母，增加了酒醅中的多元醇含量。

然而，酒醅在混菌體系下的發(fā)酵過(guò)程中，代謝物的產(chǎn)生是以微生物組的形式實(shí)現(xiàn)的，單個(gè)物種的增加會(huì)擾動(dòng)整個(gè)微生物群落結(jié)構(gòu)，這導(dǎo)致微生物群落的代謝難以預(yù)料[7]，甚至導(dǎo)致某些目標(biāo)代謝物的含量降低[8-9]。之前的酒醅微生物研究中，有關(guān)微生物與酒醅微生物群落的互作以及對(duì)代謝功能的擾動(dòng)研究較少。此外，釀酒酵母是濃香型白酒中最重要的功能菌[10]，其具有產(chǎn)醇、產(chǎn)酯等多種重要功能[11]，然而其對(duì)酒醅微生物組的影響鮮有報(bào)道。本研究以釀酒酵母為對(duì)象，在實(shí)驗(yàn)室條件下實(shí)現(xiàn)酒醅固態(tài)發(fā)酵?；诟咄繙y(cè)序、頂空固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)合用技術(shù)（HS-SPME-GC-MS）、隨機(jī)森立機(jī)械學(xué)習(xí)算法、共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)模型、PICRUST2 功能預(yù)測(cè)、通路富集研究釀酒酵母對(duì)酒醅微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)、揮發(fā)性代謝物、群落功能的擾動(dòng)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

1.1.1 樣品和主要試劑 由濃香型白酒酒醅中分離篩選的1 株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae Y2）。本研究用酒醅、黃水、大曲均來(lái)自四川省宜賓市某濃香型白酒酒廠。

乙酸正戊酯（色譜純級(jí)），安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；乙醇、異丙醇（均為分析純級(jí)），成都科隆化學(xué)品有限公司；土壤試劑盒，美國(guó)Omega 公司。

1.1.2 主要儀器 Illumina MiSeq 高通量測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Illumina 公司；5975B-7890A 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；50/30 μm VB/CAR on PDMS 萃取頭，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酒醅發(fā)酵試驗(yàn) 在實(shí)驗(yàn)室條件下，依據(jù)濃香型白酒發(fā)酵工藝進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)[2]，發(fā)酵試驗(yàn)流程如圖1 所示。取某酒廠生產(chǎn)線上拌曲后的入窖酒醅，分裝至滅菌后的磨口瓶中，每瓶500 g。分別加入酒醅質(zhì)量2%的黃水，試驗(yàn)組加入酒醅質(zhì)量1%的濃度為107CFU/mL 的菌液。空白組補(bǔ)足相應(yīng)水分。密封后放入培養(yǎng)箱中發(fā)酵，依據(jù)實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程窖內(nèi)溫度變化規(guī)律設(shè)置培養(yǎng)箱溫度，空白組15瓶，試驗(yàn)組15 瓶。取發(fā)酵的第0，9，16，23，40 天的樣品進(jìn)行后續(xù)分析?？瞻捉M標(biāo)記為K，試驗(yàn)組標(biāo)記為S。

圖1 酒醅發(fā)酵試驗(yàn)流程圖Fig. 1 Flow chart of fermentation experiment of fermented grains

1.2.2 酒醅總DNA 提取 酒醅DNA 提取使用土壤試劑盒，混合后經(jīng)核酸濃度儀檢測(cè)DNA 濃度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 條帶長(zhǎng)度，合格后取100 μL DNA 樣品置于-80 ℃保存。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增與測(cè)序 細(xì)菌16S rRNA 基因的高變區(qū)V3-V4 用引物對(duì)338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCA GCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），以及內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔（ITS）真菌基因區(qū)域用引物對(duì)ITS1F（5'-CTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和2043R（5-GCT GCGTTCTTCATCGATGC-3'）進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR 反應(yīng)條件：98 ℃2 min；98 ℃15 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，29 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度及片段完整性。

合并純化的擴(kuò)增子，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案在Illumina Nova Seq PE300 平臺(tái)上通過(guò)配對(duì)末端測(cè)序進(jìn)行分析。

1.2.4 酒醅揮發(fā)性代謝物的提取與檢測(cè) 稱(chēng)取3 g 酒醅樣品于頂空瓶中，加入2 g NaCl，20 μL 內(nèi)標(biāo)物（乙酸正戊酯），50 ℃平衡5 min，插入50 μm/30 μm VAB/CAR/PDMS 固相微萃取頭，萃取45 min，解析3.5 min[12]。

氣相色譜條件：DB-WAX 毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣；升溫程序：起始溫度50 ℃，維持2 min，然后以4 ℃/min 升溫至230 ℃，維持5 min；氦氣以1 mL/min 的恒定流速作柱載氣。

質(zhì)譜條件：電子電離源（Electron ionization，EI），電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度100 ℃，恒壓10 Pa，全掃描。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 使用fastp（version 0.20.0）軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控[13]，使用FLASH[14]（version 1.2.7）軟件進(jìn)行拼接。使用UPARSE[15]軟件（version 7.1），根據(jù)97%[16]的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU 聚類(lèi)并剔除嵌合體。利用RDP classifier[17]（version 2.2）對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋。隨機(jī)森林模型的構(gòu)建使用R 軟件（v.3.6.1）random-Forest 包。使用igraph R 包（v.1.2.6）構(gòu)建共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)。使用PICRUSt2 軟件包，基于16S rRNA序列和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)不同樣本進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。PLS-DA 用于建立模型，使用SIMCA-P 13 軟件區(qū)分樣品和揮發(fā)性代謝物。使用clusterProfiler 包進(jìn)行富集分析，使用pathview 包進(jìn)行代謝途徑整合和可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

采用高通量測(cè)序技術(shù)分析發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組微生物群落結(jié)構(gòu)較空白組出現(xiàn)較大改變。細(xì)菌群落的變化如圖2a 所示，發(fā)酵第8 天，空白組的優(yōu)勢(shì)微生物為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter），而試驗(yàn)組細(xì)菌群落幾乎完全被乳酸桿菌屬占據(jù)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，試驗(yàn)組與空白組的乳酸桿菌屬均呈現(xiàn)不同程度的下降，空白組中的醋酸桿菌屬在發(fā)酵過(guò)程中持續(xù)存在并保持一定的相對(duì)豐度，而試驗(yàn)組中醋酸桿菌的相對(duì)豐度始終很低。此外，在發(fā)酵過(guò)程中類(lèi)芽孢桿菌屬（Paenibacillus）在試驗(yàn)組的相對(duì)豐度也低于空白組。真菌群落的變化如圖2b 所示，空白組未分類(lèi)曲霉菌科（unclassified_f_Aspergillaceae）的相對(duì)豐度在第8 天急劇下降，曲霉屬（Aspergillus）的相對(duì)豐度迅速上升，之后的發(fā)酵過(guò)程中，其相對(duì)豐度在小范圍內(nèi)波動(dòng)。而試驗(yàn)組中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行未分類(lèi)曲霉科仍保持較高的相對(duì)豐度。此外，較空白組而言，發(fā)酵過(guò)程中酵母屬（Saccharomyces）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、未分類(lèi)曲霉科的相對(duì)豐度明顯增高，而曲霉屬、伊薩酵母屬（Issatchenkia）的相對(duì)豐度明顯降低。因此，釀酒酵母的生物擾動(dòng)改變了較多微生物的相對(duì)豐度。這是由于微生物間存在多種互作關(guān)系[18]，生物擾動(dòng)改變了群落中微生物間原有的關(guān)系，導(dǎo)致部分微生物的生長(zhǎng)受到群落中其它微生物的抑制或促進(jìn)，進(jìn)而使發(fā)酵過(guò)程中部分微生物的相對(duì)豐度發(fā)生較大改變。

圖2 屬水平上試驗(yàn)組與空白組細(xì)菌（a）、真菌（b）群落組成變化Fig. 2 Changes in bacterial（a）and fungal（b）community composition between the experimental group and the blank group at the genus level

為進(jìn)一步探究試驗(yàn)組與空白組間微生物群落的差異，基于隨機(jī)森林機(jī)械學(xué)習(xí)算法對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)預(yù)測(cè)。如圖3a，3b 所示，試驗(yàn)組與空白組細(xì)菌群落和真菌群落在屬水平上具有顯著的差異。如圖3c，3d 所示該模型預(yù)測(cè)了對(duì)試驗(yàn)組與空白組分類(lèi)具有重要貢獻(xiàn)的微生物，并依據(jù)其重要性對(duì)其進(jìn)行排序。為保證預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，基于十折交叉驗(yàn)證對(duì)該模型進(jìn)行檢驗(yàn)，其結(jié)果如圖3e，3f 所示，細(xì)菌群落重要性排名前5 和真菌群落重要性排名前31 的微生物預(yù)測(cè)結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性。依據(jù)其重要性值，篩選細(xì)菌群落排名前5，真菌群落排名前15 的微生物作為生物標(biāo)志物，即：醋酸桿菌屬、湖沉積桿菌屬（Limnobacte）、類(lèi)芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）可作為細(xì)菌群落的標(biāo)志微生物。酵母屬、梗孢酵母屬（Sterigmatomyces）、節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）等15 種真菌可作為真菌群落的生物標(biāo)志物。這些生物標(biāo)志物的相對(duì)豐度在試驗(yàn)組和空白組中具有較大的差異，其對(duì)試驗(yàn)組與空白組的分類(lèi)具有重要貢獻(xiàn)，因此它可反映釀酒酵母對(duì)酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。生物標(biāo)志物中較多屬于酵母菌目（Saccharomycetales）和曲霉科（Aspergillaceae），酵母菌目能夠參與底物的糖化、酯類(lèi)物質(zhì)的合成以及酒精發(fā)酵[19-20]，而曲霉能夠產(chǎn)生廣泛的水解酶，用于淀粉糖化、蛋白質(zhì)水解和類(lèi)黃酮的形成[21-22]，進(jìn)而產(chǎn)生大量的次生代謝物。釀酒酵母在改變酒醅微生物組成的同時(shí)，也可能導(dǎo)致微生物群落代謝的改變。

圖3 基于隨機(jī)森林分析的細(xì)菌群落（a）和真菌群落（b）的樣本分布圖、細(xì)菌群落（c）和真菌群落（d）的重要性特征圖、細(xì)菌群落（e）和真菌群落（f）預(yù)測(cè)結(jié)果的十折交叉驗(yàn)Fig. 3 Sample distribution map of bacterial community（a）and fungal community（b）based on random forest analysis，importance map of bacterial community（c）and fungal community（d），10-fold cross-validation of bacterial community（e）and fungal community（f）prediction results

2.2 釀酒酵母對(duì)酒醅微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的影響

部分物種的變化在一定程度上影響整個(gè)微生物群落。為研究釀酒酵母對(duì)發(fā)酵過(guò)程中微生物間互作以及群落穩(wěn)定性的影響，構(gòu)建試驗(yàn)組與空白組的共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)模型，計(jì)算模型的拓?fù)湫再|(zhì)。如圖4a，4b 所示，空白組共網(wǎng)絡(luò)模型中，共有215 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 868 條邊，正相關(guān)占比76.71%，負(fù)相關(guān)占比23.29%。試驗(yàn)組的微生物共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)共有201 個(gè)節(jié)點(diǎn)，2 263 條邊，正相關(guān)比例占85.64%，負(fù)相關(guān)占比14.36%。釀酒酵母的擾動(dòng)導(dǎo)致共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)模型中的伽瑪變形桿菌綱（Gammaproteobacteria）和酵母菌綱（Saccharomycetes）、桿菌綱（Bacilli）所占的比例增加，而傘菌綱（Agaricomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）的比例下降，這說(shuō)明共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)模型中組成成分發(fā)生改變。試驗(yàn)組的邊數(shù)、正相關(guān)性比例，平均度、平均加權(quán)度、圖密度、平均聚類(lèi)系數(shù)均大于空白組；負(fù)相關(guān)比例、網(wǎng)絡(luò)直徑、模塊化、平均路徑長(zhǎng)度試驗(yàn)組均小于空白組。這些結(jié)果說(shuō)明試驗(yàn)組微生物群落間的相互關(guān)系更加復(fù)雜，網(wǎng)絡(luò)中微生物被共享程度更高，種間相互作用的傳遞性更強(qiáng)。綜上，試驗(yàn)組微生物群落的復(fù)雜程度高于空白組，這表明當(dāng)群落中的菌受到外部影響時(shí)，試驗(yàn)組能夠更有效、快速地將這些影響傳遞至其它生物。這些性質(zhì)導(dǎo)致試驗(yàn)組的微生物群落生長(zhǎng)、繁殖、代謝更加旺盛，更有利于底物的轉(zhuǎn)化與利用[23]。然而當(dāng)酒醅發(fā)酵環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，這種因環(huán)境變化導(dǎo)致的影響會(huì)在復(fù)雜度更高的試驗(yàn)組中更快地傳遞，造成更大的影響[24]，因此，試驗(yàn)組的微生物群落穩(wěn)定性相對(duì)空白組更低。綜上所述，釀酒酵母造成的擾動(dòng)促進(jìn)了酒醅微生物在發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)和代謝，而降低了其應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的能力。

圖4 空白組（a）與試驗(yàn)組（b）的共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)分析Fig. 4 Co-occurrence network analysis of blank group（a）and experimental group（b）

2.3 釀酒酵母對(duì)酒醅中揮發(fā)性代謝物的影響

采用HS-SPME-GC-MS 在酒醅中共檢出65種揮發(fā)性代謝物。如圖5 所示，乙酸乙酯、乙酸、正己酸乙酯、己酸、異戊醇、苯乙醇在試驗(yàn)組和空白組中均具有較高的濃度。這些揮發(fā)性代謝物，在第0 天的濃度較低，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，其濃度均逐漸增大，絕大多數(shù)揮發(fā)性代謝物在第23 天達(dá)到最高濃度。此外，乙酸乙酯、乳酸、異戊醇、苯乙醇、辛酸乙酯、十六酸乙酯、2，3-丁二醇等物質(zhì)在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)組的濃度均高于空白組。這些揮發(fā)性代謝物能夠賦予酒體的香氣，對(duì)濃香型酒體風(fēng)味的形成具有較大貢獻(xiàn)[25]。綜上，釀酒酵母的生物擾動(dòng)在導(dǎo)致酒醅中較多揮發(fā)性代謝物的濃度增加的同時(shí)，也會(huì)影響白酒酒體中部分呈香物質(zhì)的含量。

圖5 發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化Fig. 5 Changes of volatile flavor compounds during fermentation

為進(jìn)一步研究釀酒酵母對(duì)揮發(fā)性代謝物的影響，對(duì)試驗(yàn)組和空白組發(fā)酵過(guò)程中酒醅揮發(fā)性代謝物組分進(jìn)行PLS-DA 分析，如圖6a 所示。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，空白組與試驗(yàn)組樣本點(diǎn)的距離逐漸增加，即糟醅中揮發(fā)性代謝物的組成差異逐漸增大。這說(shuō)明試驗(yàn)組與空白組兩個(gè)不同的微生物群落發(fā)生不同的代謝過(guò)程，隨著發(fā)酵的進(jìn)行兩組的揮發(fā)性代謝物的差異進(jìn)一步擴(kuò)大。此外，基于VIP值計(jì)算試驗(yàn)組與空白組揮發(fā)性代謝物的差異，結(jié)果如圖6b 所示，試驗(yàn)組與空白組酒醅中乙醛、異戊醇、對(duì)甲苯酚、苯乙醇等18 種揮發(fā)性代謝物存在較大差異（VIP>1）。這些差異代謝物絕大多數(shù)是酯類(lèi)和醇類(lèi)，是濃香型白酒中重要的香氣物質(zhì)[25]。這些酒醅中重要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量及比例是決定酒醅質(zhì)量的關(guān)鍵，在一定程度上會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)組和空白組酒醅的品質(zhì)差異。

圖6 發(fā)酵過(guò)程酒醅揮發(fā)性代謝物差異分析Fig. 6 Differential analysis of volatile metabolites in fermented grains during fermentation

2.4 差異代謝物與生物標(biāo)志物的關(guān)系

酒醅中微生物主導(dǎo)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生。為探究導(dǎo)致試驗(yàn)組與空白組間差異代謝物產(chǎn)生的生物因素，構(gòu)建差異代謝物與生物標(biāo)志物的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，如圖7 所示。在相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)越大表示該節(jié)點(diǎn)有較高的度，即有更多的節(jié)點(diǎn)與之相連。對(duì)甲苯酚、乙醛、乙酸、糠醛、乙酸正丁酯具有較高的度，這些物質(zhì)與較多的微生物存在顯著的相關(guān)性，這說(shuō)明代謝物與多種微生物有關(guān)。曲霉屬與乙酸和糠醇呈現(xiàn)極強(qiáng)的正相關(guān)，曲霉屬能夠產(chǎn)生淀粉水解酶，產(chǎn)生的葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑后生成酸類(lèi)和醇類(lèi)[26]，這一結(jié)果可能與曲霉菌屬的水解糖化功能有關(guān)。醋酸桿菌屬和乳酸桿菌屬分別與異戊醇、癸酸乙酯、（+）-3-甲基-2-丁醇、乙酸正丁酯呈顯著負(fù)相關(guān)，這兩種微生物是濃香白酒酒醅中重要的產(chǎn)酸細(xì)菌。乳酸桿菌屬和醋酸菌屬產(chǎn)生的酸類(lèi)物質(zhì)一方面能夠作為白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，另一方面也能夠作為其它風(fēng)味物質(zhì)的前體物[27-28]。然而，這些酸類(lèi)物質(zhì)在一定程度上也影響其它微生物的生長(zhǎng)和代謝[29]。例如醋酸能夠抑制發(fā)酵過(guò)程中微生物的生長(zhǎng)，并改變?nèi)郝浣M成[30]。除產(chǎn)生酸類(lèi)物質(zhì)外，乳酸桿菌屬還能夠產(chǎn)生細(xì)菌屬以拮抗其它微生物[31]。因此，乳桿菌屬和醋酸桿菌屬不僅能夠直接參與風(fēng)味物質(zhì)代謝，還能通過(guò)產(chǎn)生酸類(lèi)物質(zhì)和細(xì)菌素間接影響微生物群落對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的代謝。

圖7 差異揮發(fā)性代謝物與生物標(biāo)志物的相關(guān)性Fig. 7 Correlation of differentially volatile metabolites with biomarkers

2.5 釀酒酵母對(duì)酒醅中微生物群落潛在功能的影響

為研究釀酒酵母對(duì)糟醅中微生物組代謝及功能的擾動(dòng)，基于PICRUST2 對(duì)試驗(yàn)組和空白組酒醅中微生物群落的功能基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。此外，對(duì)預(yù)測(cè)得到的試驗(yàn)組與空白組基因進(jìn)行負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)，如圖8 所示，共出現(xiàn)180 個(gè)上調(diào)基因和46 個(gè)下調(diào)基因。結(jié)果說(shuō)明試驗(yàn)組與空白組相比，180 個(gè)功能基因的豐度顯著增加，46 個(gè)功能基因豐度顯著降低。為進(jìn)一步研究上調(diào)與下調(diào)基因的功能，基于KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)180 個(gè)上調(diào)基因和46 個(gè)下調(diào)基因進(jìn)行通路富集，以明確空白組與試驗(yàn)組間的功能差異，如圖9 所示。在上調(diào)基因所富集的通路中，甲烷代謝，多環(huán)芳香烴降解，不同環(huán)境中的微生物代謝，芳香族化合物的降解，乙苯降解，C5-支鏈二元酸代謝，生物膜形成，氰基氨基酸代謝，吩嗪生物合成，硫代謝，碳代謝，硒化合物代謝，氨基苯甲酸酯降的富集結(jié)果顯著（P<0.05）。在下調(diào)基因富集的結(jié)果中，僅有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、新生霉素生物合成、倍半萜和三萜生物合成、乙苯降解的富集結(jié)果顯著（P<0.05）。這些結(jié)果說(shuō)明釀酒酵母能夠?qū)е戮契⑸锶郝?3 條功能通路增強(qiáng)，而僅4 條功能通路減弱。這些增強(qiáng)的功能多數(shù)與物質(zhì)的代謝有關(guān)，這將有利于微生物群落對(duì)底物的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)酒醅中代謝物的積累。

圖8 試驗(yàn)組和空白組基因差異分析火山圖和基因數(shù)量柱狀圖Fig. 8 Volcano plot and histogram of gene number for gene difference analysis between experimental group and blank group

圖9 上調(diào)基因（a）與下調(diào)基因（b）KEGG 功能富集Fig. 9 Functional enrichment of up-regulated（a）genes and down-regulated genes（b）KEGG

3 結(jié)論

分別研究了釀酒酵母對(duì)酒醅微的生物群落組成、微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)、揮發(fā)性代謝物、功能的影響。結(jié)果顯示，釀酒酵母導(dǎo)致酒醅發(fā)酵過(guò)程中微生物群落組成發(fā)生改變，其中5 種細(xì)菌和15 種真菌是區(qū)分試驗(yàn)組與空白組的生物標(biāo)志物。釀酒酵母的擾動(dòng)效應(yīng)增加了微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，使得其在適宜條件下具有更強(qiáng)的生命活動(dòng)，而降低了在惡劣條件下的穩(wěn)定性。試驗(yàn)組與空白組揮發(fā)性代謝物的組成差異隨發(fā)酵的進(jìn)行逐漸增大，兩者間共有18 種差異代謝物。此外，絕大多數(shù)生物標(biāo)志物與差異代謝物顯著相關(guān)?；诠δ茴A(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)釀酒酵母的擾動(dòng)導(dǎo)致微生物群落共出現(xiàn)180 個(gè)上調(diào)基因和46 個(gè)下調(diào)基因，并且上調(diào)基因大多數(shù)與物質(zhì)代謝相關(guān)。這些結(jié)果為優(yōu)化酒醅發(fā)酵過(guò)程，為提高酒醅質(zhì)量提供理論基礎(chǔ)。